LDN-57444

UCH-L1(IC50=0.88 μM);UCH-L3(IC50=25 μM);UCH-L1(Ki=0.40 μM)

体外活性：用 50 μMLDN-57444 处理 24 小时，蛋白酶体活性抑制 70%。 LDN-57444 在浓度高于 25 μM 时会导致细胞活力显着且呈浓度依赖性下降，在 50 μM 时细胞活力下降至 61.81%。 LDN-57444能够通过细胞凋亡途径导致细胞死亡，通过降低泛素蛋白酶体系统的活性和增加高度泛素化蛋白的水平，这两者都可以激活未折叠蛋白反应。 LDN-57444 诱导的细胞凋亡可能是由内质网应激 (ERS) 的激活触发的。激酶测定：为了开始测定，将 0.5 μL 5 mg/mL 测试化合物（约 50 μM 最终反应浓度）或 DMSO 对照等分到每个孔中。酶和底物均在 UCH 反应缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 7.6]、0.5 mM EDTA、5 mM DTT 和 0.5 mg/mL 卵清蛋白）中制备。然后将 25 μL 0.6 nM UCH-L1 添加到除底物对照孔之外的每个孔中，然后在自动摇床上摇动板 45-60 秒。将酶/化合物混合物在室温下孵育 30 分钟，然后添加 25 μL 200 nM Ub-AMC 以启动酶反应。将反应混合物（300 pM UCH-L1、100 nM 泛素-AMC 和 2.5 μg 测试化合物）在室温下再孵育 30 分钟，然后每孔添加 10 μL 500 mM 乙酸来淬灭反应。使用香豆素滤光片组（ex = 365 nm，em = 450 nm）在 LJL Analyst 上测量荧光发射强度，并减去内在化合物荧光以揭示酶活性。 DMSO 对照（0.5 μL DMSO、25 μL UCH-L1、25 μL ubiquitin-AMC、10 μL 乙酸）、酶对照（25 μL UCH-L1、25 μL 缓冲液、10 μL 乙酸） ）、底物对照（25 μL 缓冲液、25 μL 泛素-AMC、10 μL 乙酸）和抑制剂对照（0.5 μL 泛素醛 [100 nM 库存]、25 μL UCH-L1、25 μL 泛素-AMC，10 μL 乙酸）也在每个测定板中进行，以确保质量和重现性。如果与对照相比，化合物表现出大于 60% 的抑制作用，则选择潜在的 UCH-L1 抑制剂。使用相同的方案手动重复 UCH-L1 酶促反应两次，以确认来自主要机器人辅助筛选的命中化合物的结果。细胞测定：MTT测定

LDN-57444 会导致体内突触蛋白分布和脊柱形态发生巨大变化。 LDN 治疗也会导致 Uch-L1 活性迅速下降，但蛋白酶体抑制在几个小时内对 cAMP 水平没有影响。

启动测定需要将 0.5 μL 5 mg/mL 测试化合物（例如 LDN-57444，其最终反应浓度约为 50 μM）或 DMSO 对照等分到每个孔中。 UCH 反应缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 7.6]、0.5 mM EDTA、5 mM DTT 和 0.5 mg/mL 卵清蛋白）用于制备酶和底物。接下来，向每个孔（底物对照孔除外）中添加 25 μL 0.6 nM UCH-L1，并在自动摇床上摇动板 45-60 秒。酶/化合物混合物在室温下孵育 30 分钟后，通过添加 25 μL 200 nM Ub-AMC 开始酶反应。在室温下再孵育 30 分钟后，反应混合物（300 pM UCH-L1、通过每孔添加 10 μL 500 mM 乙酸来淬灭含有 2.5 μg 测试化合物的 100 nM 泛素-AMC。使用 LJL Analyst 上的香豆素滤光片组（ex = 365 nm，em = 450 nm）测量荧光发射强度。然后减去内在化合物荧光以确定酶活性。为了确保质量和重现性，每个测定板还使用 DMSO 对照（0.5 μL DMSO、25 μL UCH-L1、25 μL 泛素-AMC、10 μL 乙酸）、酶对照（25 μL UCH-L1、25 μL 缓冲液、10 μL 乙酸）、底物对照（25 μL 缓冲液、25 μL 泛素-AMC、10 μL 乙酸）和抑制剂对照（0.5 μL 泛素醛 [100 nM 库存]、25 μL UCH-L1、25 μL 泛素-AMC、10 μL 乙酸）。为了验证来自主要机器人辅助筛选的命中化合物的结果，使用相同的方案手动重复 UCH-L1 酶促反应两次[1]。

使用 MTT 进行定量比色测定来测量细胞活力。给药后，将SK-N-SH细胞用5g/L MTT培养4小时，然后加入DMSO培养15分钟。在 570 nm 处，使用酶标仪测量吸光度[3]。

Every animal is put into the conditioning chamber on its own. The shock intensity is increased by 0.1 mA to 0.7 mA over a 30-second interval as the electric current is progressively increased. The first obvious reaction to the shock (flinch), the first strong motor response (run/jump), and the first vocalized distress (scream) are used to assess an animal's behavior. The threshold for each animal's flinching, jumping, and screaming is measured by taking the average of the shock intensity at which that animal exhibits that type of behavioral response to the foot shock. During visible platform training, participants' visual, motor, and motivational skills are also put to the test by timing how long it takes to get to a visible platform submerged in a water-filled pool.A video tracking system records and analyzes the swimming speed as well as the time it takes to reach the platform. In the experiments where fear conditioning is tested in the presence of both LDN-57444 (LDN) and TAT fusion proteins, no differences are seen between the groups of mice. In order to determine when LDN-57444 should be administered, a number of pilot studies are conducted in which the inhibitor is injected intraperitoneally at various times (4 hours prior to, 1 hour prior to, 1 hour following, and 4 hours following) from the electric shock. There is no difference in the freezing of mice injected with vehicle or LDN-57444 during the training phase.[2].

[1]. Discovery of inhibitors that elucidate the role of UCH-L1 activity in the H1299 lung cancer cell line. Chem Biol. 2003 Sep;10(9):837-46.

[2]. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 2006 Aug 25;126(4):775-88.

[3]. Endoplasmic reticulum stress contributes to the cell death induced by UCH-L1 inhibitor. Mol Cell Biochem. 2008 Nov;318(1-2):109-15.

C17H11CL3N2O3

397.64

395.98

C, 51.35; H, 2.79; Cl, 26.75; N, 7.04; O, 12.07

668467-91-2

Solid powder

ClC1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])C(C(N2C([H])([H])C1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1Cl)Cl)=O)=NOC(C([H])([H])[H])=O

OPQRFPHLZZPCCH-PGMHBOJBSA-N

InChI=1S/C17H11Cl3N2O3/c1-9(23)25-21-16-13-7-12(19)3-5-15(13)22(17(16)24)8-10-6-11(18)2-4-14(10)20/h2-7H,8H2,1H3/b21-16-

(Z)-3-(acetoxyimino)-5-chloro-1-(2,5-dichlorobenzyl)indolin-2-one.

LDN57444; LDN 57444; LDN-57444

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 11~25 mg/mL ( 27.66~62.87 mM)

Solubility in Formulation 1: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 900 μL of corn oil and mix evenly.

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Solubility in Formulation 2: 5% DMSO+Corn oil: 6mg/ml

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Solubility in Formulation 3: 10 mg/mL (25.15 mM) in 50% PEG300 50% Saline (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), suspension solution; with ultrasonication.
Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH₂ O to obtain a clear solution.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。