GNE-6776

USP7

体外活性：高通量筛选和反筛选测定。 USP7 UbA10 时间分辨荧光能量转移 (TR-FRET) 活性测定。 USP7 的潜在抑制剂在以 UbA10 作为底物的基于 TR-FRET 的酶活性测定中被鉴定。 UbA10 是天然存在的泛素前体 Ub52 的片段；它保留了 Ub52 的 10 个氨基酸片段，该片段延伸到泛素 C 末端之外。初步筛选测定是一种新型的基于 TR-FRET 的活性测定，可测量双标记肽底物的全长 USP7 的裂解。该肽的 N 末端带有谷胱甘肽 S-转移酶 (GST)，C 末端带有 8 个组氨酸残基 (GST-UbA10-His)。这些标签分别由抗 GSH-d2（TR-FRET 受体）和抗 His-铕（TR-FRET 供体）检测。 USP7 在泛素 C 末端对该底物进行切割，导致这两个标签分离并丢失 TR-FRET 信号。将化合物分配到 1,536 孔黑色板（MaKO，Aurora Microplates）中，然后加入 2 μl 全长重组 USP7 的测定缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、0.1% Prionex (Pentapharm)、0.01% Triton X-100 和10 mM 二硫苏糖醇 (DTT))。孵育 10 分钟后，在测定缓冲液中添加 2 μl GST-UbA10-His 底物开始反应。反应75分钟后，添加2μl检测抗体试剂，其在测定缓冲液中含有抗His-铕(Life Technologies)和抗-GST-d2(CISbio)。 60 分钟后，在 ViewLux 读数器 (PerkinElmer) 上读取 618 nm 和 671 nm 处的荧光，并在 340 nm 处激发。双标记底物的裂解导致 TR-FRET 信号丢失，而化合物对 USP7 的抑制恢复了信号。 TR-FRET 比率计算为 671 nm 处的荧光除以 618 nm 处的荧光。 TR-FRET 比率标准化为对照以确定单一浓度筛选的抑制百分比。为了确认浓度-反应模式（10 个点，n = 2），根据化合物浓度绘制抑制百分比，并使用筛选分析分析仪 (Genedata) 将数据拟合到四参数曲线以确定 IC50 值。测定缓冲液经过优化，以保持酶稳定性并最大化背景测定信号：包含 Triton X-100，以防止酶和/或底物非特异性吸附到测定板和/或化合物聚集体、Priionex 载体蛋白上包含在内是为了帮助稳定酶并防止对容器和管道表面的非特异性吸附，以及最大限度地减少库化合物的非特异性抑制，DTT 有助于保持良好的 USP7 活性并最大限度地减少通过氧化还原作用的抑制剂的影响骑自行车。试剂浓度经过优化，可在信号降低测定中实现约 50% 的底物转化，从而获得良好的测定性能，其主要目标是最大限度地减少所需的 USP7 浓度。调整 GST-UbA10-Hi 浓度以使检测信号最大化，抗-GST-d2 浓度与底物的浓度大致平行调整，抗-His-铕的使用浓度代表与底物兼容的最低浓度。 ViewLux 读板机上的稳健检测。进行时程评估以确认酶浓度 (10 nM) 和反应时间 (75 分钟) 处于酶活性的线性范围内。此外，使用延长的检测反应时间过程来证明 60 分钟的孵育足以达到平衡。在最终测定条件下，试剂稳定性研究表明超过 20 小时的可接受性能。在整个屏幕过程中，Z' 值的平均值为 0.76。激酶测定：USP7 二泛素 FRET 活性测定。潜在的 USP7 抑制剂在使用内部猝灭的 K63 连接的双泛素底物（U-310，Boston Biochem）的正交活性测定中得到证实。条件与用于 UbA10 TR-FRET 活性测定的条件相似。将分配到 1,536 孔板中的化合物与全长重组 USP7 在测定缓冲液中预孵育 10 分钟，并通过添加 2 μl 双泛素底物开始反应。在60分钟温育期间，USP7对底物的裂解导致QX1标签对TAMRA标签的猝灭的释放，从而荧光增加。通过 540 nm 激发和 585 nm 发射读取荧光强度。浓度响应测定方法和数据分析按照 UbA10 TR-FRET 测定进行。 USP7 泛素/Rho110 活性测定。以泛素/罗丹明-110 作为底物的正交活性测定也证实了潜在的 USP7 抑制剂。将化合物与 2 μl 全长重组 USP7 在测定缓冲液中预孵育 10 分钟，并通过添加 2 μl 泛素/罗丹明-110（U-555，Boston Biochem）开始反应。经过 60 分钟的反应后，USP7 将罗丹明-110 从泛素上裂解下来，从而增强了荧光，在 485 nm 激发和 535 nm 发射下读取荧光强度。一般测定条件和数据分析如上所述。细胞测定：在添加化合物前 24 小时将 EOL-1 细胞接种到 384 孔板中。然后将细胞与化合物(例如，GNE-6776；0.003、0.009、0.027、0.082、0.25、0.74、2.22、6.67和20μM)孵育72小时或120小时，然后测定活力。生物学测定一式三份进行。在整个测定过程中，细胞在 RPMI-1640、2.5% FBS（72 小时测定）或 5% FBS（120 小时测定）和 2 mM 谷氨酰胺中孵育（37°C，5% CO2）。报告的 IC50 和平均活力指标如下： IC50 是相对于未处理的孔估计抑制为 50% 时的剂量（即绝对 IC50）。计算平均生存力

GNE-6776 促进人类异种移植物中的靶向途径调节。尽管仅短暂地达到有效暴露，但 GNE-6776 会导致适度但显着的 EOL-1 异种移植物生长延迟

Immunodeficient C.B-17 SCID mice with an EOL1 AML xenograft, aged 12–16 weeks[1]
100 or 200 mg/kg

[1]. Nature. 2017 Oct 26;550(7677):534-538.

C20H20N4O2

348.406

2009273-71-4

O=C(C1=CC=C(C2=C(CC)C(C3=CC=C(O)C=C3)=C(N)N=C2)C=N1)NC

UCYSSYGGXOFJKK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H20N4O2/c1-3-15-16(13-6-9-17(23-10-13)20(26)22-2)11-24-19(21)18(15)12-4-7-14(25)8-5-12/h4-11,25H,3H2,1-2H3,(H2,21,24)(H,22,26)

5-[6-amino-4-ethyl-5-(4-hydroxyphenyl)pyridin-3-yl]-N-methylpyridine-2-carboxamide

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 70~100 mg/mL ( 200.91~287.03 mM )
Ethanol : ~2 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。