CaMKII (calmodulin-dependent kinase type II) (Ki = 370 nM)

用 KN-93 盐酸盐处理两天后，95% 的细胞处于 G1 期。 G1 停滞是可逆的，KN-93 盐酸盐释放一天后，细胞达到 S 期和 G2-M 期高峰。 KN-93 盐酸盐还抑制 NIH 3T3 成纤维细胞响应碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子-BB 和表皮生长因子的增殖 [1]。虽然 KN-93 盐酸盐强烈消散胃膜囊泡中产生的质子梯度并减少腔体积，但它抑制 H+ 和 K+-ATP 酶的作用 [2]。 KN-93 盐酸盐 (0.5 μM) 可抑制早期后除极和动作电位延长期间左心室应力升高的发展。早期后除极的特点是独立于 Ca2+ 的 CaM 激酶活性升高，该活性可被 KN-93 盐酸盐抑制 [3]。

KN-93 (5 μg) 通过降低帕金森病大鼠模型中 pGluR1S845 的表达来改善左旋多巴诱导的运动障碍。在 MRL/lpr Foxp3-GFP 小鼠中，KN-93 可显着诱导脾脏、外周淋巴结和外周血中的 Treg 细胞，并减少皮肤和肾脏损伤。 KN-93（1 mg/kg/天，腹膜内注射）可降低糖尿病视网膜中 CaMKII 和 NF-κB 的磷酸化，并抑制糖尿病引起的视网膜血管渗漏[4]。

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多功能钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaM激酶）介导钙诱导的L型钙电流（ICa）增加；因此，它可能在ICa引起的早期后去极化（EADs）期间充当致心律失常信号分子。为了研究钙调素激酶激活对ICa依赖性EADs有利的假设，在离体兔心脏中用clofilium诱导EADs。所有EAD均迅速用ICa拮抗剂终止。在接触氯菲林之前，用钙调素激酶抑制剂KN-93或非活性类似物KN-92（0.5微M）预处理心脏10分钟。与KN-92（EAD存在于10/11颗心脏中）相比，KN-93（EAD在4/10颗心脏中存在）显著抑制了EAD（P=0.024）。在KN-93或KN-92治疗的心脏中，单相动作电位持续时间或心率等有利于EAD的参数没有显著差异。与无EAD的心脏相比，EAD心脏的CaM激酶原位活性增加了37%（P=0.015）。用KN-93预处理可以防止钙调素激酶活性的增加。在体外，KN-93有效地抑制了兔心肌CaM激酶活性（计算Ki100微M）。KN-93和KN-92对ICa和其他复极K+电流的作用并不能解释KN-93对EAD的优先抑制。这些数据显示了钙调素激酶活化与EAD之间的新关联，并与ICa和钙调素酶活化都有助于该模型中EAD的假设一致。[3]

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姜黄素和KN-93抑制糖尿病引起的视网膜血管渗漏[4]
伊文思蓝用于视网膜平板支架，以评估姜黄素对视网膜血管渗漏的影响。在对照视网膜中，伊文思蓝荧光位于血管内（图2A）。在STZ治疗的大鼠中，观察到染料从毛细血管和较大血管的局灶性泄漏（图2B，箭头），这与其他报告一致。在服用姜黄素（图2C）或KN93（图2D）的STZ治疗大鼠中没有发现这种泄漏。测量视网膜中的伊文思蓝以评估BRB通透性（图2E）。与对照组动物（0.82±0.11μg Evans蓝/g湿重视网膜）相比，STZ治疗的糖尿病大鼠视网膜中的Evans蓝水平升高（2.89±0.47μg Evans-blue/g湿重视网膜。与全量成像显示的血管渗漏减少一致，在服用姜黄素（1.24±0.21μg）或KN93（1.37±0.35μg）的STZ治疗大鼠中，这种升高显著降低。

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姜黄素和KN-93可降低糖尿病视网膜中VEGF、iNOS和ICAM-1的表达[4]
血管渗漏和白细胞粘附到视网膜血管是由促炎细胞因子介导的。因此，我们测定了姜黄素对VEGF、iNOS和ICAM-1表达水平的影响。与非糖尿病对照组相比，STZ治疗的糖尿病大鼠视网膜中的mRNA（图3A）和蛋白质（图3B，C）测量值显著升高。姜黄素或KN93的给药显著降低了这些增加。

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姜黄素和KN-93抑制糖尿病视网膜中CaMKII和NF-κB的磷酸化[4]
NF-κB p65亚基的磷酸化在调节许多基因的表达中起着重要作用，包括编码促炎细胞因子和粘附分子的基因。此外，CaMKII的磷酸化是糖尿病小鼠视网膜血管损伤发展的关键因素。为了评估姜黄素在调节CaMKII和NF-κB p65磷酸化中的作用，我们通过蛋白质印迹检测了视网膜。如图5所示，与对照组相比，STZ治疗的糖尿病大鼠视网膜中磷酸化CaMKII（Thr286）和NF-kB p65（Ser536）的水平显著升高。在给予姜黄素（100mg/kg/天）或KN93（1mg/kg/天）的STZ治疗的糖尿病大鼠中，这种升高是正常的。

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2μg和5μgKN-93治疗均降低了左旋多巴引发PD大鼠的AIMs评分，但不影响左旋多巴的抗帕金森病作用。与行为分析一致，KN-93治疗（2μg）降低了PD大鼠的pGluR1S845水平。此外，KN-93治疗（2μg）降低了PD大鼠Gad1和Nur77的表达。 结论：这些数据表明，纹状体内注射KN-93有利于通过抑制PD大鼠CaMKII的激活来降低pGluR1S845的表达，从而降低LID的表达。pGluR1S845表达的降低进一步降低了PD大鼠Gad1和Nur77的表达[5]。

对于原代培养研究，如前所述，获得并鉴定了大鼠视网膜Müller细胞。简而言之，在出生后（PN）第5天至PN7天处死Sprague-Dawley大鼠，在无菌条件下清洗摘除的眼睛，丢弃前部。分离视网膜，切成1×1mm的碎片，在37°C下用0.1%胰蛋白酶处理20分钟，然后穿过网片去除任何大的视网膜碎片。将过滤的分离物以800rpm离心5分钟，并去除上清液。将沉淀的细胞重新悬浮并接种到含有添加了2 mmol/L谷氨酰胺、0.1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的塑料培养瓶中。培养物在37°C的5%二氧化碳中保持。每3-4天常规更换一次培养基。通过免疫细胞化学染色判断，Müller细胞通过谷氨酰胺合成酶（GS）和波形蛋白的表达进行鉴定。细胞核用DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）染色。所有实验均使用80%-85%的融合细胞进行。每次实验前，将平板细胞与无血清DMEM培养基一起孵育1小时。之后，用无血清DMIM代替培养基，在有或没有10μmol/LKN-93、100μmol/L PDTC（吡咯烷二硫代氨基甲酸酯，一种NF-kB抑制剂）或指定浓度的姜黄素的情况下，用正常D-葡萄糖（5.5 mmol/L）或高葡萄糖（HG；30 mmol/L葡萄糖）处理细胞。[4]

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细胞存活率评估：通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法评估细胞存活率。简而言之，将Müller细胞以每孔10×104个细胞的密度接种在96孔板上，并培养至亚融合。接下来，细胞用姜黄素处理24小时，然后在37°C、5%CO2气氛中用MTT（5 mg/mL）孵育4小时。然后去除培养基，将反应中形成的甲赞溶解在150μL DMSO（二甲基亚砜）中。使用多功能微孔板读数器在490nm处测量溶液的光密度。每个孔中的细胞存活率以对照组（载体处理组）的百分比表示。

糖尿病视网膜病变大鼠模型及药物治疗 [4]
本研究采用体重 180-200 g 的 8 周龄雄性 Sprague-Dawley 大鼠。实验鼠饲养于通风微隔离笼中，可自由获取水和食物。实验鼠随机分为两组，分别腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素（STZ）或柠檬酸盐缓冲液。STZ处理48小时后，若血糖水平超过16.7 mmol/L，则判定为糖尿病模型。糖尿病诱导两周后，将实验鼠随机分为三组：STZ糖尿病组（n=12）、STZ处理后给予姜黄素的糖尿病组（n=12）以及STZ处理后给予KN-93的糖尿病组（n=12），持续12周。姜黄素悬浮于含0.5%羧甲基纤维素的生理盐水中，浓度为20 mg/ml，以100 mg/kg/天的总剂量进行灌胃给药。 KN-93 以 1 mg/kg/天的剂量进行腹腔注射。对照组（链脲佐菌素 (STZ) 处理的糖尿病大鼠和非糖尿病对照组，n=12）每日灌胃给予含 0.5% 羧甲基纤维素的生理盐水。每 2 周测量一次体重和血糖水平。给药方案结束后，用戊巴比妥钠深度麻醉动物，随后处死。摘除眼球进行研究。

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实验设计[5]
如图 1 所示，采用 6-羟基多巴胺 (OHDA) 注射建立帕金森病 (PD) 大鼠模型。注射 3 周后，选择阿扑吗啡诱导旋转稳定的大鼠（>7 转/分钟）作为有效的 PD 大鼠。40 只有效的 PD 大鼠每日两次接受左旋多巴联合苄丝肼治疗，持续 21 天。在治疗的第1、7、14和21天测量异常不自主运动（AIMs）评分。此外，一组帕金森病（PD）大鼠（PD组，n = 10）和另一组假手术大鼠（假手术组，n = 10）每天两次接受赋形剂治疗，持续21天。在第22天，将40只接受左旋多巴治疗的PD大鼠随机分为四组：左旋多巴+KN-93（1 μg）组、左旋多巴+KN-93（2 μg）组、左旋多巴+KN-93（5 μg）组和左旋多巴+赋形剂组。这些大鼠在接受左旋多巴治疗前，分别纹状体内注射不同剂量的KN-93（1 μg、2 μg或5 μg）或赋形剂。作为对照，假手术组和帕金森病组大鼠在接受溶剂治疗前均纹状体内注射溶剂。分别于第1天和第22天测量阿扑吗啡诱导的旋转次数，以观察KN-93的抗帕金森病作用。分别于第1、7、14、21和22天测量大鼠的异常不自主运动评分（AIMs评分），以观察KN-93的抗运动障碍作用。实验结束时，使用3%苯巴比妥深度麻醉处死大鼠。采用Western blot法检测大鼠体内GluR1和pGluR1S845的表达水平。采用实时聚合酶链式反应（PCR）法检测大鼠体内Gad1和Nurr77的表达水平。

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治疗[5]
40只帕金森病（PD）大鼠接受左旋多巴（25 mg/kg 加苄丝肼 12.5 mg/kg，皮下注射）治疗，每日两次，持续21天。第22天，将40只PD大鼠随机分为四组（n = 10），在给予左旋多巴前，分别进行纹状体内注射KN-93（1 μg、2 μg 或 5 μg）或等体积的溶剂。作为对照，10只假手术大鼠和10只PD大鼠接受溶剂治疗，每日两次，持续21天。第22天，这些溶剂治疗组大鼠在接受溶剂治疗前，也进行纹状体内注射。

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溶于 4 μL 含 0.02% 抗坏血酸的 0.9% 生理盐水中；5 μg；纹状体内注射

Sprague Dawley 雌性大鼠

[1]. G1 cell cycle arrest and apoptosis are induced in NIH 3T3 cells by KN-93, an inhibitor of CaMK (the multifunctional Ca2+/CaM kinase). Cell Growth Differ. 1995 Sep;6(9):1063-70.

[2]. Inhibition of acid secretion in gastric parietal cells by the Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitorKN-93. Biochem Biophys Res Commun. 1993 Sep 15;195(2):608-15.

[3]. KN-93, an inhibitor of multifunctional Ca++/calmodulin-dependent protein kinase, decreases early afterdepolarizations in rabbit heart. J Pharmacol Exp Ther. 1998 Dec;287(3):996-1006.

[4]. Curcumin Attenuates Retinal Vascular Leakage by Inhibiting Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II Activity in Streptozotocin-Induced Diabetes. Cell Physiol Biochem. 2016;39(3):1196-208.

[5]. Intrastriatal injections of KN-93 ameliorates levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. Neuropsychiatr Dis Treat. 2013:9:1213-20.

KN-93 是一种磺酰胺，由对甲氧基苯磺酸与 2-(氨甲基)-N-(2-羟乙基)苯胺的苯胺氮缩合而成，其中伯氨基上的氢被甲基和对氯肉桂基取代。KN-93 是 Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II 的选择性抑制剂。它作为 EC 2.7.11.17（Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶）抑制剂和抗衰老药物发挥作用。它是一种磺酰胺、叔胺化合物、伯醇、单氯苯类化合物和单甲氧基苯类化合物。

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背景：左旋多巴仍然是治疗帕金森病 (PD) 最有效的药物。然而，长期左旋多巴治疗与左旋多巴诱导的运动障碍（LID）的出现相关，这限制了其在帕金森病（PD）治疗中的应用。LID的机制目前尚未完全阐明。先前的研究表明，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）抑制剂KN-93可以改善大鼠的LID。然而，KN-93发挥抗运动障碍作用的具体机制尚不完全清楚。
方法：本研究采用6-羟基多巴胺（OHDA）注射法建立PD大鼠模型。随后，在对成功致病的大鼠进行左旋多巴治疗前，分别向纹状体内注射不同剂量的KN-93（1 μg、2 μg或5 μg）。测量PD大鼠的异常不自主运动（AIMs）评分和阿扑吗啡诱导的旋转行为。采用蛋白质印迹法测定GluR1丝氨酸845位点磷酸化水平（pGluR1S845）。采用实时聚合酶链式反应（PCR）测定Arc和Penk蛋白水平。
结果：我们发现，2 μg和5 μg KN-93处理均可降低左旋多巴预处理的帕金森病（PD）大鼠的异常不自主运动（AIMs）评分，且不影响左旋多巴的抗帕金森病作用。与行为学分析结果一致，2 μg KN-93处理可降低PD大鼠的pGluR1S845水平。此外，2 μg KN-93处理还可降低PD大鼠的Gad1和Nur77表达。
结论：这些数据表明，纹状体内注射KN-93可通过抑制CaMKII的激活，降低pGluR1S845的表达，从而有助于减少PD大鼠的左旋多巴诱导的运动障碍（LID）。 pGluR1S845表达降低进一步降低了帕金森病（PD）大鼠中Gad1和Nur77的表达。[5]
综上所述，我们发现纹状体内注射KN-93（2 μg或5 μg）可降低左旋多巴预处理的PD大鼠中LID的表达。此外，KN-93治疗降低了pGluR1S845水平以及Gad1和Nur77的表达。我们推测KN-93可通过降低Gad1和Nur77的表达来改善LID的表达，进而降低PD大鼠中pGluR1S845的水平。[5]

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背景：姜黄素具有多种药理特性，包括抗炎作用。尽管先前的研究表明姜黄素对糖尿病视网膜病变有益，但其作用机制尚不清楚。为了解决这个问题，我们利用高糖刺激的培养视网膜Müller细胞，研究了姜黄素对糖尿病引起的视网膜血管损伤的影响及其作用机制。
方法：我们研究了姜黄素在链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠视网膜中的体内作用，以及在高糖刺激的Müller细胞中的体外作用。我们每天给实验动物注射姜黄素、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II (CaMKII) 抑制剂KN93或生理盐水，持续12周。将大鼠Müller细胞原代培养物在正常葡萄糖或高葡萄糖培养基中孵育，并分别加入或不加入姜黄素、KN93或核因子κB (NF-κB) 转录蛋白抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯 (PDTC)。我们分别采用实时定量PCR和Western blotting检测了血管内皮生长因子（VEGF）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的mRNA和蛋白水平。视网膜中CaMKII和NF-κB的水平也通过Western blotting检测。血管渗漏采用伊文思蓝染色法进行评估。
结果：姜黄素和KN93显著抑制了糖尿病或高血糖诱导的CaMKII/NF-κB信号通路的激活，进而降低了VEGF、iNOS和ICAM-1的表达。这些变化与糖尿病诱导的视网膜血管渗漏的减少相关。
结论：姜黄素通过抑制CaMKII活性，保护糖尿病大鼠视网膜免受早期视网膜血管损伤。姜黄素目前用于治疗多种临床疾病，可能对糖尿病视网膜病变的治疗有益。[4]

C26H30CL2N2O4S

537.5

536.13

C, 58.10; H, 5.63; Cl, 13.19; N, 5.21; O, 11.91; S, 5.96

1956426-56-4

KN-93 hydrochloride;1956426-56-4;KN-93 phosphate;1913269-12-1; 1188890-41-6 (phosphate); 139298-40-1

73425340

White to off-white solid powder

78.5

2

6

11

35

713

0

CN(C/C=C/C1=CC=C(C=C1)Cl)CC2=CC=CC=C2N(CCO)S(=O)(=O)C3=CC=C(C=C3)OC.Cl

ATHMCQDBXQEIOK-IPZCTEOASA-N

InChI=1S/C26H29ClN2O4S.ClH/c1-28(17-5-6-21-9-11-23(27)12-10-21)20-22-7-3-4-8-26(22)29(18-19-30)34(31,32)25-15-13-24(33-2)14-16-25;/h3-16,30H,17-20H2,1-2H3;1H/b6-5+

N-[2-[N-(4-Chlorocinnamyl)-N-methylaminomethyl]phenyl]-N-(2-hydroxyethyl)-4-methoxybenzenesulfonamide hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。