iCRT3

β-catenin-responsive transcription (CRT)
The target of iCRT3 is the β-catenin/T-cell factor (TCF) complex, specifically inhibiting the interaction between β-catenin and TCF1; [2]
The target of iCRT3 is the Wnt/β-catenin signaling pathway, acting as a small-molecule inhibitor of β-catenin-responsive transcription; [3]
The target of iCRT3 is the Wnt/β-catenin signaling pathway; [1]

iCRT3 抑制对 Wnt 和 β-catenin 敏感的转录。 iCRT3 显着降低了 TOP Flash 活动和 NTSR1 级别。 iCRT3可以显着抵消神经降压素（NTS）和Wnt3a的抗凋亡作用[1]。与 DMSO 对照相比，长期 iCRT3 维持的细胞表现出经典多能性的表达增加，但同时分化标记物和 T 细胞因子 (TCF) 靶基因的表达减少[2]。 iCRT3 治疗在 12.5、25、50 和 75 μM 剂量下，TNF-α 水平分别降低 14.7%、18.5%、44.9% 和 61.3%。与媒介物相比，iCRT3 疗法的 IκB 水平呈剂量依赖性上升[3]。

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1. 对胶质母细胞瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用：iCRT3通过药理抑制Wnt/β-catenin通路，降低胶质母细胞瘤细胞中NTSR1的mRNA和蛋白表达水平[1]
2. 对小鼠胚胎干细胞（mESCs）中β-catenin/TCF1相互作用的抑制作用：iCRT3特异性抑制β-catenin与TCF1的相互作用，不影响β-catenin与TCF3的结合。这种抑制作用降低了TCF依赖性靶基因（如Cdx1、Axin2）的转录活性，延缓了mESCs的分化。经iCRT3处理14天后，mESCs的自我更新能力增强，维持较高的Nanog和Rex1表达水平，自发分化减少。在视黄酸（RA）诱导的分化模型中，iCRT3使mESCs能够抵抗分化，提高Nanog-GFP阳性细胞比例，增强集落形成效率。此外，iCRT3还可增加β-catenin/Oct4复合物的形成，该复合物与基础状态多能性相关[2]
3. 对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的调控作用：用不同浓度的iCRT3预处理（50分钟）RAW264.7巨噬细胞后，加入LPS（1 ng/ml）刺激。iCRT3呈剂量依赖性抑制LPS诱导的Wnt/β-catenin通路激活（通过TOP-TK-Luc报告基因活性检测）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生（通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测）。iCRT3还呈剂量依赖性抑制LPS诱导的IκB降解（通过蛋白质印迹法（Western blotting）分析），且不影响细胞活力（通过MTS实验检测，与未处理细胞相比活力维持在100%）[3]

iCRT3 治疗可显着降低肿瘤生长速度。 iCRT3 的肿瘤抑制功能始终与增殖标志物 Ki67 指数的下降相关[1]。与载体组相比，10 mg/kg iCRT3 治疗组的 IL-6 水平降低了 82.9%。在假手术中，检测不到 IL-1β 水平；然而，在脓毒症小鼠中，当给予 5 和 10 mg/kg iCRT3 时，它们分别达到 371 pg/mL 和下降 30.2% 和 53.2%。用 5 和 10 mg/kg 剂量的 iCRT3 治疗的这些脓毒症小鼠的 AST 水平分别比用载体治疗的动物低 15.4% 和 44.2%。与媒介物组相比，用 10 mg/kg iCRT3 治疗后，肺形态得到改善，微观退化更少。将 iCRT3 治疗动物的肺组织与媒介物组进行比较时，凋亡细胞减少了 92.7%[3]。

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1. 对胶质母细胞瘤模型肿瘤生长的抑制作用：iCRT3通过药理抑制Wnt/β-catenin信号通路，在体内抑制胶质母细胞瘤的肿瘤生长[1]
2. 对C57BL/6小鼠脓毒症诱导的炎症反应和器官损伤的缓解作用：对雄性C57BL/6小鼠进行盲肠结扎穿孔（CLP）诱导脓毒症，在CLP后5小时腹腔注射iCRT3（5 mg/kg或10 mg/kg体重）。CLP后20小时，iCRT3呈剂量依赖性降低血浆中促炎细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）和器官损伤标志物（AST、ALT、LDH）的水平。组织学分析显示，iCRT3（10 mg/kg）改善了肺组织完整性，降低了肺损伤评分，减少了肺胶原沉积（通过Masson三色染色），并抑制了肺细胞凋亡（通过TUNEL染色检测）。此外，iCRT3下调了肺组织中IL-6、TNF-α、IL-1β、中性粒细胞趋化因子（MIP-2、KC）的mRNA表达，降低了肺髓过氧化物酶（MPO）活性，从而减轻了中性粒细胞浸润[3]

β-catenin-TCF报告活性测定[3]
RAW264.7细胞在转染前一天以1.24 × 105个细胞/ ml的密度接种。细胞与250 ng TOP-TK-Luc或TOP-TK-Luc和25 ng pRL-TK报告质粒短暂共转染，使用Lipofectamine 3000 Reagent，按照制造商的说明。转染24 h后，用iCRT3或对照物预处理细胞50 min，然后用LPS （1 ng/ml）刺激24 h。转染后48小时裂解细胞，根据制造商的说明，用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。TOP-TK-Luc包含最优位点，TOP-TK-Luc包含位于萤火虫荧光素酶报告基因上游的突变tcf结合位点。将TOP和FOP萤火虫荧光素酶活性归一化为来自共转染pRL-TK质粒的Renilla荧光素酶活性，作为转染效率的内部对照。所有实验都进行了至少两次的三次重复。

荧光素酶报告试验[1]
细胞在24孔板中以4 × 105个细胞/孔的大小进行镀膜，用Lipofectamine 2000 瞬时转染TopFlash（0.5µg）和Renilla报告基因（0.05µg）。A172或U87细胞中分别加入NTS、Wnt3a、SR48692和iCRT3处理24 h。收集细胞，转染2天后测定荧光素酶活性。采用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。

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细胞增殖和细胞凋亡试验[1]
将细胞接种到96孔板中，每孔密度为5 × 103个细胞，在指定处理的培养基中再孵育48小时。根据制造商的说明，分别使用Cell Counting kit-8和Caspase-Glo 3/7检测试剂盒进行细胞活力和细胞凋亡检测。

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对于长期培养，在DMSO或iCRT3的干条件下（血清加LIF），将细胞以有限的稀释度在6孔或96孔板中进行多次传代（14 d），每天更换培养基。每代进行AP染色以监测相对多能性水平。使用的小分子包括10µM iCRT3和1µM XAV939，用DMSO稀释。L- wnt3a和对照L细胞是R.T. Moon赠送的。［2］

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1. 胶质母细胞瘤细胞实验：用iCRT3（浓度未明确）处理胶质母细胞瘤细胞以抑制Wnt/β-catenin通路。处理后提取细胞总RNA和蛋白，通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）检测NTSR1的mRNA表达水平，通过Western blotting分析NTSR1的蛋白表达水平[1]
2. 小鼠胚胎干细胞（mESCs）实验：
- β-catenin/TCF转录活性实验：将mESCs（NG4-TOPluc）转染TOPFlash报告基因质粒和内参pRL-TK质粒。转染后，用iCRT3（浓度未明确）处理细胞，并在含血清和白血病抑制因子（S+LIF）或含血清和RA（S+RA）的培养基中培养，检测荧光素酶活性以评估对β-catenin/TCF依赖性转录活性的抑制作用[2]
- 流式细胞术分析：在S+LIF培养基中用iCRT3处理TNGA（Nanog报告基因）和Rex1-GFP mESCs 14天，通过流式细胞术检测Nanog-GFP和Rex1-GFP的表达水平，评估自我更新能力。在分化抵抗实验中，无LIF条件下用iCRT3处理mESCs 6天或RA诱导分化时处理48小时，通过流式细胞术分析Nanog-GFP阳性细胞比例[2]
- qPCR分析：收集经iCRT3处理四代或RA诱导分化过程中的mESCs，提取总RNA并逆转录为cDNA，以肌动蛋白（actin）为内参，通过qPCR检测多能性标志物（Nanog、Oct4、Sox2）、分化标志物及TCF靶基因（Cdx1、Axin2）的mRNA表达水平[2]
- 集落形成效率（CFE）实验：将mESCs用RA联合iCRT3或二甲基亚砜（DMSO）预处理48小时后，以有限稀释法接种到不含抑制剂的S+LIF培养基中，再培养48小时，量化集落数量、集落面积和碱性磷酸酶（AP）活性以评估集落形成效率[2]
- 免疫共沉淀（CoIP）实验：制备RA诱导分化过程中经iCRT3处理的mESCs总细胞裂解液，用抗β-catenin、TCF1和TCF3的抗体进行CoIP实验，检测β-catenin与TCF1/TCF3的相互作用，通过Western blotting进行检测和密度分析[2]
3. RAW264.7巨噬细胞实验：
- 报告基因实验：将RAW264.7细胞共转染β-catenin/TCF应答报告基因TOP-TK-Luc（或对照FOP-TK-Luc）和内参pRL-TK。转染后，用不同浓度的iCRT3预处理细胞50分钟，再用LPS（1 ng/ml）刺激24小时，检测荧光素酶活性以评估Wnt/β-catenin通路激活情况[3]
- TNF-α ELISA实验：用不同浓度的iCRT3预处理RAW264.7细胞50分钟，再用LPS（1 ng/ml）刺激4小时，收集细胞上清液，通过ELISA检测TNF-α水平[3]
- MTS细胞活力实验：用不同浓度的iCRT3处理RAW264.7细胞，通过MTS实验检测细胞活力，以未处理细胞的活力为100%[3]
- IκB Western blotting实验：用不同浓度的iCRT3预处理RAW264.7细胞50分钟，再用LPS（1 ng/ml）刺激15分钟，制备总细胞裂解液，用抗IκB和actin的抗体进行Western blotting，检测IκB降解情况[3]

溶于 5% DMSO 生理盐水中；5 和 10 mg/kg；腹腔注射。
使用 C57BL/6 小鼠 A172 细胞建立皮下异种移植瘤模型，并测定 SR48692 和 iCRT3 的抗肿瘤作用。将 2 × 10⁶ 个 A172 细胞皮下接种于 NOD-SCID BALB/c 小鼠右背部。每 4 天记录一次原发肿瘤的生长情况。当肿瘤生长至约 200 mm³ 时，每三周腹腔注射一次 SR48692 (10 mg/kg) 和 iCRT3 (5 mg/kg)（溶于 PBS）。对照组小鼠注射含 5% (v/v) DMSO 的空白 PBS。肿瘤体积采用以下公式计算：体积 = 肿瘤长度 × 宽度²/2。药物治疗 24 天后处死小鼠。肿瘤切除后进行石蜡包埋，并采用免疫组织化学方法分析Ki67染色。[1]

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小鼠随机分为三组：假手术组（n = 5只小鼠）、载体组和治疗组（每组n = 8只小鼠）。iCRT3用细胞培养级100% DMSO配制成50 mg/ml的储备液。iCRT3用含5% DMSO的无菌生理盐水稀释，配制成5 mg/kg和10 mg/kg体重（BW）的iCRT3浓度溶液。盲肠结扎穿孔术（CLP）后5小时，使用25G × 7/8″皮下注射针，腹腔注射200 μl含5% DMSO的生理盐水（载体）或5 mg/kg或10 mg/kg体重的iCRT3溶液。进行动物实验的研究人员对治疗分配情况不知情，以消除任何偏倚。[3]

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1. 胶质母细胞瘤体内实验：动物模型建立（例如，细胞接种方法、细胞数量）、iCRT3剂量、给药途径和频率等具体细节未明确说明。采用iCRT3对Wnt/β-catenin通路进行药理学抑制，以观察其对肿瘤生长的抑制作用[1]
2. C57BL/6小鼠脓毒症模型实验：
- 动物准备：选用雄性C57BL/6小鼠作为实验动物，随机分为假手术组、CLP+载体组和CLP+iCRT3治疗组（5 mg/kg和10 mg/kg体重，每组5-8只小鼠）[3]
- 脓毒症模型建立：CLP组小鼠行盲肠结扎穿刺术以诱导脓毒症，假手术组仅行开腹手术，不行盲肠结扎穿刺术[3]
- 给药：CLP术后5 h，各治疗组小鼠腹腔注射iCRT3。将 iCRT3 溶解于 5% DMSO 生理盐水中，剂量按规定配制。对照组小鼠注射等体积的 5% DMSO 生理盐水 [3]
- 样本采集与检测：盲肠结扎穿孔术 (CLP) 后 20 小时，采集小鼠血液样本，检测血浆细胞因子水平和器官损伤标志物。取肺组织进行组织学分析（苏木精-伊红染色、马松三色染色）、TUNEL 染色、细胞因子和趋化因子 mRNA 表达的 qPCR 分析以及髓过氧化物酶 (MPO) 活性检测 [3]

[1]. A Novel Positive Feedback Loop Between NTSR1 and Wnt/β-Catenin Contributes to Tumor Growth of Glioblastoma. Cell Physiol Biochem. 2017 Oct 24;43(5):2133-2142.

[2]. Inhibition of β-catenin-TCF1 interaction delays differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 2015 Oct 12;211(1):39-51.

[3]. Mitigation of sepsis-induced inflammatory responses and organ injury through targeting Wnt/β-catenin signaling. doi: 10.1038/s41598-017-08711-6.

背景/目的：神经降压素（NTS）是一种肠道激素，它通过与主要受体NTSR1结合，在癌症进展中发挥重要作用。保守的Wnt/β-catenin信号通路通过激活β-catenin/T细胞因子（TCF）复合物并随后调控一系列靶基因，从而调节细胞增殖和分化。本研究旨在揭示NTS/NTSR1信号通路与Wnt/β-catenin信号通路之间的潜在联系。方法：我们采用基因沉默、药理学抑制和功能获得性实验以及生物信息学分析等方法，揭示NTS/NTSR1信号通路与Wnt/β-catenin信号通路之间的联系。本研究采用两种抑制剂在体内评估靶向NTS/NTSR1信号通路或Wnt/β-catenin通路的效率。结果显示，NTS/NTSR1可诱导丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB通路的激活，进而促进Wnt蛋白（包括Wnt1、Wnt3a和Wnt5a）的表达。同时，在胶质母细胞瘤细胞中，Wnt通路激活剂Wnt3a可上调NTSR1的mRNA和蛋白表达水平，而Wnt抑制剂iCRT3则可下调NTSR1的mRNA和蛋白表达水平。此外，NTS/NTSR1 或 Wnt/β-catenin 信号通路的药理学抑制可抑制体外和体内的肿瘤生长。结论：这些结果揭示了胶质母细胞瘤细胞中 NTS/NTSR1 和 Wnt/β-catenin 信号通路之间存在正反馈环路，这可能对肿瘤发展至关重要，并为胶质母细胞瘤的治疗提供潜在靶点。[1]

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小鼠胚胎干细胞 (mESC) 的自我更新或分化为各种细胞谱系的能力受信号通路和由 Nanog、Oct4 和 Sox2 组成的核心多能性转录网络 (PTN) 的调控。Wnt/β-catenin 通路通过缓解 T 细胞因子 TCF3 介导的 PTN 抑制来促进多能性。然而，β-catenin 作为转录激活因子与 TCF1 协同作用如何影响 mESC 的命运仍不清楚。本文研究表明，TCF1介导的转录在分化的小鼠胚胎干细胞（mESCs）中上调，而β-catenin/TCF1相互作用的化学抑制可改善长期自我更新能力并增强功能性多能性。TCF1基因缺失通过延迟多能性退出抑制分化，并赋予mESCs一种与高Nanog表达的自我更新mESCs极为相似的转录谱。综上所述，我们的数据表明，β-catenin在调控mESCs中的功能具有高度的上下文特异性，其与TCF1的相互作用促进分化，这进一步凸显了理解其单个蛋白质-蛋白质相互作用如何驱动干细胞命运的必要性。[2] Wnt/β-catenin通路参与调控多种感染性和炎症性疾病中的炎症反应。脓毒症是一种由感染引起的炎症反应失调导致的危及生命的疾病，目前尚无有效的治疗方法。近期研究发现，脓毒症中Wnt/β-catenin信号通路活性升高。然而，其在脓毒症相关炎症反应中的作用机制仍有待探索。本研究表明，抑制Wnt/β-catenin信号通路可减轻炎症并缓解脓毒症引起的器官损伤。我们利用体外LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞，证实β-catenin反应性转录的小分子抑制剂iCRT3可显著降低LPS诱导的Wnt/β-catenin活性，并以剂量依赖的方式抑制TNF-α的产生和IκB的降解。腹腔注射iCRT3至盲肠结扎穿刺诱导脓毒症的C57BL/6小鼠后，可剂量依赖性地降低血浆中促炎细胞因子和器官损伤标志物的水平。iCRT3治疗可改善肺组织的完整性，并减少肺胶原沉积和细胞凋亡。此外，iCRT3 治疗还能降低脓毒症小鼠肺部细胞因子、中性粒细胞趋化因子以及髓过氧化物酶 (MPO) 的表达。基于这些发现，我们得出结论，靶向 Wnt/β-catenin 通路可能为脓毒症的治疗提供一种潜在的治疗方法。[3]

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1. 背景：神经降压素 (NTS) 与其主要受体 NTSR1 结合，促进癌症进展。Wnt/β-catenin 通路通过激活 β-catenin/TCF 复合物来调节细胞增殖和分化。在胶质母细胞瘤细胞中，NTS/NTSR1 和 Wnt/β-catenin 信号通路之间存在正反馈环路，该环路参与肿瘤的发生发展。[1]
2. 作用机制：iCRT3 抑制 Wnt/β-catenin 信号通路，从而降低 NTSR1 的表达并抑制胶质母细胞瘤的生长。[1]
3.背景：Wnt/β-catenin信号通路调控小鼠胚胎干细胞（mESCs）的自我更新和分化。β-catenin可缓解TCF3介导的多能性转录网络（PTN）抑制，从而促进多能性；同时，β-catenin与TCF1的相互作用可促进mESC分化[2]
4. 作用机制：iCRT3特异性抑制β-catenin与TCF1的相互作用，降低分化促进靶基因的转录活性。它增强mESC的自我更新，延缓分化，并提高功能性多能性，且不影响β-catenin与TCF3的相互作用[2]
5. 背景：Wnt/β-catenin信号通路参与调控感染性和炎症性疾病中的炎症反应。脓毒症是由感染引起的炎症反应失调所致，在脓毒症中已检测到Wnt/β-catenin信号通路激活[3]
6.作用机制：iCRT3阻断Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制NF-κB通路，减少促炎细胞因子和趋化因子的产生，减轻肺胶原沉积、细胞凋亡和中性粒细胞浸润，最终减轻脓毒症引起的炎症反应和器官损伤[3]
7. 治疗潜力：iCRT3通过靶向Wnt/β-catenin通路，具有治疗胶质母细胞瘤的潜在治疗价值[1]
8. 治疗潜力：iCRT3为研究β-catenin/TCF1相互作用在mESC命运调控中的作用提供了一种工具，并可能在干细胞研究中具有潜在的应用价值[2]
9.治疗潜力：利用iCRT3靶向Wnt/β-catenin通路可能是一种治疗脓毒症的潜在治疗方法[3]

C23H26N2O2S

394.53

394.171

C, 70.02; H, 6.64; N, 7.10; O, 8.11; S, 8.13

901751-47-1

6622273

White to off-white solid powder

5.195

80.43

1

4

9

28

462

0

QTDYVSIBWGVBKU-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H26N2O2S/c1-3-18-9-11-20(12-10-18)23-25-21(17(2)27-23)15-28-16-22(26)24-14-13-19-7-5-4-6-8-19/h4-12H,3,13-16H2,1-2H3,(H,24,26)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。