| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
|---|---|---|---|
| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
UCH-L1(IC50=0.88 μM);UCH-L3(IC50=25 μM);UCH-L1(Ki=0.40 μM)
LDN-57444 specifically targets ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) (IC50 = 2.3 μM for UCH-L1 deubiquitinating activity) [1] LDN-57444 shows weak inhibition of other deubiquitinating enzymes (UCH-L3: IC50 > 50 μM; USP14: IC50 > 100 μM; USP7: IC50 > 100 μM) [1] |
|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
用 50 μMLDN-57444 处理 24 小时，蛋白酶体活性抑制 70%。 LDN-57444 在浓度高于 25 μM 时会导致细胞活力显着且呈浓度依赖性下降，在 50 μM 时细胞活力下降至 61.81%。 LDN-57444能够通过细胞凋亡途径导致细胞死亡，通过降低泛素蛋白酶体系统的活性和增加高度泛素化蛋白的水平，这两者都可以激活未折叠蛋白反应。 LDN-57444 诱导的细胞凋亡可能是由内质网应激 (ERS) 的激活触发的。激酶测定：为了开始测定，将 0.5 μL 5 mg/mL 测试化合物（约 50 μM 最终反应浓度）或 DMSO 对照等分到每个孔中。酶和底物均在 UCH 反应缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 7.6]、0.5 mM EDTA、5 mM DTT 和 0.5 mg/mL 卵清蛋白）中制备。然后将 25 μL 0.6 nM UCH-L1 添加到除底物对照孔之外的每个孔中，然后在自动摇床上摇动板 45-60 秒。将酶/化合物混合物在室温下孵育 30 分钟，然后添加 25 μL 200 nM Ub-AMC 以启动酶反应。将反应混合物（300 pM UCH-L1、100 nM 泛素-AMC 和 2.5 μg 测试化合物）在室温下再孵育 30 分钟，然后每孔添加 10 μL 500 mM 乙酸来淬灭反应。使用香豆素滤光片组（ex = 365 nm，em = 450 nm）在 LJL Analyst 上测量荧光发射强度，并减去内在化合物荧光以揭示酶活性。 DMSO 对照（0.5 μL DMSO、25 μL UCH-L1、25 μL ubiquitin-AMC、10 μL 乙酸）、酶对照（25 μL UCH-L1、25 μL 缓冲液、10 μL 乙酸） ）、底物对照（25 μL 缓冲液、25 μL 泛素-AMC、10 μL 乙酸）和抑制剂对照（0.5 μL 泛素醛 [100 nM 库存]、25 μL UCH-L1、25 μL 泛素-AMC，10 μL 乙酸）也在每个测定板中进行，以确保质量和重现性。如果与对照相比，化合物表现出大于 60% 的抑制作用，则选择潜在的 UCH-L1 抑制剂。使用相同的方案手动重复 UCH-L1 酶促反应两次，以确认来自主要机器人辅助筛选的命中化合物的结果。细胞测定：MTT测定
在重组UCH-L1酶实验中，LDN-57444 剂量依赖性抑制去泛素化活性，IC50为2.3 μM，是一种可逆性抑制剂。它对UCH-L1具有高选择性，对其他DUB家族成员无显著抑制 [1] - 在H1299人肺癌细胞中，LDN-57444 表现出抗增殖活性，IC50为7.8 μM。处理72小时后，10 μM浓度使细胞活力较溶媒对照组降低62% [1] - 在暴露于β-淀粉样蛋白（Aβ）寡聚体（1 μM）的原代大鼠海马神经元中，LDN-57444（5 μM）加剧Aβ诱导的突触功能损伤。与单纯Aβ处理组相比，场兴奋性突触后电位（fEPSP）振幅额外降低35%，突触前小泡数量减少 [2] - 在H1299细胞中，LDN-57444（8 μM）处理24小时后诱导内质网（ER）应激，表现为ER应激标志物CHOP（较对照组增加3.1倍）和BIP（较对照组增加2.8倍）上调。处理48小时后，胱天蛋白酶-3/7活性提高2.6倍，膜联蛋白V阳性凋亡细胞比例从3%升至31% [3] |
| 体内研究 (In Vivo) |
LDN-57444 会导致体内突触蛋白分布和脊柱形态发生巨大变化。 LDN 治疗也会导致 Uch-L1 活性迅速下降，但蛋白酶体抑制在几个小时内对 cAMP 水平没有影响。
在脑室内注射Aβ寡聚体（1 μg/只）的C57BL/6小鼠中，腹腔注射 LDN-57444（10 mg/kg，每日一次，持续7天）加剧情境记忆损伤。情境恐惧条件反射测试中，与Aβ注射+溶媒处理组相比，冻结时间减少42%。电生理记录显示海马突触传递（fEPSP振幅）降低38% [2] - 在荷H1299肺癌异种移植瘤的裸鼠中，腹腔注射 LDN-57444（15 mg/kg，每周两次，持续3周），与溶媒对照组相比肿瘤生长抑制58%。肿瘤组织中多聚泛素化蛋白水平增加2.4倍，胱天蛋白酶-3激活（裂解型胱天蛋白酶-3水平增加2.2倍）[1] |
| 酶活实验 |
启动测定需要将 0.5 μL 5 mg/mL 测试化合物（例如 LDN-57444，其最终反应浓度约为 50 μM）或 DMSO 对照等分到每个孔中。 UCH 反应缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 7.6]、0.5 mM EDTA、5 mM DTT 和 0.5 mg/mL 卵清蛋白）用于制备酶和底物。接下来，向每个孔（底物对照孔除外）中添加 25 μL 0.6 nM UCH-L1，并在自动摇床上摇动板 45-60 秒。酶/化合物混合物在室温下孵育 30 分钟后，通过添加 25 μL 200 nM Ub-AMC 开始酶反应。在室温下再孵育 30 分钟后，反应混合物（300 pM UCH-L1、通过每孔添加 10 μL 500 mM 乙酸来淬灭含有 2.5 μg 测试化合物的 100 nM 泛素-AMC。使用 LJL Analyst 上的香豆素滤光片组（ex = 365 nm，em = 450 nm）测量荧光发射强度。然后减去内在化合物荧光以确定酶活性。为了确保质量和重现性，每个测定板还使用 DMSO 对照（0.5 μL DMSO、25 μL UCH-L1、25 μL 泛素-AMC、10 μL 乙酸）、酶对照（25 μL UCH-L1、25 μL 缓冲液、10 μL 乙酸）、底物对照（25 μL 缓冲液、25 μL 泛素-AMC、10 μL 乙酸）和抑制剂对照（0.5 μL 泛素醛 [100 nM 库存]、25 μL UCH-L1、25 μL 泛素-AMC、10 μL 乙酸）。为了验证来自主要机器人辅助筛选的命中化合物的结果，使用相同的方案手动重复 UCH-L1 酶促反应两次[1]。
UCH-L1去泛素化活性实验：将纯化的重组人UCH-L1与泛素-AMC（荧光底物）和 LDN-57444（0.1 μM-50 μM）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM DTT，0.1 mg/mL BSA）中于37°C孵育60分钟。检测荧光强度（激发光360 nm，发射光460 nm）以定量去泛素化程度，从剂量-效应抑制曲线计算IC50值 [1] - DUB选择性实验：将重组UCH-L3、USP14、USP7和UCH-L5与各自的荧光底物和 LDN-57444（0.1 μM-100 μM）在最适反应条件下孵育，定量去泛素化活性以评估交叉反应性 [1] |
| 细胞实验 |
使用 MTT 进行定量比色测定来测量细胞活力。给药后，将SK-N-SH细胞用5g/L MTT培养4小时，然后加入DMSO培养15分钟。在 570 nm 处，使用酶标仪测量吸光度[3]。
抗增殖实验：H1299肺癌细胞以3×10³个/孔接种到96孔板中，培养24小时。加入浓度为0.5-50 μM的 LDN-57444，孵育72小时。MTT法评估细胞活力，推导IC50值 [1] - 突触功能实验：从18日龄胚胎大鼠中分离原代海马神经元，培养14天。用 LDN-57444（5 μM）预处理神经元1小时，随后暴露于Aβ寡聚体（1 μM）24小时。电生理技术记录场兴奋性突触后电位（fEPSPs），免疫荧光分析突触前小泡密度 [2] - 内质网应激和凋亡实验：H1299细胞以2×10⁵个/孔接种到6孔板中，用 LDN-57444（8 μM）处理24-48小时。Western blot检测内质网应激标志物（CHOP、BIP），荧光素酶试剂盒检测胱天蛋白酶-3/7活性，膜联蛋白V-FITC/PI染色定量凋亡细胞 [3] |
| 动物实验 |
每只动物单独放入条件反射箱中。在30秒的时间间隔内，电流强度以0.1 mA至0.7 mA的增量逐步增加。通过观察动物对电击的首次明显反应（畏缩）、首次强烈的运动反应（奔跑/跳跃）以及首次发出痛苦的叫声（尖叫）来评估其行为。每只动物畏缩、跳跃和尖叫的阈值通过计算该动物对足部电击产生相应行为反应时的平均电击强度来确定。在可见平台训练中，通过记录动物游到注满水池中可见平台所需的时间，来测试参与者的视觉、运动和动机能力。视频追踪系统记录并分析游泳速度以及到达平台所需的时间。在同时存在LDN-57444 (LDN) 和TAT融合蛋白的情况下进行恐惧条件反射测试的实验中，各组小鼠之间未观察到差异。为了确定 LDN-57444 的最佳给药时间，研究人员进行了一系列预实验，在电击后不同时间点（电击前 4 小时、电击前 1 小时、电击后 1 小时和电击后 4 小时）腹腔注射该抑制剂。在训练阶段，注射载体或 LDN-57444 的小鼠的冻结反应没有差异。[2]。
小鼠（Aβ 诱导的突触和记忆障碍模型）：将 8 周龄 C57BL/6 小鼠麻醉后，脑室内注射 Aβ 寡聚体（1 μg/只）。LDN-57444 溶于 DMSO，并用生理盐水稀释（最终 DMSO 浓度 ≤5%），从 Aβ 注射后 1 天开始，每天腹腔注射 10 mg/kg，连续 7 天。载体对照组小鼠注射 DMSO/生理盐水混合物。采用情境恐惧条件反射评估记忆，并通过电生理学方法测量海马突触传递[2] - 裸鼠（H1299异种移植模型）：将6-8周龄的裸鼠皮下接种H1299细胞（5×10⁶个细胞/只）。当肿瘤体积达到约100 mm³时，小鼠接受LDN-57444（15 mg/kg，腹腔注射，每周两次，持续3周）或载体处理。每3天测量一次肿瘤体积，并切除肿瘤进行多聚泛素化蛋白和裂解型caspase-3的Western blot分析[1] |
| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
体外实验表明，LDN-57444 对正常人肺成纤维细胞的毒性较低（IC50 > 30 μM），提示其在癌细胞和正常细胞之间存在治疗窗口[1]。体内实验表明，在测试剂量（10-15 mg/kg，腹腔注射）下，LDN-57444 未引起小鼠显著的体重下降（与基线相比变化≤5%）或明显的毒性[1][2]。与载体对照组相比，LDN-57444 治疗组小鼠的肝功能（ALT、AST）或肾功能（肌酐、BUN）均未见显著变化[1][2]。LDN-57444 在小鼠体内的血浆蛋白结合率为 90-93%（体外血浆结合试验）[1]。
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| 参考文献 |
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| 其他信息 |
LDN-57444是一种强效、选择性可逆的UCH-L1抑制剂，UCH-L1是一种去泛素化酶，参与蛋白质稳态、突触功能和肿瘤进展[1][2]
- 其作用机制是与UCH-L1的活性位点结合，抑制其去泛素化活性，导致癌细胞中多泛素化蛋白的积累、内质网应激和细胞凋亡[1][3] - LDN-57444通过抑制UCH-L1加剧小鼠Aβ诱导的突触功能障碍和记忆障碍，凸显了UCH-L1在对抗淀粉样蛋白病理的神经保护作用[2] - 该化合物被广泛用作研究UCH-L1在癌症生物学和神经退行性疾病（例如阿尔茨海默病）中功能的工具化合物[1][2][3] - LDN-57444在体内对肺癌异种移植瘤表现出抗肿瘤活性，支持UCH-L1作为癌症治疗的潜在靶点[1] |
| 分子式 |
C17H11CL3N2O3
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|---|---|---|
| 分子量 |
397.64
|
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| 精确质量 |
395.983
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| 元素分析 |
C, 51.35; H, 2.79; Cl, 26.75; N, 7.04; O, 12.07
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| CAS号 |
668467-91-2
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| 相关CAS号 |
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| PubChem CID |
16760696
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| 外观&性状 |
Light yellow to yellow solid powder
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| 密度 |
1.5±0.1 g/cm3
|
|
| 沸点 |
534.4±60.0 °C at 760 mmHg
|
|
| 闪点 |
277.0±32.9 °C
|
|
| 蒸汽压 |
0.0±1.4 mmHg at 25°C
|
|
| 折射率 |
1.655
|
|
| LogP |
4.7
|
|
| tPSA |
58.97
|
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
0
|
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
4
|
|
| 可旋转键数目(RBC) |
4
|
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| 重原子数目 |
25
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| 分子复杂度/Complexity |
571
|
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
|
| SMILES |
ClC1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])C(C(N2C([H])([H])C1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1Cl)Cl)=O)=NOC(C([H])([H])[H])=O
|
|
| InChi Key |
OPQRFPHLZZPCCH-PGMHBOJBSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C17H11Cl3N2O3/c1-9(23)25-21-16-13-7-12(19)3-5-15(13)22(17(16)24)8-10-6-11(18)2-4-14(10)20/h2-7H,8H2,1H3/b21-16-
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|
| 化学名 |
(Z)-3-(acetoxyimino)-5-chloro-1-(2,5-dichlorobenzyl)indolin-2-one.
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| 别名 |
LDN57444; LDN 57444; LDN-57444
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
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| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : 11~25 mg/mL ( 27.66~62.87 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。 配方 2 中的溶解度: 5% DMSO+Corn oil: 6mg/ml View More
配方 3 中的溶解度: 10 mg/mL (25.15 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.5148 mL | 12.5742 mL | 25.1484 mL | |
| 5 mM | 0.5030 mL | 2.5148 mL | 5.0297 mL | |
| 10 mM | 0.2515 mL | 1.2574 mL | 2.5148 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
Ubiquitin thiolesterase UCHL1
USP30-IN-20
WCY-8-67
Huib32
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