FX1

BCL6 (IC50 ~35 μM)

将 DLBCL 细胞暴露于 50 μM FX1 30 分钟。所有三个 BCL6 靶基因在 FX1 的 BCOR 和 SMRT 募集中均显着减少，但在阴性对照基因座上则没有。 BCL6 阴性 DLBCL 细胞系不受 FX1 影响，在这些位点几乎没有 SMRT。当 FX1 和 79-6 在用 50 μM FX1 处理 6 小时后的 DLBCL 细胞中进行定量 ChIP 测定时，很明显，FX1 在阻止 BCL6 与 SMRT 结合方面比 79-6 具有更大的效力。 FX1 暴露于 DLBCL 细胞后的四个连续时间点收集 mRNA。在两个独立的 DLBCL 细胞系中，与媒介物相比，FX1 几乎总是显着诱导这些基因的去抑制[1]。

FX1 治疗小鼠的脾脏在宏观上与载体对照小鼠没有区别。根据流式细胞术测定，TFX1 对 B 细胞的总体丰度没有影响。当暴露于 FX1 时，GC B 细胞 (GL7+FAS+B220+) 显着减少。 IHC 分析脾脏的结构。用 B220 抗体染色后可以看到正常的 B 细胞滤泡结构，但用 GC 特异性 B 细胞标记物花生凝集素染色后可以看到 GC 的显着损失。半衰期被认为是 12 小时左右。最后，确定FX1是否会对小鼠产生毒性作用。与媒介物相比，用 FX1 处理的小鼠的肺、消化道、心脏、肾脏、肝脏、脾脏和骨髓的 H&E 染色切片没有显示出毒性、炎症或感染的迹象[1]。

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FX1表型在体内复制BCL6 BTB结构域表型。[1]
BCL6 BTB协同抑制因子结合位点的突变导致正常的B细胞发育，但在小鼠中GC形成的严重丧失，在T细胞依赖免疫后仅形成少量残留的GC（例如，如图3A和ref. 22所示）。为了确定FX1是否能够再现这种表型，研究人员用羊红细胞（一种T细胞依赖性抗原）免疫C57BL/6小鼠，然后用每日剂量的80 mg/kg或载体FX1治疗它们。治疗10天后（GCs正常达到峰值），对小鼠实施安乐死并取脾。fx1处理小鼠的脾脏在宏观上与对照没有区别（图3A）。正如预期的那样，流式细胞术测量的总B细胞丰度不受FX1的影响（图3B）。相反，与BCL6 BTB突变表型相似，暴露于FX1后，GC B细胞（GL7+FAS+B220+）显著减少(P < 0.0001；图3 c)。研究人员还通过免疫组化检查了脾结构。B220抗体染色显示正常的B细胞滤泡结构，而GC B细胞特异性标记物花生凝集素染色显示GC严重缺失（图3D）。这种缺陷进一步表现为GCs数量的显著减少（P = 0.0001）和GCs占据的脾表面积(2.4倍；P < 0.001)，与车辆对照组相比（图3D）。通过Ki-67染色也可以明显看到GC B细胞增殖的丧失，这表明FX1-处理小鼠中Ki-67+ GC结构的丧失（图3D）。

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FX1在体外和体内均能有效抑制bcl6依赖性GCB-DLBCLs。[1]
FX1的目的是杀死bcl6依赖性肿瘤。BCL6在dlbcl的GCB类中高表达。根据是否受BCL6敲低或抑制的影响，先前已将DLBCL细胞系分为BCL6依赖型或独立型（34）。为了评估FX1抑制dlbcl的能力，研究人员用不同浓度的FX1处理了一组GCB-DLBCL细胞系（8个依赖于BCL6, 4个不依赖于BCL6） 48小时，并确定了与载体处理细胞（GI50）相比，抑制50%生长所需的化合物浓度。FX1对bcl6依赖性dlbcl表现出选择性作用，平均GI50值约为36 μM，而在bcl6非依赖性dlbcl中无法确定GI50值，因为在高于125 μM的药物浓度下，它们的生长抑制甚至达不到50%（图4A）。值得注意的是，一些被定义为BCL6不依赖型的DLBCL细胞系仍然对BCL6抑制剂保持一定程度的反应性（34）。BCL6依赖性丧失发生的机制尚不清楚，尽管在某些情况下（例如，托莱多细胞），这伴随着BCL6表达几乎完全丧失（补充图4A）。[1]

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研究人员接下来希望在体内评估FX1的抗淋巴瘤活性。然而，研究人员首先评估了该化合物的基本药代动力学。16只移植SUDHL-6的SCID小鼠经腹腔注射FX1 50 mg/kg，连续采集血清和组织标本。观察FX1维持50 μM的血清浓度10小时（补充图4B）。半衰期估计约为12小时（补充图4B）。从这些小鼠的肿瘤组织中提取mRNA，评估BCL6靶基因CD69、CDKN1A和CXCR4的丰度。靶基因的最大诱导发生在4-6小时，随后下降（补充图4C）。最后，研究人员评估了FX1是否会对小鼠产生毒性作用。BCL6 BTB突变小鼠没有器官功能障碍或疾病，因此研究人员不会期望靶毒性（22）。一组10只BALB/c小鼠，每天给药100 mg/kg/d FX1治疗10天，之后处死动物，分析器官损伤的组织学证据（补充图4D和补充表2）。与对照组相比，FX1治疗小鼠的肺、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、脾脏和固定器官骨髓的h&e染色切片未见明显的毒性、炎症或感染迹象。研究人员还检测了fx1处理小鼠的外周血计数和血清化学，所有这些参数都保持在正常范围内（补充表2）。

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为了确定FX1与79-6在体内的疗效，研究人员首先在SCID小鼠中使用OCI-Ly7 DLBCL细胞建立了DLBCL异种移植物。当肿瘤体积达到约100 mm3时，开始使用每日25 mg/kg或50 mg/kg的FX1或79-6或载药。当对照物达到最大允许肿瘤负荷时（第10天）处死动物。引人注目的是，FX1引起dlbcl的深刻而显著的抑制(P = 0.001；图4B)，确实不仅阻止了异种移植物的生长，而且还使这些肿瘤从其初始体积缩小。较低的25 mg/kg剂量已达到最大效果。相比之下，79-6在这些剂量下表现出更弱的抗肿瘤活性（25 mg/kg时肿瘤生长减少42%，50 mg/kg时肿瘤生长减少64%）（图4C）。TUNEL和Ki-67染色显示，FX1也比79-6诱导更多的细胞凋亡和生长停滞（补充图4E）。在使用SUDHL-6 DLBCL细胞的第二种异种移植模型中，FX1的这种强效剂量依赖性抗淋巴瘤作用得到了证实（补充图4、F和G）。为了证实抗肿瘤作用是淋巴瘤细胞自主的，而不是由于对宿主的影响，研究人员还测试了FX1对不依赖bcl6的托莱多异种移植物的作用。暴露于50mg /kg FX1对这些异种移植物没有影响（补充图4，H-J）。[1]
为了验证ABC-DLBCL在体内也可以被FX1靶向，研究人员使用悬浮在Matrigel s.c.中的HBL-1 ABC-DLBCL细胞系在NOD/SCID小鼠中产生异种移植物。当肿瘤达到约100 mm3时，研究人员用每天50 mg/kg的FX1剂量治疗小鼠。治疗10天后，研究人员观察到，暴露于50 mg/kg FX1的小鼠的肿瘤体积减少了约70%（图5、B和C）。研究人员还观察到，与用载药治疗的肿瘤相比，FX1治疗的肿瘤中TUNEL染色的凋亡细胞从2.5%增加到10%（图5D）。［1］

MST测量。[1]
重组BCL6 BTB使用RED-NHS标记试剂盒进行标记。根据制造商的说明，在随附的标记缓冲液中使用浓度为20 μM的蛋白质（摩尔染料/蛋白质比为2:1），在室温下进行标记反应30分钟。用用PBS缓冲液（PBS， 0.005%吐温-80）平衡的染料去除柱去除未反应的染料。标记/蛋白比采用650 nm光度法和Bradford试剂测定。因此，比率通常达到0.8。标记的BCL6 BTB用添加0.05%吐温-80的PBS缓冲液调整至400 nM。将SMRT、79-6和FX1溶解在添加0.05% Tween-80和10% DMSO的PBS缓冲液中，在相同的缓冲液中制备16个1:1的稀释液，得到的配体浓度从19 pM到625 μM不等。对于热泳，每种配体稀释剂与1体积标记的BCL6 BTB混合，使荧光标记的BCL6 BTB最终浓度为200 nM，最终配体浓度为9 pM至312 nM，最终浓度为5% DMSO最终浓度。孵育10分钟后，将每种溶液约4 μl填充到Monolith NT标准处理毛细血管中。使用Monolith NT.115仪器在温度为25°C的条件下，分别以5秒/30秒/5秒激光开/关时间测量热泳动。以90%的发光二极管（LED）功率和40%的MST功率调节仪器参数。利用热电泳信号对3个独立实验的数据进行分析。

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核磁共振实验。[1]
所有核磁共振实验均在30°C下使用配备低温探针的布鲁克600 MHz光谱仪进行记录。BCL6 BTB结构域的分配基于200 μM 13C、15N BCL6的HNCA和HNCOCA实验记录以及先前发表的分配。BCL6 BTB侧槽处的Fo-Fc电子密度图绘制为2.0 σ水平。由于占用率不足，综合体中1085的整体结构改进无法可靠地完成。

使用 BCL6、SMRT、BCOR 或 IgG 对照抗体，在 DLBCL 细胞中暴露于 FX1（黑条）或媒介物（白条）的 SUDHL-6 细胞中进行定量 ChIP，以富集细胞中已知的 BCL6 结合位点。 CD69、CXCR4 和 DUSP5 基因座，以及阴性对照区。

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FX1联合阿霉素。[1]
对于联合治疗，我们将细胞暴露于每种药物单独或以恒定比例组合的剂量曲线中，并用CellTiter-Blue测定细胞活力。为了比较不同的处理方案，我们将细胞分为三个重复处理：FX1和阿霉素同时处理，细胞处理48小时；FX1，第一次和24小时后加阿霉素治疗48小时；先用阿霉素治疗，24小时后加FX1治疗48小时。然后利用CompuSyn软件绘制剂量效应曲线，计算剂量减少指数。

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原代细胞处理。[1]
将淋巴结活检的单细胞悬液解冻后，在添加20%人血清、谷氨酰胺（2X）、甘氨酸（5mm）、青霉素和链霉素的Advanced RPMI中重悬。台盼蓝计数法测定细胞数量和活力。在添加10%牛血清和青霉素、链霉素的DMEM中培养的HK细胞（2000 rad）在37℃下粘附在组织培养板上。抽吸培养基，将患者样品镀在HK喂料层上。将样品暴露于FX1或载体中48小时，并通过用PerCP cy5.5偶联抗cd3和fitc偶联抗cd20以及膜联蛋白V和DAPI染色分析细胞活力。膜联蛋白V/DAPI双阴性的CD20+CD3 -细胞被认为是活的恶性B细胞。主要样本按Hans IHC标准分类。

携带SUDHL-6异种移植瘤的SCID小鼠
50 mg/kg
腹腔注射

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将6至8周龄的雄性SCID小鼠皮下注射10~7代低代人SUDHL-6、OCI-Ly7或Toledo细胞。或者，将6至8周龄的NOD/SCID小鼠注射低代HBL-1细胞。当肿瘤达到可触及的大小（约100 mm³）时，将小鼠随机分配到治疗组，并腹腔注射25或50 mg/kg/d的药物。药物用PEG-400溶解，并储存于-20°C直至使用。每周使用电子游标卡尺测量肿瘤大小3次，并根据以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm³）=（最小直径² × 最大直径）/2。数据以均值±标准误表示，采用Mann-Whitney检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。[1]

[1]. Rationally designed BCL6 inhibitors target activated B cell diffuse large B cell lymphoma. J Clin Invest. 2016 Sep 1; 126(9): 3351–3362.

FX1 属于吲哚酮类化合物，其结构为 5-氯吲哚酮，其中 3 位亚甲基氢被 N-(2-羧乙基)罗丹宁-5-亚基取代。它具有抗肿瘤活性。FX1 属于吲哚酮类化合物、有机氯化合物、噻唑烷酮类化合物和单羧酸类化合物。其功能与 3-亚甲基吲哚酮和罗丹宁类似。

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弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL) 起源于增殖的 B 细胞经历生发中心反应的不同阶段。在活化 B 细胞 DLBCL (ABC-DLBCL) 中，这是一类对现有疗法反应不佳的 DLBCL，染色体易位和扩增导致 B 细胞淋巴瘤 6 (BCL6) 癌基因的组成型表达。 BCL6在维持这些淋巴瘤中的作用尚未得到研究。在此，我们设计了对BCL6具有比其内源性辅阻遏物配体更高亲和力的小分子抑制剂，以评估其靶向ABC-DLBCL的治疗效果。我们采用一种名为SILCS的计算机辅助药物设计功能基团映射方法，构建了一种特异性BCL6抑制剂FX1。FX1的效力比内源性辅阻遏物高10倍，并能结合BCL6侧沟的关键区域。FX1破坏了BCL6抑制复合物的形成，重新激活了BCL6靶基因，并模拟了表达带有辅阻遏物结合位点突变的BCL6基因工程小鼠的表型。低剂量FX1可诱导携带DLBCL异种移植瘤的小鼠体内已建立的肿瘤消退。此外，FX1在体外和体内均能抑制ABC-DLBCL细胞，并在离体实验中抑制了原代人ABC-DLBCL标本的增殖。这些研究结果表明，ABC-DLBCL 是一种 BCL6 依赖性疾病，可通过合理设计的、亲和力高于天然 BCL6 配体的抑制剂进行靶向治疗。[1]

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在许多细胞系中，对 BCL6 抑制剂的反应似乎与 BCL6 水平相关，即表达 BCL6 水平较高的细胞系需要更高剂量的抑制剂才能抑制。例如，OCI-Ly1 细胞表达高水平的 BCL6，因此需要比表达 BCL6 水平较低的 SUDHL-6 和 DOHH-2 细胞更多的化合物。然而，这条规则存在许多例外，这可能是由于不同的体细胞突变组合和其他可能改变 BCL6 功能的因素所致。对原发性 DLBCL 的研究受到限制，因为这些肿瘤无法在体外培养足够长的时间以充分评估 FX1 的治疗效果。然而，我们对原代标本的研究证实了细胞系数据，表明GCB型和ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞依赖于BCL6，并且对BCL6抑制剂敏感。此外，FX1可以增强GCB型和ABC型DLBCL对细胞毒性疗法的反应。因此，BCL6靶向疗法与标准抗淋巴瘤药物联合应用可能产生更优的临床疗效，这对于更容易出现化疗耐药性的高危患者尤为重要。因此，我们的研究将可能对BCL6靶向疗法有反应的淋巴瘤范围扩大到包括GCB型和ABC型DLBCL。鉴于ABC型DLBCL的预后较差，这一点尤为重要。我们期待利用SILCS进一步优化FX1并生成其他化学骨架，从而获得能够使这些难治性患者获益的化合物。[1]

C14H9CLN2O4S2

368.8153

367.969

C, 45.59; H, 2.46; Cl, 9.61; N, 7.60; O, 17.35; S, 17.39

1426138-42-2

135886621

Red solid powder

1.4

148

2

6

4

23

808

0

0

JYBGCTWNOMSQJY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H9ClN2O4S2/c15-6-1-2-8-7(5-6)10(12(20)16-8)11-13(21)17(14(22)23-11)4-3-9(18)19/h1-2,5,21H,3-4H2,(H,18,19)

3-[5-(5-chloro-2-oxoindol-3-yl)-4-hydroxy-2-sulfanylidene-1,3-thiazol-3-yl]propanoic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (2.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再将50 μL Tween-80+加入到上述溶液中，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。