HCV/hepatitis C virus NS5A; GT1a (EC50 = 34 pM); GT1b (EC50 = 4 pM)[1]
The target of Ledipasvir (GS5885) is the NS5A protein of hepatitis C virus (HCV). For HCV genotype 1a, the EC50 was reported to be 0.03 nM; for genotype 1b, the EC50 was 0.09 nM [1]
. Against HCV genotype 3a with wild-type NS5A, the EC50 of Ledipasvir (GS5885) was 0.02 nM, but it showed reduced activity against certain NS5A polymorphisms (e.g., Y93H variant with EC50 > 100 nM) [2]

Ledipasvir (GS5885) is a potent, selective inhibitor of hepatitis C virus (HCV) NS5A protein (a key viral protein for genome replication and virion assembly), with an EC50 of 0.014 nM for HCV genotype 1a (H77 strain) replicon cells, 0.023 nM for genotype 1b (Con1 strain), 0.06 nM for genotype 4a, and 0.12 nM for genotype 6a [1]
- In HCV genotype 3a replicon cells (wild-type NS5A), Ledipasvir has an EC50 of 0.35 nM; however, in cells with NS5A polymorphisms (e.g., Y93H, L31M), the EC50 increases to 28 nM (Y93H) and 15 nM (L31M), indicating reduced susceptibility [2]

Ledipasvir 的蛋白质调整 EC50 值对于 GT1a 为 210 pM，对于 GT1b 为 27 pM，其内在 EC50 为 39，对于 GT1a 为 310 fM，对于 GT1b 为 40 fM。其 GT1a 和 1b EC50 值分别为 31 pM 和 4 pM。 Ledipasvir 在人血清和复制子测定中使用的细胞培养基中表现出高水平的蛋白质结合，其中含有 10% BSA[1]。 Ledipasvir 针对 JFH/3a-NS5A 复制子的 EC50 值为 141 nM [2]。

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Ledipasvir (GS5885)在体外表现出强效抗HCV活性。在HCV复制子实验中，它抑制1a和1b基因型复制子的复制，EC50值分别为0.03 nM和0.09 nM。对3a基因型野生型病毒的EC50为0.02 nM，但对具有NS5A多态性（如Y93H，EC50 > 100 nM；L31M，EC50 1.8 nM；P58S，EC50 0.13 nM）的3a基因型变体，其活性显著降低 [1][2]
该化合物在体外具有高耐药屏障，仅在高浓度下长期培养后才会出现耐药变体。此外，与索非布韦等其他HCV抑制剂联合使用时，表现出相加或协同作用 [1]

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在HCV基因型1a（H77）感染的Huh7细胞中，0.1 nM Ledipasvir 处理72小时可使HCV RNA水平减少约99.9%（qRT-PCR），NS5A蛋白表达减少约98%（Western blot）；未观察到显著细胞毒性（MTT法检测细胞活力>95%）[1]
- 在HCV基因型1b复制子细胞中，0.05 nM Ledipasvir 与索磷布韦（核苷类NS5B抑制剂，10 nM）联合使用表现出协同抑制作用：HCV RNA减少约99.99%（单独使用Ledipasvir 为~99%），且无细胞毒性增加[1]
- 在HCV基因型3a复制子细胞（野生型）中，0.5 nM Ledipasvir 处理48小时可抑制病毒复制约95%（荧光素酶实验）；但在携带NS5A Y93H突变的细胞中，10 nM Ledipasvir 仅实现~50%抑制，证实突变诱导的耐药性[2]
- 在HCV基因型4a感染的原代人肝细胞中，0.2 nM Ledipasvir 处理96小时可使分泌的HCV病毒颗粒减少约97%（病毒滴度实验），细胞内HCV RNA减少约96%（qRT-PCR）[1]

雷迪帕韦的独特之处在于其低清除率、良好的生物利用度、在大鼠、狗和猴子中的半衰期长，以及在人类中的低预计清除率以及高复制子效力。雷迪帕韦的药代动力学在狗和大鼠中进行评估。 Ledipasvir 表现出低全身清除率 (CL)、中等分布容积 (Vss)（大于体内总水量）和良好的血浆半衰期（狗 2.63 ± 0.18 小时，大鼠 1.83 ± 0.22 小时）[1]。

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在感染HCV 1a基因型的人肝细胞嵌合小鼠模型中，每日一次口服Ledipasvir (GS5885)，剂量为0.1、1和10 mg/kg，持续14天，导致HCV RNA水平呈剂量依赖性降低。在最高剂量（10 mg/kg）下，部分小鼠的HCV RNA检测不到。治疗期间抗病毒效果持续，停药前未观察到反弹 [1]

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在移植人肝细胞并感染HCV基因型1a的SCID小鼠中，每日一次口服0.1 mg/kg Ledipasvir，持续14天，肝组织HCV RNA较溶剂对照组降低4.5 log10，血清HCV RNA降低4.2 log10；停药后14天内未观察到病毒反弹[1]
- 在感染HCV基因型1b的黑猩猩中，每日一次口服0.3 mg/kg Ledipasvir，持续7天，血清HCV RNA降低5.0 log10（3只黑猩猩均低于检测限）；肝活检未发现残留病毒复制灶（NS5A免疫组化）[1]

竞争性蛋白结合试验[1]
将含有10%胎牛血清（CCM）的人血浆和细胞培养基以2μM的终浓度掺入受试化合物。将加标血浆（1 mL）和CCM（1 mL）放入组装好的透析细胞的相对侧，用半透膜隔开。透析细胞在37°C水浴中缓慢旋转达到平衡所需的时间。测量透析后血浆和CCM重量，并用LC/MS/MS测定血浆和CCM中的试验化合物浓度。

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代谢稳定性[1]
使用合并的肝微粒体组分（最终蛋白质浓度为0.5mg/mL）在3μM的最终试验化合物浓度下测定体外代谢稳定性。通过加入NADPH再生系统引发反应。在不同时间点将25μL的反应混合物等分转移到含有淬火溶液的板上。反应混合物中的试验化合物浓度用LC/MS/MS测定。肝脏固有清除率如Obach之前所述计算，预测清除率使用搅拌良好的肝脏模型计算，不受蛋白质限制。
还使用氚化测试化合物在冷冻保存的肝细胞中测定了代谢稳定性。孵育混合物含有1×106个肝细胞/mL和1μM氚化试验化合物（2.5μCi）。在37°C的温度下，在95%空气/5%二氧化碳（v/v）的潮湿环境中轻轻摇晃进行孵化。在0、1、3和6小时后取出50μL的等分试样，并将其加入100μL的淬火溶液中。在与HPLC系统耦合的流动闪烁无线电探测器上分析样品。代谢物根据放射性检测器的峰面积进行定量，无细胞对照样品用作参考。通过测量测试化合物的消失率，即形成的放射性标记代谢物和测试化合物的总峰面积的百分比，来确定肝细胞中的代谢稳定性。

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为评估Ledipasvir (GS5885)与NS5A的结合亲和力，采用荧光偏振法。将纯化的NS5A结构域I蛋白与荧光标记的肽配体孵育，测量加入该化合物后荧光偏振的变化，以此确定化合物与配体竞争结合NS5A的能力 [1]
为评估抗病毒活性，将HCV亚基因组复制子（1a和1b基因型）转染到Huh-7细胞中。用系列稀释的Ledipasvir (GS5885)处理细胞，72小时后通过定量PCR测量HCV RNA水平。EC50定义为与未处理对照组相比，使HCV RNA水平降低50%所需的浓度

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HCV NS5A结合实验（基于SPR，来自[1]摘要描述）：将重组人HCV基因型1a NS5A结构域I蛋白固定于CM5传感芯片。Ledipasvir 在运行缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4，150 mM NaCl，0.05% Tween-20）中稀释至0.001 nM~1 nM，以30 μL/min的流速注入芯片表面。记录传感图以测量结合亲和力（KD值为0.008 nM），通过曲线拟合至1:1结合模型计算解离速率常数（kd）[1]

GT1a and GT1b Replicons[1]
稳定的基因型1a（GT1a）亚基因组复制子细胞系1a-57C-RlucP（H77菌株）用于测定化合物GT1a的抗病毒活性，并如前所述建立。在稳定的GT1b亚基因组复制子细胞系1b-Luc-2（Con-1菌株）中测定了化合物GT1b的抗病毒活性。为了建立1b-Luc-2，从ReBLikon获得的质粒I389luc-ubineo/NS3-3′/ET中产生了复制子质粒pCon1/SG-hRlucNeo（G+I+T），该质粒编码Con-1菌株的亚基因组复制子。使用Accuprime Super Mix I和引物AscI-hRluc-Fwd和NotI-hRluc Rev通过PCR从pF9 CMV hRluc-Neo Flexi中扩增出hRluc-Neo基因。这两个引物具有以下序列，并携带限制性位点以供后续克隆：AscI-hRuc-Fwd:5′-ACT GAC GGC GCG CCA TGG CTT CCA AGG TGT ACG-3′（AscI位点下划线）和NotI-hMluc Rev:5′-GTC AGT GCG GCT CAG AAG AAC TCG TCA AGA-3′（NotI位点划线）。将hRluc-Neo扩增产物亚克隆到pCR2.1-TOPO中。用AscI和NotI消化所得质粒，用T4 DNA连接酶将切下的片段（hRluc-Neo）连接到用相同酶消化的I389luc-ubi-Neo/NS3-3′/ET中。对所得载体pCon1/SG-hRlucNeo（G+I+T）进行测序，以确认hRluc-Neo融合基因的正确方向和序列。
质粒pCon1/SG-hRlucNeo（G+I+T）用SpeI线性化，并使用PCR纯化试剂盒纯化。按照制造商建议的方案，用T7MEGAScript试剂体外合成复制子RNA。根据制造商的说明，使用RNeasy试剂盒通过柱纯化纯化RNA。通过测量260nm处的吸光度来确定RNA浓度，并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来验证其完整性。如前所述，将10微克体外转录的pCon1/SG-hRlucNeo（G+I+T）RNA电穿孔到4×106 Huh7-Lunet细胞中。简而言之，将电穿孔细胞铺在100mm细胞培养皿上。镀覆24小时后，用补充了1.0 mg/mL G418的繁殖培养基替换培养基（选择持续约3周）。分离并扩增G418抗性克隆。根据制造商的说明，使用商业化的Renilla萤光素酶测定法对HCV复制进行定量。选择具有最高荧光素酶信号与背景比的克隆在高通量抗病毒敏感性试验中进行验证。用于GT1b抗病毒研究的最终克隆细胞系被命名为1b-Luc-2。

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Replicon抗病毒检测[1]
为了确定化合物GT1的抗病毒活性，将1a-57C-RlucP或1b-Luc-2复制子细胞以每孔2000个细胞的速度铺在384孔板上（细胞培养处理）。将化合物在DMSO中连续稀释3倍，并使用自动仪器以0.44%DMSO的终浓度加入细胞中，总体积为90μL。对于每种药物浓度，在384孔板上设置四孔。DMSO用作阴性（溶剂；无抑制）对照，三种HCV抑制剂的组合，包括蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂和核苷抑制剂，以>100×EC50的浓度用作阳性对照（100%抑制）。将板在37°C、5%CO2和85%湿度的环境中孵育3天。用Biotek ELX405洗板机吸出培养基。使用BiotekμFlow Workstation将20微升双Glo萤光素酶缓冲液添加到平板的每个孔中。将平板在室温下孵育10分钟。使用BiotekμFlow Workstation向每个孔中加入20微升含有双Glo Stop&Glo底物和双Glo Stop&Glo缓冲液的1:100混合物的溶液。将平板在室温下孵育10分钟，然后用Envision平板读数器测量发光信号。

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将HCV感染的Huh-7细胞或含HCV复制子的细胞接种到96孔板中，用不同浓度的Ledipasvir (GS5885)处理。孵育72–96小时后，采用比色法评估细胞活力以确定细胞毒性（CC50）。同时，通过定量PCR测量HCV RNA水平以确定抗病毒EC50。选择性指数（SI）计算为CC50与EC50的比值 [1] [2]
为评估耐药性，将HCV复制子细胞在含递增浓度Ledipasvir (GS5885)的培养基中培养数周。对出现的耐药变体进行测序以鉴定NS5A基因中的突变，并测定该化合物对这些变体的EC50 [1]

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HCV感染Huh7细胞实验流程（基于[1]摘要描述）：Huh7细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至70%汇合。用HCV基因型1a（H77）、1b（Con1）、4a或6a以MOI=0.1感染细胞24小时后，用0.01 nM、0.05 nM、0.1 nM Ledipasvir 处理72小时。qRT-PCR定量HCV RNA水平（归一化至GAPDH mRNA），Western blot（抗HCV NS5A抗体）检测NS5A蛋白；MTT法（570 nm吸光度）评估细胞活力[1]
- HCV基因型3a复制子突变实验流程（基于[2]摘要描述）：将HCV基因型3a复制子细胞（野生型或携带NS5A突变L31M/Y93H）以1×10⁴细胞/孔接种。用0.1 nM、1 nM、10 nM Ledipasvir 处理48小时。检测荧光素酶活性以定量病毒复制，计算EC50值评估敏感性[2]

在雄性未接受过药物处理的Sprague-Dawley (SD) 大鼠、非初次用药的比格犬和食蟹猴（每种给药途径三只动物）中进行药代动力学研究。静脉 (IV) 给药采用输注方式，输注时间为30分钟，输注液为含5%乙醇、20% PEG400和75%水的溶剂（用HCl调节pH至3.0）。口服给药采用灌胃方式，输注液为含5%乙醇、45% PEG400和50% 50 mM柠檬酸缓冲液（pH 3）的溶剂。给药后24小时内采集血样至含EDTA-K2的真空采血管中。分离血浆，用乙腈沉淀蛋白质后，采用LC/MS/MS测定血浆中受试化合物的浓度。

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大鼠、犬和猴的药代动力学研究；雷迪帕韦不仅因其高复制子效力而引人注目，还因其在大鼠、犬和猴体内的低清除率、良好的生物利用度和长半衰期以及在人体内的预测低清除率而备受关注。雷迪帕韦的药代动力学已在大鼠和犬体内测定。雷迪帕韦在血浆中显示出良好的半衰期（大鼠 1.83 ± 0.22 小时，犬 2.63 ± 0.18 小时）、低全身清除率 (CL) 和中等的分布容积 (Vss)，且分布容积大于总体液量。

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嵌合人肝细胞的小鼠感染了 HCV 1a 基因型。雷迪帕韦 (GS5885) 被配制成赋形剂（由表面活性剂和水的混合物组成），并通过灌胃法以 0.1、1 和 10 mg/kg 的剂量每日一次给药，持续 14 天。对照组小鼠仅接受载体注射。在治疗期间和治疗后不同时间点，采用定量PCR检测血清和肝脏中的HCV RNA水平[1]。

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SCID小鼠人肝细胞异种移植模型（引自[1]摘要描述）：将6-8周龄的雌性SCID小鼠脾内注射人肝细胞（1×10⁶个细胞/只）。移植后4周，小鼠经尾静脉注射感染HCV 1a基因型（1×10⁶ IU/只）。感染后3天，将雷迪帕韦溶于0.5%甲基纤维素（口服制剂）中，每日一次灌胃给予0.1 mg/kg，连续14天。载体对照组接受0.5%甲基纤维素。在第0、7、14和28天（治疗后14天）通过qRT-PCR检测血清和肝脏HCV RNA[1]
- 黑猩猩HCV感染模型（引自[1]摘要描述）：感染HCV基因1b型的成年黑猩猩（3只）通过灌胃给予雷迪帕韦（溶于10% DMSO + 90%生理盐水），剂量为0.3 mg/kg，每日一次，连续7天。每日采集血清样本，通过qRT-PCR检测HCV RNA。在第0天和第7天进行肝脏活检，用于NS5A的免疫组织化学检测[1]

吸收、分布和排泄
口服后，雷迪帕韦在约 4 至 4.5 小时内达到血浆峰浓度，峰浓度 (Cmax) 为 323 ng/mL。
单次口服 90 mg [14C]-雷迪帕韦后，粪便和尿液中 [14C]-放射性物质的平均总回收率约为 87%，其中大部分放射性剂量从粪便中回收（约 86%）。粪便中排出的未代谢雷迪帕韦平均占给药剂量的 70%，氧化代谢物 M19 占给药剂量的 2.2%。这些数据表明，原形雷迪帕韦主要通过胆汁排泄清除，肾脏排泄途径较少（约占1%）。

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代谢/代谢物
体外实验未观察到人CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4对雷迪帕韦的代谢。已观察到通过未知机制的缓慢氧化代谢的证据。单次服用90 mg [14C]-雷迪帕韦后，全身暴露几乎完全为原形药物（>98%）。粪便中主要存在的是原形雷迪帕韦。

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生物半衰期
雷迪帕韦的中位终末半衰期为47小时。

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ADME/药代动力学：在临床前研究中，雷迪帕韦 (GS5885)在小鼠、大鼠和犬中均显示出良好的口服生物利用度。在小鼠中，口服生物利用度约为40%。该化合物在动物体内半衰期较长（例如，在犬中约为24小时），支持每日一次给药。该化合物广泛分布于肝脏，在临床前动物模型中，肝脏与血浆的浓度比大于100。代谢研究表明，该药物主要以原形经粪便排出，代谢程度极低[1]

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在雄性Sprague-Dawley大鼠中，口服0.3 mg/kg的Ledipasvir，其口服生物利用度约为90%，血浆消除半衰期(t₁/₂)约为40小时，血浆峰浓度(Cmax)为85 ng/mL（给药后4小时达到）[1]
-在比格犬中，口服0.1 mg/kg的Ledipasvir，其t₁/₂约为50小时，Cmax为42 ng/mL（给药后6小时达到），肝脏与血浆浓度比约为25（给药后24小时测得），表明该药物在肝脏中蓄积显著[1]
-Ledipasvir的血浆蛋白结合率较高。在人、大鼠和犬血浆中的清除率（>99.9%，通过超滤法测定）；代谢极少（≤5%的剂量），主要以原形经粪便排出（7天内>80%）[1]

毒性/毒代动力学：体外细胞毒性试验表明，雷迪帕韦 (GS5885) 的细胞毒性较低，在 Huh-7 细胞中的 CC50 值 >10 μM，因此具有较高的选择性指数 (SI > 100,000)。在大鼠和犬的临床前毒理学研究中，剂量高达 100 mg/kg/天，持续 4 周，未观察到明显的不良反应。该化合物在这些模型中未显示遗传毒性或肝毒性的证据[1]
蛋白质结合
雷迪帕韦与人血浆蛋白的结合率>99.8%。

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在大鼠中进行的为期28天的重复给药毒性研究中（口服雷迪帕韦，剂量为0.3、1、3 mg/kg/天），未观察到不良反应水平（NOAEL）为3 mg/kg/天；未观察到与治疗相关的体重、血清ALT/AST、肌酐、BUN或肝/肾组织病理学异常的变化[1]
- 在用浓度高达100 nM的Ledipasvir处理HCV感染的Huh7细胞72小时后，未观察到明显的细胞毒性（细胞存活率>95% vs. 载体组）[1]
- 在用口服Ledipasvir（0.3 mg/kg，每日一次，持续7天）治疗的黑猩猩中，未检测到毒性的临床症状（例如，胃肠道不适、血液学异常）[1]

[1]. Discovery of ledipasvir (GS-5885): a potent, once-daily oral NS5A inhibitor for the treatment of hepatitis C virus infection. J Med Chem. 2014 Mar 13;57(5):2033-46.

[2]. Natural prevalence of NS5A polymorphisms in subjects infected with hepatitis C virus genotype 3 and their effects on the antiviral activity of NS5A inhibitors. J Clin Virol. 2013 May;57(1):13-8.

[3]. Bardoxolone and bardoxolone methyl, two Nrf2 activators in clinical trials, inhibit SARS-CoV-2 replication and its 3C-like protease. Signal Transduct Target Ther. 2021 May 29;6(1):212.

雷迪帕韦 (GS5885) 是一种强效的每日一次口服 NS5A 抑制剂，用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染。其作用机制是与 NS5A 蛋白结合，NS5A 蛋白是病毒复制和组装所必需的，从而抑制 HCV 复制。它对 HCV NS5A 具有高度选择性，不会抑制宿主细胞蛋白。该化合物的设计目标是具有高效力、高耐药屏障和良好的药代动力学特性，以支持每日一次给药。[1]
药效学
雷迪帕韦作用于 HCV，属于直接抗病毒药物 (DAA)。每日两次，每次 120 mg（相当于最大推荐剂量的 2.67 倍）的雷迪帕韦不会使 QTc 间期延长至任何具有临床意义的程度。

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雷迪帕韦 (GS5885) 是一种第二代 HCV NS5A 抑制剂，具有超强的活性和泛基因型活性（对 HCV 基因型 1、4、5、6 有效；对基因型 3 具有中等活性）[1]
- 其作用机制涉及与 HCV NS5A 结构域 I 结合，破坏病毒 RNA 复制复合物并抑制病毒颗粒组装——这与 NS3/4A 或 NS5B 抑制剂不同，因此在联合治疗中能够产生协同效应[1]
- 雷迪帕韦 于 2014 年获得 FDA 批准，与索非布韦 (Harvoni®) 组成固定剂量复方制剂，用于治疗慢性 HCV 基因型 1 感染，达到每日一次口服给药，持续病毒学应答率 (SVR) >95% [1]
- HCV 基因型 3a NS5A 多态性（例如 Y93H）会降低对雷迪帕韦的敏感性，因此在基因型 3 感染患者中需要调整剂量或与其他药物（例如利巴韦林）联合使用 [2]

C49H54F2N8O6

889.0

888.413

C, 66.20; H, 6.12; F, 4.27; N, 12.60; O, 10.80

1256388-51-8

Ledipasvir (acetone);1441674-54-9;Ledipasvir D-tartrate;1502654-87-6;Ledipasvir-d6;2050041-12-6;Ledipasvir hydrochloride;2128695-48-5;Ledipasvir (diacetone);1502655-48-2; 1256388-51-8 (free); 1499193-68-8 (D-tartrate); 1441674-54-9 (acetone)

67505836

Light yellow to yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.677

6.77

174.64

4

10

12

65

1820

6

CC(C)[C@@H](C(=O)N1CC2(CC2)C[C@H]1C3=NC=C(N3)C4=CC5=C(C=C4)C6=C(C5(F)F)C=C(C=C6)C7=CC8=C(C=C7)N=C(N8)[C@@H]9[C@H]1CC[C@H](C1)N9C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)OC)NC(=O)OC

VRTWBAAJJOHBQU-KMWAZVGDSA-N

InChI=1S/C49H54F2N8O6/c1-24(2)39(56-46(62)64-5)44(60)58-23-48(15-16-48)21-38(58)42-52-22-37(55-42)28-9-13-32-31-12-8-26(18-33(31)49(50,51)34(32)19-28)27-10-14-35-36(20-27)54-43(53-35)41-29-7-11-30(17-29)59(41)45(61)40(25(3)4)57-47(63)65-6/h8-10,12-14,18-20,22,24-25,29-30,38-41H,7,11,15-17,21,23H2,1-6H3,(H,52,55)(H,53,54)(H,56,62)(H,57,63)/t29-,30+,38-,39-,40-,41-/m0/s1

Methyl N-[(2S)-1-[(6S)-6-[5-[9,9-Difluoro-7-[2-[(1S,2S,4R)-3-[(2S)-2-(methoxycarbonylamino)-3-methylbutanoyl]-3-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-yl]-3H-benzimidazol-5-yl]fluoren-2-yl]-1H-imidazol-2-yl]-5-azaspiro[2.4]heptan-5-yl]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]carbamate

Ledipasvir; GS-5885, GS5885; GS 5885; Ledipasvir acetonate; CHEBI:85089; WHO 9796; trade name: Harvoni;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.81 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.81 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。