type I PRMT; PRMT1 (IC50 = 3.1 nM); PRMT3 (IC50 = 48 nM); PRMT4 (IC50 = 1148 nM); PRMT6 (IC50 = 5.7 nM); PRMT1 (IC50 = 1.8 nM)

- GSK3368715是一种强效、可逆且不与S-腺苷甲硫氨酸（SAM）竞争的I型PRMT抑制剂。它可改变数百种底物的精氨酸甲基化状态，从不对称二甲基精氨酸（ADMA）转变为单甲基精氨酸（MMA）和对称二甲基精氨酸（SDMA）[1]
- 作为单药疗法，GSK3368715在体外对多种血液和实体肿瘤细胞系具有抗增殖作用。在细胞Western实验中，将RKO细胞接种于透明底384孔板，用GSK3368715的20点两倍稀释系列（29,325.5至0.03 nM）或0.15% DMSO处理，随后在37°C、5% CO₂条件下孵育3天，结果显示其具有较强的抗增殖活性[1]
- GSK3368715与PRMT5抑制剂（如GSK3326595）协同作用，增强对MTAP缺陷型癌细胞系的抗增殖效果，与单药处理相比，细胞活力显著降低[1]
在代表 12 种肿瘤类型的 249 个癌细胞系中，与经 DMSO 处理的细胞相比，GSK3368715 二盐酸盐（EPZ019997 二盐酸盐）表现出 50% 或更高的生长抑制作用 [1]。

- GSK3368715在体内肿瘤模型中可完全抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退。在MTAP缺陷型异种移植模型中，给予GSK3368715可显著抑制肿瘤生长，且对MTAP缺陷型肿瘤的疗效优于MTAP正常型肿瘤[1]
- GSK3368715与PRMT5抑制剂（GSK3326595）联合使用时，在MTAP缺陷型异种移植物中显示出增强的抗肿瘤活性，与单药相比，肿瘤消退更明显[1]
在所有测试剂量下，GSK3368715 二盐酸盐（EPZ019997 二盐酸盐）均显着抑制 BxPC3 异种移植物生长，在 150 mg/kg 和 300 mg/kg 剂量组中，肿瘤生长分别减少 78% 和 97%。 [1]。

高通量筛选[1]
I型PRMT抑制剂是通过筛选Epizyme的专有HMT偏向文库发现的（Mitchell等人，2015）。总之，将化合物与PRMT1在室温下孵育30分钟（384孔板），并在添加SAM和肽后引发反应。最终测定条件为0.75 nM PRMT1（NP_001527.3，GST-PRMT1氨基酸1-371）、200 nM 3H-SAM（比活性80 Ci/mmol）、1.5μM SAM和20 nM肽（Biotin-Ahx-RLARRGGVKRISGLI-NH2，21st Century Biochemicals）在20 mM bincine（pH 7.6）、1 M TCEP、0.005%牛皮明胶、0.002%Tween-20和2%DMSO中的溶液。通过添加SAM（最终400μM）来猝灭反应。将终止的反应转移到Streptavidin包被的Flashplate中，孵育至少1小时，然后使用Biotek ELx405洗板器用0.1%Tween-20洗涤板。使用PerkinElmer TopCount平板读取器测量结合到闪板上的3H肽的量。

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PRMT生化分析[1]
所有测定均在96孔板中用化合物或DMSO预缓冲（49x，2%最终）进行。PRMT1、PRMT3、PRMT6和PRMT8的测定使用H4 1-21肽和由50mM Tris（pH 8）、0.002%Tween-20、0.5mM EDTA和1mM DTT组成的缓冲液。简言之，Flag-his-tev-PRMT8（61-394）在杆状病毒表达系统中表达，并使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析纯化。对于所有测定，列出的最终腺苷-L-蛋氨酸（SAM）浓度包含未标记的SAM和3H-SAM的混合物。所有反应在加入SAH（最终0.5mM）后终止。[1]
对于竞争研究，将底物加入到复合板中，然后加入酶。对于SAM竞争研究，最终测定浓度由2 nM PRMT1、40 nM肽和滴定SAM（50-8000 nM）组成。对于肽竞争研究，最终测定浓度由2 nM PRMT1、1000 nM和滴定肽（1.6-1000 nM）组成。在骤冷之前，将反应物在室温下孵育18分钟。[1]
对于时间依赖性研究，将酶/SAM混合物添加到化合物板中，并在添加肽之前孵育3-60分钟。对于无预培养测定，将肽加入到化合物板中，然后加入酶/SAM混合物以引发反应。最终PRMT1测定浓度为0.5 nM PRMT1、40 nM肽和1100 nM SAM。反应在室温下孵育20分钟，然后淬灭。

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甲基转移酶生化测定法[1]
总之，将甲基转移酶加入底物溶液中并轻轻混合。底物根据测试的甲基转移酶而变化，并且是核小体、核心组蛋白、组蛋白H3、组蛋白H4或H3 1-21肽。加入化合物（最终10μM）并在室温下孵育10分钟。加入3H-SAM（1μM）后开始反应，并在30°C下孵育1小时。将反应混合物输送到P81滤纸中，并用PBS洗涤以通过HotSpot专有技术进行检测。

- 抗增殖实验：将RKO细胞接种于透明底384孔板，用系列浓度的GSK3368715或0.15% DMSO（对照）处理。在37°C、5% CO₂条件下孵育3天后，用冰甲醇在室温下固定细胞30分钟，PBS洗涤，并用封闭缓冲液室温孵育1小时，通过适当检测方法评估细胞活力和增殖[1]
- 协同实验：将MTAP缺陷型和MTAP正常型癌细胞分别用GSK3368715单药、PRMT5抑制剂单药或两者联合处理。72小时后检测细胞活力，计算联合指数（CI）以确定协同作用[1]

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细胞内蛋白质[1]
将RKO细胞接种在透明底部384孔板中，并用GSK3368715（29325.5至0.03nM）或0.15%DMSO的20点两倍稀释系列处理。将平板在37°C、5%CO2中孵育3天。细胞在室温下用冰冷的甲醇固定30分钟，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，然后在室温下与奥德赛阻断缓冲液孵育1小时。去除封闭缓冲液，将细胞与在封闭缓冲液加0.1%吐温-20中稀释的兔抗单甲基精氨酸和小鼠抗α-微管蛋白在4°C下孵育过夜。PBS洗涤后，施加第二抗体IRDye 800CW山羊抗兔IgG（H+L）和IRDye 680RD山羊抗小鼠IgG（H+R）1小时。用PBS，然后用ddH2O彻底洗涤板，并使其在室温下干燥。使用Li-Cor Odyssey成像仪和软件对板进行扫描和分析。通过使用Microsoft Excel将MMA的积分强度除以微管蛋白的积分强度来确定相对MMA表达。然后根据化合物的对数浓度绘制MMA水平，并使用GraphPad Prism 6.0使用4参数拟合方程绘制。

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细胞增殖测定[1]
如前所述评估对GSK3368712和GSK3368715的生长抑制反应（McCabe等人，2012）。用四参数方程拟合数据以生成浓度响应曲线。生长IC50（gIC50）和生长IC100（gIC100）分别是实现50%和100%生长抑制的点。生长抑制是最大抑制百分比，计算为100-（（ymin-100）/（ymax-100）*100）。Ymin-T0值是通过从曲线上的Ymin值减去T0值（100%）来计算的，并且是净群体细胞生长或死亡的度量。生长死亡指数（GDI）是Ymin-T0和前体最大抑制的复合表示。如果Ymin-T0值为负，则GDI等于Ymin-TO；否则，GDI表示相对于DMSO对照（ymax）和（ymin）：（ymin-100）/（ymax-100）*100）的剩余细胞分数。每个测定至少评估两个生物重复。

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对细胞增殖协同效应的评估[1]
如上所述，进行GSK3368715（或GSK3368712）和GSK3203591的双重滴定6天，不同之处在于给细胞施用浓度为0.3至10000nM的两种试剂的16pt、2倍稀释基质。单剂滴定在帕拉列尔中进行。使用每种组合的生长抑制值和如前所述确定的协同作用得分进行布利斯独立性分析（McGrath等人，2016）<小时> 细胞周期分析[1]
Toledo或OCI-Ly1-DLBCL细胞系用5点、10倍稀释系列GSK3368715或0.1%DMSO处理10天。在第3天、第5天、第7天和第10天，分离细胞核，并根据制造商的说明使用CycleTEST PLUS DNA试剂盒（Becton Dickinson）用碘化丙啶对DNA进行染色。使用Becton Dickinson FACS Calibur流式细胞仪测量荧光。使用FlowJo软件通过Watson Pragmatic数学模型确定细胞周期相分布。

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Caspase 3/7测定[1]
GSK3368715处理对细胞胱天蛋白酶3/7活性的影响用胱天蛋白酶-Glo™3/7测定试剂盒测定。根据制造商的说明进行分析。如细胞增殖测定所述，将细胞接种并给予GSK3368715或DMSO。在每个时间点，将CellTiter-Glo试剂添加到重复板中以评估细胞活力，将Caspase-Glo 3/7试剂添加到另一对重复板中来评估细胞死亡。用EnVision平板阅读器测量发光信号。GSK3368715和DSMO的Caspase 3/7Glo和CTG值被背景减去。为了说明细胞数量，然后将每个剂量的Caspase 3/7Glo值标准化为其相应的CTG值。对于每一剂量的GSK3368715，归一化的Caspase 3/7Glo值表示为DMSO Caspase 3/8 Glo平均值的倍数增加。然后对每个生物复制品的复制板的折叠增加进行平均。

异种移植模型：将携带MTAP缺陷型或MTAP功能正常型肿瘤异种移植瘤的裸鼠，通过灌胃给予指定剂量的GSK3368715。在联合用药研究中，小鼠按照预先设定的方案接受GSK3368715和PRMT5抑制剂（GSK3326595）的联合治疗。定期测量肿瘤体积，并监测小鼠的生存率和体重变化[1]

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体内抗肿瘤疗效研究[1]
在德国Charles River Discovery Research Services公司，对GSK3368712在胰腺癌患者来源的异种移植瘤模型（PAXF 2076）中的疗效进行了研究。将肿瘤组织块植入雌性NMRI nu/nu小鼠（NMRI-Foxn1nu）体内。每日监测动物和肿瘤植入情况，直至在足够数量的动物中检测到实体瘤生长。随机分组后，动物被分配到研究组，并每日一次给予赋形剂或 GSK3368712。

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毒理学评估[1]
通过递增剂量和重复剂量毒性研究评估了每日一次口服 GSK3368712 的毒理学特征。剂量范围研究评估了直至最大耐受剂量的剂量。研究采用具有药理学意义的啮齿类动物（大鼠；10-12 周龄 Wistar:Han；每组每性别 n=10-16）和非啮齿类动物（犬；10-12 月龄比格犬；每组每性别 n=3-5）。评估符合 GLP 规范，并与 ICH S9 指南一致。所有研究均按照葛兰素史克（GSK）关于实验动物的照护、福利和待遇的政策进行，并经GSK机构动物护理和使用委员会审查。

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药代动力学研究[1]
对GSK3368715和GSK3368712的药代动力学分析表明，两种化合物均具有适合口服给药和体内抗肿瘤活性评估的药代动力学特性（表S3）。在对大鼠和犬进行的毒理学研究中，主要靶向毒性影响胃肠道，并对造血谱系造成轻度至中度改变（表S4），而小鼠所用剂量耐受性良好。研究了I型PRMTi在携带具有细胞毒性反应的细胞系异种移植瘤的小鼠中的疗效。Toledo DLBCL细胞系对GSK3368715具有细胞毒性反应，体外gIC50为59 nM（图2C）。每日一次给予 GSK3368715 可剂量依赖性地抑制 Toledo 肿瘤的生长，在接受 >75 mg/kg 剂量治疗的小鼠中观察到肿瘤消退（图 2D）。BxPC3 胰腺腺癌细胞系的 gIC50 为 2100 nM，在浓度高于 10 μM 的 GSK3368715 下具有细胞毒性（图 2E）。每日一次给予 I 型 PRMTi 对所有测试剂量的 BxPC3 异种移植瘤的生长均有显著影响，在 150 mg/kg 和 300 mg/kg 剂量组中分别使肿瘤生长减少了 78% 和 97%（图 2F）。在透明细胞肾癌 (ACHN) 和三阴性乳腺癌 (MDA-MB-468) 细胞系异种移植模型中，每日一次给予 150 mg/kg GSK3368715 的疗效研究显示，肿瘤生长抑制率分别为 98% 和 85%（图 S2F 和 S2G）。在胰腺腺癌患者来源的异种移植模型中，I 型 PRMTi 对肿瘤生长有显著抑制作用，在 300 mg/kg 剂量组的部分动物中，肿瘤抑制率超过 90%（图 2G）。这些数据表明，GSK3368715 对多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤细胞系具有强效的抗增殖活性，并能完全抑制肿瘤生长或使体内肿瘤模型消退。

[1]. Anti-tumor Activity of the Type I PRMT Inhibitor, GSK3368715, Synergizes with PRMT5 Inhibition through MTAP Loss. Cancer Cell. 2019 Jul 8;36(1):100-114.e25.

I型蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）催化精氨酸残基的不对称二甲基化，其功能失调与人类癌症相关。GSK3368715靶向这些酶以干扰致癌信号通路[1]。MTAP缺乏会导致内源性PRMT5抑制剂2-甲基硫代腺苷（MTA）的积累，使MTAP缺乏的癌症对GSK3368715更敏感，并增强其与PRMT5抑制剂的协同作用[1]。I型蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）催化蛋白质上精氨酸的不对称二甲基化。I型PRMTs及其底物与人类癌症密切相关，提示抑制I型PRMTs可能为肿瘤治疗提供一种新的策略。本报告描述了GSK3368715 (EPZ019997)，一种强效、可逆的I型PRMT抑制剂，在人类癌症模型中具有抗肿瘤作用。抑制主要的II型PRMT——PRMT5，与GSK3368715联合使用时，可产生协同抑制癌细胞生长的作用。值得注意的是，甲基硫代腺苷磷酸化酶基因（MTAP）的缺失会导致代谢产物2-甲基硫代腺苷（一种PRMT5的内源性抑制剂）的积累，并且与细胞系对GSK3368715的敏感性相关。这些数据为探索MTAP状态作为患者选择的生物标志物策略提供了理论依据。[1]
• GSK3368715是I型蛋白精氨酸甲基转移酶的强效抑制剂
• GSK3368715可改变外显子使用情况，并对多种癌症模型具有活性
• GSK3368715与PRMT5抑制剂GSK3326595协同作用，抑制肿瘤生长
• MTAP基因缺陷会损害PRMT5活性，使癌细胞对GSK3368715更加敏感

C20H40CL2N4O2

439.4632

438.25

C, 54.66; H, 9.17; Cl, 16.13; N, 12.75; O, 7.28

1628925-77-8

GSK3368715;1629013-22-4;GSK3368715 trihydrochloride;2227587-26-8; 1629013-22-4; 2227587-25-7 (HCl); 2227587-26-8 (3HCl)

138911351

Typically exists as wWhite to off-white solids at room temperature

62.4Ų

4

5

12

28

365

0

Cl[H].Cl[H].O(C([H])([H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C1(C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C2=C(C([H])=NN2[H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C1([H])[H]

HPSRPMOJFMXEKS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H38N4O2.2ClH/c1-5-25-15-20(16-26-6-2)9-7-17(8-10-20)19-18(13-22-23-19)14-24(4)12-11-21-3/h13,17,21H,5-12,14-16H2,1-4H3,(H,22,23)2*1H

N1-((3-(4,4-Bis(ethoxymethyl)cyclohexyl)-1H-pyrazol-4-yl)methyl)-N1,N2-dimethylethane-1,2-diamine dihydrochloride

EPZ019997 dihydrochlorideGSK 3368715 EPZ019997GSK3368715 EPZ-019997GSK-3368715 EPZ 019997

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~230 mg/mL (~523.37 mM)
H2O : ~140 mg/mL (~318.57 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 100 mg/mL (227.55 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。