EGFR (IC50 = 29 nM); BRaf^V600E (IC50 = 23 nM); EGFR^L858R/T790M (IC50 = 495 nM)

体外活性：BGB-283 在体外有效抑制 BRAFV600E 激活的 ERK 磷酸化和细胞增殖。它具有选择性细胞毒性，并优先抑制携带 BRAFV600E 和 EGFR 突变/扩增的癌细胞的增殖。在 BRAFV600E 结直肠癌细胞系中，BGB-283 有效抑制 EGFR 的再激活和 EGFR 介导的细胞增殖。它表现出对含有 BRAFV600E 或 EGFR 突变的细胞系的选择性细胞毒性。 BGB-283 以剂量依赖性方式抑制 A431 细胞中 EGF 诱导的 Tyr1068 上的 EGFR 自磷酸化。在WiDr结直肠癌细胞中，BGB-283被证明能够抑制EGFR信号传导的反馈激活，并实现对pERK的持续抑制。激酶测定：在生化测定中，Lifirafenib (BGB-283) 抑制 RAF 激酶和 EGFR 活性，对于重组 BRAFV600E 激酶结构域、EGFR 和 EGFR T790M/L858R 突变体的 IC50 值为 23、29 和 495 nM。在基于时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 方法的测定中，测试了化合物对 RAF 和 WT EGFR 激酶活性的抑制作用。 MEK1 (K97R) 用作 RAF 激酶的底物，生物素化肽底物用作 EGFR (61TK0BLC, CisBio Bioassys)。将激酶与连续稀释的化合物在室温 (RT) 下孵育 60 至 120 分钟，添加 ATP（终浓度为 100 μmol/L）和激酶底物以引发反应。根据制造商说明（CisBio Bioassays）通过等体积的终止/检测溶液来终止反应。将板密封并在室温下孵育 2 小时，并在 PHERAstar FS 读板器 (BMG Labtech) 上记录 TR-FRET 信号（665 nm 处的荧光发射与 337 nm 波长激发下的 620 nm 处发射的比率）。 Life Technologies 使用其在 ATP 浓度 Km 浓度下的标准测定法，对 BGB-283 在 10 μmol/L 固定浓度下的一组 277 种激酶中的活性进行了筛选。然后测定在 10 μmol/L BGB-283 下显示 >80% 抑制作用的激酶的 IC50。细胞测定：使用基于 TR-FRET 的方法测量细胞磷酸-ERK 和磷酸-EGFR。将细胞按 3 × 104 个/孔接种到 96 孔板中，并贴壁 16 小时。然后用 100 μL 不含血清的 DMEM 替换生长培养基。然后用化合物的10点滴定处理细胞。化合物处理1小时后，向每孔添加50μL裂解缓冲液(Cisbio)。然后将板在室温下摇动孵育30分钟。将 96 孔板每孔总共 16 μL 的细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色板。将每孔的裂解物与 2 μL Eu3+- 或 Tb3+- 穴状化合物（供体）标记的抗 ERK 或抗 EGFR 抗体 (Cisbio) 和 2 μL D2（受体）标记的抗磷酸-ERK 或抗磷酸-一起孵育。 EGFR 抗体 (Cisbio) 室温 2 小时。使用 PHERAstar FS 读数器 (BMG Labtech) 测量 FRET 信号。

BGB-283 治疗可导致剂量依赖性肿瘤生长抑制，并伴有 BRAFV600E 突变的细胞系来源和原代人结直肠肿瘤异种移植物的部分和完全肿瘤消退。 BGB-283 在 BRAF(V600E) 结直肠癌异种移植模型中非常有效，包括 HT29、Colo205 和两种带有 BRAFV600E 突变的原发肿瘤异种移植模型。此外，BGB-283 在 WiDr 异种移植模型中显示出引人注目的功效，其中 BRAF 抑制后可诱导 EGFR 再激活。 BGB-283 可诱导 HCC827 中的肿瘤消退，但不会诱导 A431 异种移植物中的肿瘤消退。 BGB-283 抑制 ERK1/2 和 EGFR 的磷酸化，并在 WiDr 肿瘤异种移植物中显示出有效的抗肿瘤活性。 BGB-283 不会诱导 EGFR 反馈激活，如维莫非尼报道的那样。重复给药时，BGB-283 可有效抑制体内 MEK 和 ERK 磷酸化以及 DUSP6 表达。 AKT 磷酸化没有可检测到的差异。

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BGB-283在癌症小鼠异种移植模型中表现出抗肿瘤活性[1]
在源自携带BRAFV600E突变的HT29和Colo205结直肠癌癌症细胞系的皮下异种移植物模型中评估BGB-283的体内功效。之前有报道称，维罗非尼对HT-29异种移植物的疗效有限，与EGFR抑制剂联合使用可提高其抗肿瘤活性。BGB-283在5mg/kg b.i.d.剂量下显著抑制了HT29异种移植物的肿瘤生长（P<0.001），动物对此具有良好的耐受性。在该异种移植物模型中，添加西妥昔单抗（一种靶向EGFR的单克隆抗体）并没有进一步增强BGB-283的治疗效果（P>0.05，BGB-283+西妥昔单抗与BGB-283相比；图4A），这表明单独使用BGB-283可能足以阻断EGFR的反馈激活。针对Colo205异种移植物，BGB-283产生了3至30mg/kg的剂量依赖性肿瘤抑制作用（图4B）。更重要的是，在10mg/kg（1/7只小鼠）的剂量下观察到部分回归。在30 mg/kg BGB-283剂量下，7只小鼠中有3只出现退化（2只PR和1只CR；补充表S6）

在人肿瘤组织来源的原发性癌症异种移植物模型中进一步评估了BGB-283的肿瘤抑制活性。在体内建立了23个患者来源的癌症大肠癌模型，其中两个BCCO002和BCCO-028被鉴定为携带BRAFV600E突变。这两种患者来源的癌症大肠癌模型对BGB-283治疗敏感（图4C和D）；>口服BGB-283（10mg/kg，b.i.d.；图4C和d以及补充表S6）后第24天观察到100%TGI。对于BCCO-002，用BGB-283（10mg/kg b.i.d.）治疗的8只小鼠中有2只（25%）观察到部分退化。添加西妥昔单抗并没有进一步增强BGB-283对BCCO-002的抗肿瘤活性（P>0.05，BGB-283+西妥昔玛vs.BGB-283），这与HT29异种移植物模型中观察到的结果一致（图4A和C）。BCCO-028似乎对BGB-283治疗更敏感；在用BGB-283（5mg/kg b.i.d.）治疗的8只小鼠中，有3只（38%）观察到部分退化。将BGB-283增加到10mg/kg，导致8只小鼠中有7只（88%）出现退化（5只部分退化，2只完全退化）。相比之下，dabrafenib（50mg/kg b.i.d.）治疗对BCCO-028的疗效较差，观察到86%的TGI，并且没有肿瘤消退（图4D补充表S6）。应该指出的是，对于50mg/kg b.i.d.的达比非尼，其在小鼠中的暴露量已经比150mg b.i.d.剂量的患者高出2至3倍。在任何测试的肿瘤模型中，剂量高达30mg/kg的BGB-283治疗对体重没有显著影响（补充图S2）

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BGB-283抑制ERK1/2和EGFR的磷酸化，并在WiDr肿瘤异种移植物中显示出强大的抗肿瘤活性[1]
对WiDr肿瘤异种移植物（BRAFV600E结直肠癌癌症模型）进一步评估了BGB-283，在两项独立研究中，报告了BRAF抑制后EGFR的强反馈激活。在这两份报告中，都表明BRAFV600E选择性抑制剂vemurafemib及其类似物PLX-4720作为单一药物在WiDr异种移植物中没有活性，当与厄洛替尼或西妥昔单抗联合使用时，它们的抗肿瘤活性显著增强。相比之下，BGB-283作为单一药物在WiDr异种移植物模型中诱导了明显的剂量依赖性肿瘤生长抑制。在这项研究中，BGB-283以5和10mg/kg的剂量口服给药于测试小鼠，每天两次（图4E）。在最低剂量为5mg/kg时观察到95%的TGI，在10mg/kg的剂量下，8只小鼠中有4只（50%）的TGI加部分回归达到>100%（补充表S6）。为了确定肿瘤抑制是否与有效抑制EGFR和MAPK信号传导相关，在不同剂量水平的BGB-283下，通过蛋白质印迹分析检测了肿瘤裂解物中磷酸化EGFR（pEGF）、磷酸化MEK（pMEK）和磷酸化ERK（pERK）及其下游DUSP6水平。BGB-283没有像维罗非尼报告的那样诱导EGFR反馈激活。此外，BGB-283在两种剂量的第一剂或第五剂后均能有效抑制pEGFR。相应地，当反复给药时，BGB-283在体内有效地抑制了MEK和ERK的磷酸化以及DUSP6的表达（图4F）。AKT磷酸化没有可检测的差异。总之，这些发现表明，抑制RAF家族激酶和EGFR的BGB-283可以持续抑制MAPK通路。其抑制EGFR的能力可能有助于其在WiDr异种移植物模型中的强效抗肿瘤活性。

在生化检测中，Lifafenib（BGB-283） 抑制 EGFR 和 RAF 激酶，对于 EGFR、EGFR T790M/L858R 突变体和重组 BRAFV600E 激酶结构域的 IC50 值为 23、29 和 495 nM。使用时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 测定，检查化合物抑制 WT 和 RAF 中 EGFR 激酶活性的能力。对于 RAF 激酶，采用 MEK1 (K97R) 作为底物，对于 EGFR，采用生物素化肽底物。在室温 (RT) 下连续化合物稀释孵育 60 至 120 分钟后，将最终浓度为 100 mol/L 的 ATP 和激酶底物添加到激酶中。根据制造商的说明，用等体积的终止/检测溶液终止反应。将板密封并在室温下孵育两小时后，使用 PHERAstar FS 读板器记录 TR-FRET 信号，即 665 nm 处的荧光发射与激发时 620 nm 处的发射的比率波长为 337 nm。 Life Technologies 使用其在 Km ATP 浓度下的标准测定法来筛选 BGB-283，以筛选 BGB-283 在 10 μmol/L 固定浓度下在一组 277 种激酶中的活性。然后通过计算 IC50 来鉴定在 10 μmol/L BGB-283 下表现出 >80% 抑制的激酶。

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BRAFV600E激酶结构域/利法非尼（BGB-283）共结晶和结构测定[1]
BRAFV600E（444-723）的表达和纯化方法与之前报道的方法相似。为了使BRAFV600E与Lifafenib（BGB-283）共结晶，将蛋白质溶液与BGB-283以1:5的比例孵育1小时，并与等体积的储备溶液（pH 6.5的100 mmol/L Bis-Tris、23%PEG3350和200 mmol/L MgCl2）混合。在4°C下通过坐滴蒸汽扩散法生长钴晶体。晶体属于P212121空间群（a=49.395Å，b=101.601Å，c=109.786Å），在不对称单元中包含两个BRAFV600E分子。衍射图像用HKL2000进行处理和缩放。使用MOLREP软件，通过分子替换方法，利用之前发表的结构求解相。随后，在PHENIX中使用刚体精化和最大似然法对所得模型进行了精化（补充表S1）。BRAFV600E激酶结构域与BGB-283的复合结构以PDB ID代码4R5Y提交给蛋白质数据库（PDB）。

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体外激酶测定[1]
在基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）方法的测定中测试化合物对RAF和WT EGFR激酶活性的抑制作用。MEK1（K97R）用作RAF激酶的底物，生物素化肽底物用于EGFR。在室温（RT）下，将激酶与一系列稀释的化合物一起孵育60至120分钟，加入ATP（终浓度为100μmol/L）和激酶底物以引发反应。根据制造商的说明，用等体积的停止/检测溶液停止反应。将板密封并在室温下孵育2小时，在PHERAstar FS板读数器上记录TR-FRET信号（665nm处的荧光发射与波长为337nm的激发下620nm处的发射之比）。 Life Technologies使用其ATP Km浓度的标准检测方法，在10μmol/L的固定浓度下，对277种激酶中的利法非尼/Lifafenib（BGB-283）进行了活性筛选。然后测定在10μmol/L BGB-283下显示>80%抑制的激酶的IC50。

对于每个细胞系，96 孔板每孔接种的细胞数量经过优化，以保证在三天的治疗期间实现对数生长。 16 小时贴壁期后，对重复细胞进行 10 点系列稀释。化合物暴露三天后，添加与每孔中细胞培养基体积相等的 CellTiter-Glo 试剂。将混合物在定轨摇床上混合两分钟以使细胞裂解后，将混合物在室温下放置十分钟以产生并稳定发光信号。光度信号被量化。

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细胞培养[1]
A375、Sk-Mel-28、HT29、Colo205、WiDr、Ba/F3、A431、HCC827、SW620、HCT116和用于细胞面板分析的细胞系购自ATCC。在购买之前，使用形态学、核型分析和基于PCR的方法在ATCC对细胞系进行了测试和鉴定。所有细胞系均在添加了10%FBS、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素的指定培养基中培养，并在含有5%CO2的37°C加湿环境中培养。细胞系是从购买的原始细胞经过三次传代后的冷冻储备中恢复的，传代次数不超过30次。细胞面板分析的培养条件列于补充表S2中。通过在无血清DMEM中加入EGF并孵育10分钟，实现了A431细胞中EGFR磷酸化的刺激。通过向补充有10%FBS的DMEM或RPMI中添加EGF来实现EGF刺激的细胞生长。

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蛋白质印迹分析[1]
对于体外研究，在37°C下处理1小时后收获细胞，并如前所述立即裂解。对于体内研究，在指定的时间点收获肿瘤，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C下。肿瘤在MP匀浆装置的500μL裂解缓冲液中匀浆，然后将裂解物在4°C下以13000 rpm离心10分钟，以去除不溶性碎片。使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒测定裂解物的蛋白质浓度。蛋白质通过10%SDS-PAGE凝胶或NuPAGE Novex 4%至12%Bis-Tris蛋白质凝胶分离，并使用iBlot干吸系统转移到硝化纤维膜上。在室温下用TBSTM[50 mmol/L Tris（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、0.1%吐温20和5%脱脂乳]阻断印迹1小时，并用稀释在TBSTM中的指定抗体进行检测。对膜进行磷酸化蛋白探测，然后剥离以探测总蛋白。为了重新制作，在室温下将膜在剥离缓冲液（25 mmol/L甘氨酸，pH 2.0，1%SDS）中剥离30至60分钟，用TBST冲洗两次10分钟，并探测其他蛋白质。抗原-抗体复合物使用化学发光底物进行可视化，并使用Image-Quant LAS4000迷你数字成像系统进行检测。

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基于细胞的磷酸化ERK和磷酸化EGFR检测方法[1]
使用基于TR-FRET的方法测量细胞磷酸化ERK和磷酸化EGFR。在96孔板上以每孔3×104接种细胞，并放置16小时。然后用100μL不含血清的DMEM代替生长培养基。然后用化合物的10点滴定法处理细胞。化合物处理1小时后，向每个孔中加入50μL裂解缓冲液。然后在室温下摇动培养板30分钟。将96孔板的每个孔中总共16μL的细胞裂解物转移到384孔的小体积白色板上。在室温下，将来自每个孔的裂解物与2μL Eu3+或Tb3+隐窝（供体）标记的抗ERK或抗EGFR抗体和2μL D2（受体）标记的反磷酸化ERK或反磷酸化EGFR抗体一起孵育2小时。使用PHERAstar FS阅读器测量FRET信号。

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增殖试验[1]
使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法测定化合物在一组黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌和肺癌细胞中的生长抑制活性。针对每种细胞系优化96孔板的每孔接种的细胞数量，以确保3天处理期内的对数生长（补充表S2）。让细胞附着16小时，然后用10点稀释系列处理两次。在暴露于该化合物3天后，加入与每个孔中存在的细胞培养基体积相等的CellTiter-Glo试剂。将混合物在轨道振荡器上混合2分钟以允许细胞裂解，然后在室温下孵育10分钟以允许发光信号的产生和稳定。

小鼠：当平均肿瘤体积达到 110 至 200 mm³ 时，将小鼠随机分配至各治疗组。治疗方法包括灌胃给予赋形剂或 2.5 至 30 mg/kg 的利法非尼 (BGB-283)，每日两次或一次。对照组小鼠分别接受西妥昔单抗（40 mg/kg，每周两次）或厄洛替尼（100 mg/kg，每日一次）治疗。厄洛替尼和利法非尼 (BGB-283) 混合，配制成所需浓度的 0.5% (w/v) 甲基纤维素水溶液。西妥昔单抗注射液在给药前用生理盐水稀释。

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本研究使用 4 至 6 周龄、体重约 18 g 的雌性 NOD/SCID 和 BALB/c 裸鼠。
对于HCC827、A431、HT29、Colo205和WiDr异种移植瘤，每只小鼠均通过26号针头皮下注射200 μL PBS，注射剂量为2.5至5 × 10⁶个细胞。当平均肿瘤体积达到110至200 mm³时，将动物随机分为治疗组（每组7-9只小鼠），并分别以灌胃法（po）每日两次（bid）或每日一次（qd）给药，灌胃给药的药物包括载体或2.5至30 mg/kg的利法非尼（BGB-283）。作为对照，小鼠分别接受厄洛替尼（100 mg/kg，qd）或西妥昔单抗（40 mg/kg，每周两次）治疗。 利法非尼 (BGB-283)和厄洛替尼配制成所需浓度的均质悬浮液，溶于0.5% (w/v)甲基纤维素的纯化水中。西妥昔单抗的配制方法是在给药前用生理盐水稀释注射液。
对于BCCO-002和BCCO-028原发性人肿瘤异种移植模型（PDX），结直肠癌样本取自北京肿瘤医院，并在获得患者知情同意后立即转移至含有200 U/mL青霉素和200 mg/mL链霉素的DMEM培养基中。手术后2至4小时内，将小块组织（3 mm × 3 mm × 3 mm）皮下移植到麻醉的NOD/SCID小鼠的肩胛区或侧腹部。在NOD/SCID小鼠上成功传代三次后，将肿瘤转移至BALB/c裸鼠进行传代。在患者肿瘤传代六代后进行疗效研究。当平均肿瘤体积达到 100 至 200 mm³ 时，将动物随机分为治疗组（每组 8 只小鼠），分别口服给予赋形剂（0.5% MC）、利法非尼 (BGB-283)（5–10 mg/kg，每日两次）或达拉非尼（50 mg/kg，每日两次）。另一组接受静脉注射西妥昔单抗（40 mg/kg，每 3 天一次）。利法非尼 (BGB-283) 的配制方法如上所述。达拉非尼配制于 10% DMSO + 90% HP-β-CD（羟丙基-β-环糊精）/PBS 溶液中。在细胞系和原代肿瘤异种移植研究中，每周两次测定小鼠的体重和肿瘤体积，并在研究期间每日监测小鼠的毒性临床症状 [1]。

在针对局部晚期或转移性恶性实体瘤中国患者的利非拉非尼多中心、开放标签临床试验中，本研究成功应用了经验证的液相色谱-单键串联质谱（LC-Single Bond MS/MS）方法进行药代动力学研究。单次口服10 mg或15 mg利非拉非尼后，血浆浓度迅速升高，并在2-3小时左右达到峰浓度（Cmax）。大多数受试者在7-10小时左右观察到第二个峰浓度。图4展示了10 mg组和15 mg组利非拉非尼的血浆浓度-时间曲线。表5列出了使用Pheonix WinNonlin（版本8.1，Certara，MO，USA）进行非房室模型分析得到的药代动力学参数。利非拉非尼表现出较大的个体间差异和较低的清除率。连续22天每日一次服用利非拉非尼后，第25天24小时内的药物暴露量（AUC0-24 h）显著高于第1天，累积率约为600%。大多数受试者在首次给药后72小时内的尿液利非拉非尼浓度低于定量限，第25天的浓度低于10 ng/mL。利非拉非尼的累积尿排泄百分比低于1%，表明肾脏排泄可能并非其主要清除途径。 [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30599278/]

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稳定性：表4总结了利非尼在人血浆、尿液以及原液中的稳定性。验证结果表明，利非尼在人血浆和尿液中分别于室温下放置18小时和7小时后仍保持稳定，在-80℃下分别储存21个月和15个月后也保持稳定。此外，血浆和尿液（添加吐温80后）样品在-80℃下冷冻24小时以上，室温下解冻，至少可耐受3次冻融循环。制备后的样品置于自动进样器（4℃）中至少72小时，对定量准确性无影响。利非尼和IS的储备液在−80 °C下稳定保存至少14个月。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30599278/

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药代动力学结果：在第1周期第1天和第2周期第1天，全身暴露量从5 mg增加到50 mg（见补充数据）。尽管本研究未进行充分的统计效力评估以验证比例关系，但对数-对数回归模型解释了第1周期第1天10 mg至60 mg剂量范围内观察到的80%以上的变异。利非尼吸收迅速，达到最大血浆浓度的中位时间为3小时。根据第2周期第1天/第1周期第1天估算的最大血清浓度（Cmax）、0-9小时血浆浓度曲线下面积（AUC0-9）和AUC0-24的累积比率在10 mg至50 mg剂量范围内相似（见补充数据）。 Cmax 的平均累积倍数为 3.3 至 6.1 倍，AUC0-9 和 AUC0-24 的平均累积倍数为 3.6 至 7.6 倍。三名患者的末端半衰期可测量（范围为 15 至 59 小时）；由于给药后 72 小时未采集样本，因此末端半衰期估计值应谨慎解读。https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7325368/#s7

安全性和耐受性：在剂量递增期间，最常见的治疗相关不良事件 (TEAE) 为疲乏（n = 24；68.6%）和痤疮样皮炎（n = 15；42.9%；表 2）。5 例患者 (14.3%) 因 TEAE 而停药。治疗相关 TEAE 主要为 1-2 级。剂量递增期间最常见的 ≥ 3 级治疗相关 TEAE 为血小板减少症 (14.3%)、高血压 (11.4%) 和疲乏 (11.4%；补充数据)。在符合剂量限制性毒性 (DLT) 评估条件的患者 (n = 31) 中，6 例出现可逆性 DLT，其中 5 例发生在剂量 ≥ 40 mg/d 时（补充数据）。观察到的 DLT 包括 3 级 ALT 升高 (n = 1) 和 4 级血小板减少症 (n = 5)。血小板减少症通常发生在首次给药后 2-3 周内。对前 2 例血小板减少症患者进行了全面检查（包括骨髓活检），结果显示骨髓形态和储备功能正常，提示病因可能为外周性。患者接受了血小板输注（n = 1）或泼尼松龙治疗（n = 4），并暂停使用利非拉非尼；血小板计数在 6-20 天内恢复正常。26 例患者（74.3%）发生了 ≥ 3 级治疗期间出现的不良事件（TEAE，包括剂量限制性毒性 DLT），其中 40、50 和 60 mg/d 剂量组（61.5%）报告 ≥ 3 级 TEAE 的患者比例高于低剂量组（38.5%）。接受 ≥ 40 mg/d 剂量治疗的患者中发生的 ≥ 3 级 TEAE 列于数据补充材料中。最大耐受剂量 (MTD) 设定为 40 mg/d。 80%（5 例患者中的 4 例）剂量限制性血小板减少症发生在接受 40 mg/d 和 60 mg/d 剂量治疗的患者中（每组 n = 2），70% 的 40 mg/d 剂量组患者因药物毒性而中断/减少剂量，通常发生在第 1 个治疗周期的第 13 至 28 天之间。基于这些数据，RP2D 确定为 30 mg/d。
在剂量扩展期间接受利非拉非尼治疗的 96 例患者中，最常见的治疗期间出现的不良事件 (TEAE) 为疲乏（n = 47；49%）和食欲下降（n = 35；36.5%；表 2）。在整个研究期间，未报告皮肤鳞状细胞癌或角化棘皮瘤。68 例患者（70.8%）发生 ≥ 3 级 TEAE，56 例患者（58.3%）发生严重 TEAE。治疗期间出现的不良事件 (TEAE) 导致 19 例患者 (19.8%) 停药，最常见的不良事件为疲乏 (n = 5) 和血小板减少症 (n = 2；见补充数据)。50 例患者 (52%) 出现不良事件 (AE) 导致剂量调整，调整后的中位相对剂量强度为 95.0%。4 例患者 (4.2%) 出现 6 例与治疗无关的 TEAE，最终导致死亡：心包积液、脓毒症、胸腔积液、颅内出血、疾病进展导致的肠穿孔和小肠梗阻（各 n = 1）。在剂量扩展期间，最常见的 ≥ 3 级治疗相关不良事件为高血压 (8.3%) 和疲乏 (7.3%)。 2例患者因治疗相关性≥3级血小板减少症而停止治疗。https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7325368/#s7

[1]. BGB-283, a Novel RAF Kinase and EGFR Inhibitor, Displays Potent Antitumor Activity in BRAF-Mutated Colorectal Cancers. Mol Cancer Ther. 2015 Oct;14(10):2187-97.

Lifirafenib 正在临床试验 NCT03641586（BGB-283 治疗中国局部晚期或转移性恶性实体瘤患者的研究）中进行研究。
Lifirafenib 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 B-raf (BRAF) 和表皮生长因子受体 (EGFR) 的抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。Lifirafenib 可选择性地结合并抑制 BRAF 及其某些突变体以及 EGFR 的活性。这可阻断 BRAF 和 EGFR 介导的信号传导，并抑制含有突变 BRAF 基因或过度激活 EGFR 的肿瘤细胞的增殖。此外，BGB-283 还可抑制 Ras 蛋白 K-RAS 和 N-RAS 的突变体。 BRAF 和 EGFR 在多种肿瘤细胞类型中发生突变或表达上调。
LIFIRAFENIB 是一种小分子药物，目前已完成 II 期临床试验（涵盖所有适应症），并有一项在研适应症。

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致癌基因 BRAF 可驱动细胞转化和增殖，在约 50% 的人类恶性黑色素瘤和 5% 至 15% 的结直肠癌中均有检出。尽管维莫非尼和达拉非尼在治疗 BRAF(V600E) 转移性黑色素瘤方面取得了显著的临床疗效，但它们在 BRAF(V600E) 结直肠癌中的临床疗效却远不尽如人意。既往研究表明，BRAF 抑制后 EGFR 和 MAPK 信号通路的反馈激活可能是导致结直肠癌对第一代 BRAF 抑制剂相对不敏感的原因之一。本文报道了一种双重RAF激酶/EGFR抑制剂BGB-283的特性，该药物目前正在进行临床研究。体外实验表明，BGB-283能有效抑制BRAF(V600E)激活的ERK磷酸化和细胞增殖。它具有选择性细胞毒性，优先抑制携带BRAF(V600E)和EGFR突变/扩增的癌细胞的增殖。在BRAF(V600E)结直肠癌细胞系中，BGB-283能有效抑制EGFR的再激活和EGFR介导的细胞增殖。体内实验表明，BGB-283治疗可剂量依赖性地抑制肿瘤生长，并在携带BRAF(V600E)突变的细胞系来源和原代人结直肠肿瘤异种移植模型中均观察到部分或完全的肿瘤消退。这些研究结果支持BGB-283作为一种强效抗肿瘤候选药物，具有治疗携带BRAF(V600E)突变的结直肠癌的临床潜力。[1]

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本文描述了第二代BRAF抑制剂BGB-283的活性，该抑制剂具有治疗MAPK通路异常癌症的潜力。BGB-283对RAF家族激酶（包括野生型A-RAF、BRAF、C-RAF和BRAFV600E）表现出强效且可逆的抑制活性。此外，BGB-283在生化和细胞水平上均能有效抑制EGFR。BGB-283在107种癌细胞系中表现出显著的抗增殖选择性。 BGB-283 能有效抑制血清诱导的 BRAFV600E 突变癌细胞系的增殖，IC50 值范围为 137 nmol/L 至 580 nmol/L。除 HCC827 肺癌细胞系（EGFR E746-A750 缺失）、ZR-75-30 肺癌细胞系（HER2 扩增）和 NCI-H322M 肺癌细胞系（EGFR 过表达）外，BGB-283 对缺乏 BRAFV600E 突变的细胞系几乎没有抑制活性。这些结果表明，BGB-283 的 RAF 激酶和 EGFR 抑制活性是其在所测试的癌细胞中发挥抗增殖作用的主要机制。尽管BGB-283和维莫非尼的激酶选择性谱不同，但在细胞活力检测中，两种药物均对携带BRAFV600E突变的癌细胞表现出显著的选择性（图3A和B）。
尽管维莫非尼和达拉非尼在黑色素瘤中取得了显著疗效，但其他BRAFV600E突变型癌症对第一代BRAF抑制剂的临床反应却远不尽如人意。据报道，BRAFV600E突变型结直肠癌对维莫非尼的反应率仅为5%。两项独立研究表明，EGFR反馈激活可能是导致对第一代BRAF抑制剂产生耐药性的主要机制之一。本文证明BGB-283是一种真正的EGFR抑制剂，并在体外和体内实验中均表现出良好的EGFR抑制活性。在WiDr结直肠癌细胞中，BGB-283已被证实能够抑制EGFR信号的反馈激活，并实现对pERK的持续抑制。这种对pERK的持续抑制转化为显著的体内抗肿瘤活性。值得注意的是，BGB-283单药治疗（10 mg/kg，每日两次）可使WiDr结直肠腺癌异种移植瘤达到50%的部分消退。相比之下，PLX4720联合西妥昔单抗和维莫非尼联合厄洛替尼似乎主要实现了肿瘤生长抑制（TGI），但并未在WiDr异种移植瘤模型中实现肿瘤消退。
据报道，BRAFV600E突变发生于5%至15%的结直肠癌患者中。在本研究建立的23个结直肠癌原发肿瘤异种移植瘤模型中，发现其中两个模型存在BRAFV600E突变。 BGB-283在两种模型中均显示出良好的疗效，客观缓解率介于25%至100%之间。我们正在对这些模型进行更全面的表征，并试图更好地了解这两种原发性肿瘤异种移植模型中的MAPK和EGFR通路。目前，BGB-283正在进行I期临床试验，以评估其在人体中的安全性、耐受性、药代动力学和药效学活性。据我们所知，BGB-283是目前临床上唯一一种同时靶向RAF激酶和EGFR的小分子抑制剂。业界对验证“EGFR反馈激活导致BRAFV600E选择性抑制剂在结直肠癌中疗效不佳”这一假设表现出浓厚的兴趣。目前，多项将BRAF抑制剂与EGFR小分子抑制剂或单克隆抗体联合应用的临床试验正在进行中（参见www.clinicaltrials.gov）。本研究报告的临床前结果表明，有必要对 BGB-283 作为 BRAFV600E 突变型结直肠癌患者的单一药物进行评估。

C25H17F3N4O3

478.42

478.125

C, 62.76; H, 3.58; F, 11.91; N, 11.71; O, 10.03

1446090-79-4

rel-Lifirafenib;1446090-77-2; 2025321-07-5 (mesylate); 1446090-79-4; 2025321-56-4; 2025320-97-0 (HCl); 1854985-74-2

89670174

White to off-white solid powder

5.433

89.13

2

8

3

35

845

3

FC(C1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])N([H])C([C@]1([H])[C@]3([H])[C@@]1([H])C1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1O3)OC1C([H])=C([H])N=C3C=1C([H])([H])C([H])([H])C(N3[H])=O)=N2)(F)F

NGFFVZQXSRKHBM-FKBYEOEOSA-N

InChI=1S/C25H17F3N4O3/c26-25(27,28)11-1-4-15-16(9-11)31-24(30-15)21-20-14-10-12(2-5-17(14)35-22(20)21)34-18-7-8-29-23-13(18)3-6-19(33)32-23/h1-2,4-5,7-10,20-22H,3,6H2,(H,30,31)(H,29,32,33)/t20-,21-,22-/m0/s1

5-[[(1R,1aS,6bR)-1-[6-(trifluoromethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-1a,6b-dihydro-1H-cyclopropa[b][1]benzofuran-5-yl]oxy]-3,4-dihydro-1H-1,8-naphthyridin-2-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。