GNE-6776

USP7
The target of GNE-6776 is Ubiquitin-Specific Peptidase 7 (USP7), a deubiquitinase enzyme. It non-covalently binds to USP7 at a site 12 Å away from the catalytic cysteine, interfering with ubiquitin binding to USP7 and thereby inhibiting USP7's deubiquitinase activity. Specific IC50, Ki, or EC50 values for the inhibition of USP7 by GNE-6776 are not explicitly provided in the referenced literature [1]

在15μM时，GNE-6776显著抑制USP7。GNE-6776[1]是一种对内源性细胞去泛素酶和重组酶具有高度选择性的USP7抑制剂[1].
GNE-6776诱导肿瘤细胞死亡，并增强化疗药物和靶向化合物（包括PIM激酶抑制剂）的细胞毒性。结构研究表明，GNE-6640和GNE-6776非共价靶向距离催化半胱氨酸12Å的USP7。这些化合物减弱泛素结合，从而抑制USP7去泛素酶活性。GNE-6640和GNE-6776与酸性残基相互作用，酸性残基介导与泛素Lys48侧链的氢键相互作用，表明USP7优先与具有游离Lys48侧面链的泛素部分相互作用并切割泛素部分。

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1. GNE-6776在体外可诱导肿瘤细胞死亡。尽管未详细说明具体的肿瘤细胞系及定量数据（如不同浓度下的细胞存活率），但该化合物对肿瘤细胞具有细胞毒性作用，这与其抑制USP7活性相关[1]
2. GNE-6776在体外可增强化疗药物和靶向药物（包括PIM激酶抑制剂）的细胞毒性。与单独使用GNE-6776或单独使用上述药物相比，联合使用时对肿瘤细胞存活的抑制效果更显著，体现出协同作用[1]
3. GNE-6776可减弱泛素与USP7的结合，从而抑制USP7的去泛素化酶活性。结构研究证实，GNE-6776与USP7中的酸性氨基酸残基相互作用，而这些残基负责介导USP7与泛素Lys48侧链的氢键结合。这种相互作用破坏了USP7与泛素的结合，尤其影响USP7对Lys48连接的泛素链的偏好性[1]
4. 在体外实验中，GNE-6776可延长USP7对Lys48连接的泛素链的解聚动力学（相较于Lys63连接的泛素链）。通过构建具有差异性近端和远端同位素标记的双泛素链，并利用核磁共振（NMR）技术检测USP7与这些链的结合情况，证实了这一结果。实验显示，GNE-6776对USP7解聚Lys48连接泛素链的能力抑制更显著[1]

GNE-6776 促进人类异种移植物中的靶向途径调节。尽管仅短暂地达到有效暴露，但 GNE-6776 会导致适度但显着的 EOL-1 异种移植物生长延迟。
鉴于这些抑制剂的有利特性，我们在动物模型中研究了它们的疗效。药效学和药代动力学研究表明，GNE-6776具有口服生物可利用性，并促进人类异种移植物的靶向通路调节（扩展数据图4e-i）。尽管有效的暴露只是暂时的，但GNE-6776引起了EOL-1异种移植物生长的适度但显著的延迟（扩展数据图4j）。开发具有改善药物样性质的USP7抑制剂对于全面评估USP7在体内的抑制作用是必要的。

USP7 enzymatic analysis/USP7酶活分析[1]
使用1 nM USP7和一系列泛素-AMC底物滴定法对全长USP7进行Michaelis-Menten动力学测量。在Tecan Safire2平板读数器上使用Magellan软件确定底物水解的初始速率，并使用GraphPad Prism软件进行非线性回归分析建模动力学参数。标准误差由三个技术重复计算得出。对于使用USP7 D305/E308突变体的研究，样品在由50 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM NaCl、2.5 mM二硫苏糖醇和0.1%（w/v）牛丙种球蛋白组成的缓冲液中反应。用于Michaelis-Menten分析的泛素-Rho110的起始底物浓度为100μM，连续稀释至781 nM。反应在室温下进行1小时，最终酶浓度为100 nM（三个独立的实验，见图表中的符号），在黑色100-μl体积96孔半面积板上进行。通过使用初始速度将数据与线性V0值拟合来计算酶活性，该线性V0值是通过使用485nm的激发和535nm的发射分析切割的Rho-110的荧光信号而测量的

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Deubiquitinase selectivity analysis/去泛素酶选择性分析[1]
重组去泛素酶双泛素质谱裂解试验。如前所述，使用指定浓度的重组去泛素酶、二泛素底物和USP7抑制剂化合物进行MALDI-TOF DUB测定。在泛素的替代底物Ub-Ube2W（Ub-E2）上监测GNE-6640和GNE-6776对UCH1家族成员的抑制效率。

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1. 基于核磁共振（NMR）的USP7-泛素结合实验：为评估GNE-6776对USP7与泛素结合的影响，采用核磁共振波谱技术。首先制备包含USP7（或其相关结构域）和泛素的适宜样品，随后向样品中加入不同浓度的GNE-6776。采集并分析样品的核磁共振谱图，监测USP7与泛素之间相互作用的变化。结果显示，GNE-6776会干扰USP7与泛素的结合，相关核磁共振信号的变化可证明这一点[1]
2. USP7去泛素化酶活性实验：为检测GNE-6776对USP7去泛素化酶活性的抑制作用，构建包含USP7酶、泛素底物（如具有特定连接方式的双泛素链，如Lys48连接或Lys63连接的链）及适宜缓冲液的反应体系。向反应体系中加入不同浓度的GNE-6776，在适宜条件（如特定温度和时间）下孵育。孵育后，采用适宜方法（如凝胶电泳或质谱法）分析反应产物，确定泛素链的解聚程度。实验表明，GNE-6776可抑制USP7的去泛素化酶活性，且对Lys48连接的泛素链解聚的影响更为显著[1]
3. 同位素标记双泛素链结合实验：为研究USP7对不同泛素链连接方式的偏好性及GNE-6776对该偏好性的影响，构建具有差异性近端和远端同位素标记（如¹³C/¹⁵N标记）的双泛素链。将这些标记链（包括Lys48连接和Lys63连接类型）与USP7在存在或不存在GNE-6776的条件下共同孵育，利用核磁共振技术检测并比较USP7与不同标记链的结合情况。该实验证实，USP7优先与具有游离Lys48侧链的泛素片段相互作用，而GNE-6776会减弱这种优先结合作用，导致Lys48连接链的解聚动力学延长[1]

Tumour cell-line panel viability/肿瘤细胞系存活率。[1]
如前所述，在441个细胞系中对GNE-6640和GNE-6641进行了3天的分析，并在185个细胞系的亚群中对GNE-6776、GNE-6640和GNE-641进行了5天的分析26。简而言之，使用三倍稀释法在九点剂量反应中筛选化合物。在加入化合物前24小时将细胞接种到384孔板中。然后将细胞与化合物一起孵育72小时或120小时，然后测定存活率。检测采用生物法，一式三份。在整个试验过程中，细胞在RPMI-1640、2.5%FBS（72小时试验）或5%FBS（120小时试验）和2 mM谷氨酰胺中孵育（37°C，5%CO2）。报告的IC50和平均存活率指标如下：IC50是相对于未处理孔的估计抑制率为50%的剂量（即绝对IC50）

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Primary combination screen。[1]
在不存在或存在固定剂量的GNE-6776（0 nm、125 nm、250 nm、500 nm、1000 nm和2000 nm）或GNE-6640（400 nm）的情况下，筛选了一个包含589种按九点剂量反应排列的化合物库。简而言之，将5000个EOL-1细胞接种到384孔板中，24小时后加入化合物。在化合物加入后120小时测定细胞存活率（CellTiter Glo）。拟合曲线，计算IC50和平均存活率指标。IC50是相对于未处理的孔抑制50%的剂量。平均存活率是每个测试剂量下拟合存活率的平均值。平均存活率等于对数剂量/存活率曲线下的面积除以测试剂量的总数。平均存活率值用于扩展数据图6g中描述的分析。所有数据均使用Genedata Screener软件进行拟合

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Primary combination screen analysis。[1]
在EOL-1细胞系中，在DMSO或浓度增加的GNE-6776（100 nM、250 nM、500 nM、1000 nM或2000 nM）或400 nM的GNE-6640存在下，测定了574种具有已知蛋白质或机制靶标的化合物的标准化平均存活率。对于每种化合物，我们评估了USP7抑制剂治疗和DMSO治疗之间的平均存活率差异。对于三种或多种化合物靶向的靶标，我们使用Wilcoxon秩和检验计算了每种浓度USP7抑制剂的高平均存活率差异的富集程度。为了可视化，我们通过取每个目标的−log10（转换后的P值）的平均值来组合所有浓度的结果。

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1. 肿瘤细胞存活率实验：将肿瘤细胞系在标准细胞培养条件（如37°C、5% CO₂）下用适宜培养基培养。将细胞以适宜密度接种到多孔板中，待其贴壁后，向孔中加入不同浓度的GNE-6776，并孵育特定时间（如24-72小时）。在联合用药实验中，将化疗药物或PIM激酶抑制剂与GNE-6776一同加入孔中。孵育结束后，加入细胞存活率检测试剂（如MTT或CCK-8），通过酶标仪测定吸光度，计算细胞存活率。实验证实，GNE-6776可诱导肿瘤细胞死亡，并增强其他药物的细胞毒性[1]
2. USP7底物蛋白的蛋白质印迹（Western Blot）分析：用不同浓度的GNE-6776处理肿瘤细胞特定时间。处理后收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液裂解细胞，提取总细胞蛋白。测定蛋白浓度后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量蛋白质，并将分离后的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用封闭缓冲液（如5%脱脂牛奶）封闭膜后，将膜与针对USP7底物蛋白（如p53或MDM2）的一抗及内参蛋白（如β-肌动蛋白）在4°C下孵育过夜。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗孵育，最后用增强化学发光（ECL）检测系统显影蛋白条带。该实验结果可反映GNE-6776处理后USP7底物蛋白表达水平的变化，间接证实USP7活性被抑制[1]

免疫缺陷型 CB-17 SCID 小鼠，移植 EOL1 AML 异种肿瘤，12-16 周龄[1]
100 或 200 mg/kg

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DMPK 分析。[1]
体外 DMPK 研究采用标准方案进行。GNE-6776 配制成 0.5% 甲基纤维素/0.2% Tween-80 混悬液，以 200 mg/kg（体重）的剂量通过灌胃法给予 12-16 周龄的雌性 CB-17 SCID 小鼠（每个时间点 n = 3）。DMPK 研究未采用随机分组。给药后 0.5、1、2、4、8 和 24 小时，通过心脏末端穿刺采集血液样本至抗凝管（EDTA）中。澄清的血浆随后转移至新的试管中并速冻。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定GNE-6776血浆浓度。

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体内药效学反应。[1]
在EOL-1 AML异种移植研究中，将500万个细胞悬浮于50:50的HBSS:Matrigel（100 μl）悬液中，皮下接种于12-16周龄的免疫缺陷型CB-17 SCID小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到约285-500 mm³时，将小鼠按体积匹配分组（n = 4）。在MCF7乳腺癌异种移植研究中，将0.36 mg雌激素缓释片通过套管植入6-8周龄的免疫缺陷型nu/nu小鼠体内，植入时间为肿瘤细胞接种前1-3天。将1000万个MCF7-Ser细胞（一种体内优化的MCF7变体）以50:50的HBSS:Matrigel悬浮液（总体积100 μl）原位注射到每只小鼠的2/3乳腺脂肪垫中。当肿瘤体积达到约285至450 mm³时，将小鼠按体积匹配分为若干组（n = 4）。将GNE-6776配制成0.5%甲基纤维素/0.2% Tween-80悬浮液，并在0小时和4小时通过灌胃给予200 mg/kg（体重）的剂量。在首次给药后8小时收集0.5%甲基纤维素/0.2% Tween-80对照组或GNE-6776处理组的样本，并将切除的肿瘤组织用干冰速冻。使用 Qiagen TissueLyser 组织裂解仪，在含有蛋白酶抑制剂和 300 mM NaCl 的 RIPA 缓冲液中裂解肿瘤组织。样品在冰上孵育 15 分钟，然后在 4 °C 下以 20,000 g 离心 10 分钟。使用 Pierce BCA 蛋白定量试剂盒对澄清裂解液中的蛋白水平进行定量，并用样品缓冲液进行浓度标准化。样品进行凝胶电泳，并将蛋白转移至膜上，然后按照上述方法进行蛋白质印迹分析。

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体内疗效研究。[1]
对于 EOL1 AML 异种移植研究，将 12-16 周龄的免疫缺陷型 CB-17 SCID 小鼠（查尔斯河实验室）右侧腹部皮下接种 500 万个细胞，细胞悬液为 50:50 的 HBSS:Matrigel (100 μl)。当肿瘤体积达到一定程度（150–300 mm³）后，将小鼠按肿瘤体积匹配分为若干组（n = 7，平均肿瘤体积约250 mm³）。将GNE-6776配制成0.5%甲基纤维素/0.2% Tween-80的悬浮液，并以100或200 mg kg⁻¹（体重）的剂量，每日灌胃给药一次或两次。每周采集两到三次肿瘤体积、体重和体况数据。所有动物的肿瘤体积均未达到2000 mm³的最大限制。

[1]. USP7 Small-Molecule Inhibitors Interfere With Ubiquitin Binding. Nature. 2017 Oct 26;550(7677):534-538.

泛素系统调控真核生物中重要的细胞过程。泛素以单体或链的形式与底物蛋白连接，泛素修饰的拓扑结构调控底物与特定蛋白的相互作用。因此，泛素化决定了多种底物命运，包括蛋白酶体降解。去泛素化酶从底物上切割泛素，并与多种疾病相关；例如，泛素特异性蛋白酶-7 (USP7) 调控p53肿瘤抑制蛋白和其他对肿瘤细胞存活至关重要的蛋白的稳定性。然而，开发选择性去泛素化酶抑制剂一直极具挑战性，目前尚未解析出小分子抑制剂与去泛素化酶的共晶体结构。本文中，我们利用基于核磁共振的筛选和基于结构的药物设计，描述了选择性USP7抑制剂GNE-6640和GNE-6776的开发。这些化合物可诱导肿瘤细胞死亡，并增强化疗药物和靶向化合物（包括PIM激酶抑制剂）的细胞毒性。结构研究表明，GNE-6640和GNE-6776以非共价方式靶向USP7，其作用位点距离催化半胱氨酸残基12 Å。这些化合物可减弱泛素结合，从而抑制USP7的去泛素化酶活性。GNE-6640和GNE-6776与介导与泛素Lys48侧链氢键相互作用的酸性残基相互作用，提示USP7优先与具有游离Lys48侧链的泛素分子相互作用并切割这些分子。我们通过构建含有不同近端和远端同位素标记的双泛素链，并利用核磁共振技术测量USP7的结合情况，验证了这一假设。这种优先结合延长了 Lys48 连接的泛素链相对于 Lys63 连接的泛素链的解聚动力学。总之，通过减弱泛素结合来抑制 USP7 活性的化合物设计，为开发其他去泛素化酶抑制剂提供了机会，并且可能是一种更广泛适用于抑制需要泛素结合才能发挥完全功能活性的蛋白质的策略。[1]

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本文描述了 GNE-6640 和 GNE-6776，它们是具有结构明确的抑制机制的选择性 USP7 抑制剂。建立严格的筛选流程对于选择和优化靶向抑制剂至关重要。联合研究揭示了 USP7 去泛素化酶活性和 PIM 激酶在调节细胞活力方面此前未被描述的相互作用。 GNE-6640 或 GNE-6776 的共晶结构表明 USP7-D305/E308 与泛素-K48 侧链之间互补的带电相互作用至关重要，我们通过突变分析证实了这一点。值得注意的是，D305G 已被鉴定为急性淋巴细胞白血病患者的体细胞功能缺失突变体²¹。对 USP7 与天然单泛素和差异标记的双泛素结合的 NMR 分析表明，USP7 优先与具有游离 K48 侧链的泛素部分相互作用。有研究提出，某些去泛素化酶无法有效解聚较长的底物结合的 K48 连接链，从而为蛋白酶体靶向多聚泛素化设定了阈值²²；我们的研究证实了这一观点，并提供了一种生物物理机制。许多蛋白质，包括其他去泛素化酶、泛素连接酶、DNA修复和内吞机制以及表观遗传调控因子，其功能依赖于泛素结合²³。开发能够减弱泛素结合的选择性抑制剂是抑制USP7的有效策略。我们的研究证明了该方法的可行性，并且该方法可能在抑制其他类型的泛素结合蛋白方面具有更广泛的应用^[1]。¹泛素系统在真核生物中调节重要的细胞过程中发挥着关键作用。泛素以单体或链的形式与底物蛋白连接，泛素修饰的拓扑结构调节底物与特定蛋白的相互作用，从而决定底物的各种命运，包括蛋白酶体降解。去泛素化酶，例如USP7，能够从底物上切割泛素，并与多种疾病相关^[1]。² USP7 调控 p53 肿瘤抑制蛋白和其他对肿瘤细胞存活至关重要的蛋白质的稳定性，使其成为潜在的癌症治疗靶点。然而，开发选择性去泛素化酶抑制剂一直极具挑战性，在本研究之前，尚未解析出 USP7 与小分子抑制剂的共晶结构 [1]
3.GNE-6776 是通过基于核磁共振的筛选和基于结构的药物设计开发的，同时开发的还有另一种 USP7 抑制剂 GNE-6640。这两种化合物均为选择性 USP7 抑制剂，它们以非共价方式靶向 USP7。GNE-6776 的开发为开发其他去泛素化酶抑制剂提供了契机，并且可能是一种广泛适用于抑制需要泛素结合才能发挥完整功能活性的蛋白质的策略 [1]

C20H20N4O2

348.398404121399

348.15862

2009273-71-4

122531750

White to off-white solid powder

2.7

101Ų

3

5

4

26

467

0

OC1C=CC(=CC=1)C1C(N)=NC=C(C2C=NC(C(NC)=O)=CC=2)C=1CC

UCYSSYGGXOFJKK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H20N4O2/c1-3-15-16(13-6-9-17(23-10-13)20(26)22-2)11-24-19(21)18(15)12-4-7-14(25)8-5-12/h4-11,25H,3H2,1-2H3,(H2,21,24)(H,22,26)

5-[6-amino-4-ethyl-5-(4-hydroxyphenyl)pyridin-3-yl]-N-methylpyridine-2-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 70~100 mg/mL ( 200.91~287.03 mM )
Ethanol : ~2 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。