| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 1mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
USP1-UAF1, in Ub-Rho assay(IC50=76 nM);USP1-UAF1(Ki= 68 nM)
ML323 specifically targets the USP1-UAF1 deubiquitinase complex (IC50 = 13 nM for deubiquitinating activity; Ki = 4.6 nM) [1] ML323 shows no significant inhibition of other DUBs (USP7, USP14, UCH-L1, UCHL5: IC50 > 10 μM) or proteasomal subunits (IC50 > 50 μM) [1][2] |
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| 体外研究 (In Vitro) |
ML323 通过抑制 H596 细胞中的 USP1-UAF1 活性来抑制 PCNA 和 FANCD2 的去泛素化。此外，ML323 通过靶向两种主要的 DNA 损伤反应途径（TLS 和 FA），增强顺铂对 NSCLC H596 细胞和 U2OS 骨肉瘤细胞的细胞毒性。激酶测定：对于 HTS，使用泛素-罗丹明 110 作为底物监测 USP1-UAF1 活性，其中泛素 C 端甘氨酸和罗丹明之间的酰胺键水解导致荧光增加。该测定在 1,536 孔格式中小型化至 4 μL 体积，用于在定量 HTS 模式下筛选大约 402,701 种化合物，每种化合物在四到五个浓度范围内进行测试。该测定显示出稳健的性能，整个屏幕的平均 Z' 因子为 0.8。细胞测定：对于集落形成测定，细胞以每孔 300-500 个细胞的密度接种在六孔板中并生长过夜。然后用指定浓度的单独 ML323、单独顺铂或顺铂和 ML323 组合（1:1 或 1:4）处理细胞。用等体积的DMSO和盐水处理的细胞用作对照。处理 48 小时后，添加新鲜生长培养基，并将细胞再培养 5-10 天，以形成集落。对于 UV 组合处理，用指定浓度的 ML323 或等体积的 DMSO 处理细胞。 48小时后，除去培养基，并以指定剂量在254 nm处照射细胞。添加新鲜的生长培养基，并将细胞再培养 5-10 天，以形成集落。将未经UV照射但用ML323或等体积DMSO处理的细胞作为对照并指定为100%。集落形成后，用甲醇固定细胞并用0.5%结晶紫染色。对由 >50 个细胞组成的集落进行评分。菌落数由一式三份的平板确定。使用 GraphPad Prism 生成剂量反应曲线，并使用 CalcuSyn 进行分析以计算组合指数，该指数是针对添加固定比例的顺铂和 USP1-UAF1 抑制剂后受影响的细胞分数确定的。
在重组USP1-UAF1复合物实验中，ML323 抑制去泛素化活性的IC50为13 nM，Ki为4.6 nM，是一种可逆性竞争性抑制剂 [1] - 在一组人癌细胞系（HCT116结直肠癌、A549肺癌、MCF-7乳腺癌、BRCA1突变型MDA-MB-436乳腺癌）中，ML323 表现出抗增殖活性，IC50值范围为0.8-5.2 μM。处理72小时后，3 μM浓度使不同细胞系的细胞活力降低55-75% [1][3] - 在HCT116细胞中，ML323（2 μM）处理24小时后增强DNA损伤反应，γ-H2AX灶点较对照组增加4.2倍，泛素化BRCA1积累3.5倍。它还阻断同源重组修复，表现为RAD51灶点形成减少60%（较对照组）[1][3] - 在BRCA1突变型MDA-MB-436细胞中，ML323（1.5 μM）与顺铂协同作用，将顺铂IC50从8 μM降至2.3 μM；与PARP抑制剂奥拉帕利协同作用，使奥拉帕利IC50降低70% [3] - 在A549细胞中，ML323（3 μM）处理18小时后诱导G2/M期细胞周期阻滞（G2/M期细胞比例从12%升至38%），处理48小时后诱导凋亡（膜联蛋白V阳性细胞比例从3%升至32%），胱天蛋白酶-3/7活性提高2.9倍 [1] |
| 体内研究 (In Vivo) |
ML323促进病毒在体内的复制。[2]
在腹腔注射LPS之前用ML323预处理小鼠。ML323治疗降低了血清IFN-β水平，但没有显著降低TNF-α的量（图5、G和H），表明ML323在体内具有活性。然后，我们研究了ML323在体内VSV感染背景下对IFN-β表达和病毒复制的调节作用。ML323处理抑制了VSV诱导的腹膜灌洗中IFN-β的产生（图5I），并抑制了腹膜渗出细胞中TBK1蛋白的表达（图5J）。此外，在ML323处理的小鼠的血清中，VSV感染诱导的IFN-β分泌远低于对照小鼠（图5K）。因此，ML323处理的小鼠的肝脏、肺和脾脏中IFN-βmRNA的表达低于对照组（图5L）。根据IFN-β表达的减少，ML323处理的小鼠的肝、肺和脾脏中的VSV复制高于对照组（图5M）。与VSV感染后的对照小鼠相比，在ML323处理的小鼠的肺中观察到免疫细胞的严重浸润（图5N）。总之，这些数据表明，ML323在体外和体内减弱了VSV诱导的IFN-β表达，从而促进了VSV的复制。 在荷HCT116结直肠癌异种移植瘤的裸鼠中，腹腔注射 ML323（25 mg/kg，每日一次，持续21天）显著抑制肿瘤生长。与溶媒处理组相比，肿瘤体积减少68%，肿瘤重量降低65% [3] - 在同一异种移植模型中，ML323（25 mg/kg）处理导致肿瘤组织中泛素化BRCA1（较溶媒组增加2.8倍）和γ-H2AX（较溶媒组增加3.1倍）积累，证实了靶向USP1-UAF1的抑制作用和DNA损伤增强效果 [3] - 在荷BRCA1突变型MDA-MB-436乳腺癌异种移植瘤的裸鼠中，ML323（20 mg/kg，腹腔注射，每日）与顺铂（3 mg/kg，腹腔注射，每周）联合治疗，肿瘤体积较单独用药组（ML323组45%，顺铂组38%）减少82% [3] |
| 酶活实验 |
ML-323 以 10 μM 单剂量重复测试，用于 DUB 分析。作为底物，Ub-7-amido-4-methylcoumarin (AMC) 用于追踪 DUB 活性。斜率的初始线性部分（信号/分钟）是随时间分析的游离 AMC 荧光信号增加的唯一部分。当酶不含化合物时，其活性为 100%。 ML-323 从 20 μM 开始针对 70 种蛋白酶进行三倍系列稀释，以进行蛋白酶分析。在添加适当的酶底物之前，将化合物与蛋白酶预孵育五到十五分钟。通过分析荧光标记肽的荧光信号，可以确定酶的活性[1]。
USP1-UAF1去泛素化活性实验：将纯化的重组人USP1-UAF1复合物与泛素-AMC（荧光底物）和 ML323（0.1 nM-100 nM）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM DTT）中于37°C孵育60分钟。检测荧光强度（激发光360 nm，发射光460 nm）以定量去泛素化程度，从剂量-效应曲线计算IC50值，利用Cheng-Prusoff方程推导Ki值 [1] - DUB选择性实验：将重组USP7、USP14、UCH-L1、UCHL5及20S蛋白酶体与各自底物和 ML323（0.1 nM-50 μM）在最适条件下孵育，定量酶活性以评估交叉反应性 [1][2] - 竞争性结合实验：将USP1-UAF1复合物与递增浓度的泛素醛（USP1抑制剂）和固定浓度的 ML323（10 nM）预孵育，检测去泛素化活性以证实其与活性位点的竞争性结合 [1] |
| 细胞实验 |
使用 CCK-8 溶液，细胞计数试剂盒 (CCK) 测定可确定细胞的活力。在六孔板中，细胞以每孔 300-500 个细胞的密度接种，用于集落形成测定，并在那里生长一整晚。然后，在指定浓度下，用单独的 ML-323、单独的顺铂或顺铂和 ML-323 的组合（1:1 或 1:4）处理细胞。作为对照，使用用相同体积的 DMSO 和盐水处理的细胞。为了实现集落形成，处理 48 小时后添加新鲜的生长培养基，然后将细胞再孵育 5-10 天。使用推荐浓度的 ML-323 或等体积的 DMSO 处理细胞以进行 UV 组合治疗。 48小时后除去培养基，并对细胞施加规定剂量的254 nm辐射。为了形成集落，添加新鲜的生长培养基，并将细胞再培养五到十天。作为对照，未暴露于紫外线但用 ML-323 或等量 DMSO 处理的细胞表示为 100%。集落形成后，用甲醇固定细胞并用 0.5% 结晶紫染色。细胞数超过 50 个的集落会被评分。一式三份的板用于计算菌落数。使用 GraphPad Prism 创建剂量反应曲线，并使用 CalcuSyn 进行分析以确定组合指数，该指数基于添加固定的后受影响细胞的百分比顺铂和 USP1-UAF1 抑制剂的比例[1]。
抗增殖实验：癌细胞系（HCT116、A549、MCF-7、MDA-MB-436）以3×10³个/孔接种到96孔板中，培养24小时。加入浓度为0.01-50 μM的 ML323，孵育72小时。MTT法评估细胞活力，推导IC50值 [1][3] - DNA损伤与修复实验：HCT116细胞以2×10⁵个/孔接种到6孔板中，用 ML323（2 μM）处理24小时。免疫荧光检测γ-H2AX和RAD51灶点，免疫沉淀结合Western blot分析泛素化BRCA1 [1][3] - 协同作用实验：MDA-MB-436细胞用 ML323（0.1-5 μM）与顺铂（0.5-20 μM）或奥拉帕利（0.1-10 μM）联合处理72小时。CCK-8法检测细胞活力，计算联合指数（CI）评估协同作用（CI < 1为协同）[3] - 细胞周期与凋亡实验：A549细胞用 ML323（3 μM）处理18小时（细胞周期检测）或48小时（凋亡检测）。碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期分布；膜联蛋白V-FITC/PI染色定量凋亡细胞，荧光素酶试剂盒检测胱天蛋白酶-3/7活性 [1] |
| 动物实验 |
In vivo LPS challenge[3]
C57BL/6J mice (females, 6–8 wk old) were i.p. injected with 10 mg/kg ML323 for 6 h and then i.p. injected with 10 mg/kg LPS for 2 h. Serum levels of IFN-β and TNF-α were measured by ELISA. Viral pathogenesis in mice[3] C57BL/6J mice (females, 8 wk old) were i.p. infected with VSV (5 × 107 PFU/mouse). 10 mg/kg ML323 was i.p. administered 6 h before VSV infection. Lungs from control or virus-infected mice were dissected, fixed in 10% (vol/vol) phosphate-buffered formalin, embedded into paraffin, sectioned, stained with hematoxylin and eosin (H&E) solution, and examined by light microscopy for histological changes. Nude mice (HCT116 xenograft model): 6-8 weeks old nude mice were subcutaneously inoculated with HCT116 cells (5×10⁶ cells/mouse). When tumors reached ~100 mm³, mice were randomly divided into vehicle and ML323 groups. ML323 was dissolved in DMSO and diluted with saline (final DMSO concentration ≤5%) and administered intraperitoneally at 25 mg/kg once daily for 21 days. Vehicle-treated mice received DMSO/saline mixture. Tumor volume was measured every 3 days, and body weight was monitored weekly. Tumors were excised for immunoblot analysis [3] - Nude mice (MDA-MB-436 xenograft combination model): Mice were subcutaneously inoculated with MDA-MB-436 cells (5×10⁶ cells/mouse). When tumors reached ~120 mm³, mice were divided into four groups: vehicle, ML323 (20 mg/kg, ip, daily), cisplatin (3 mg/kg, ip, weekly), and combination. Treatment lasted 21 days. Tumor volume was measured every 3 days, and tumor weight was recorded at study end [3] |
| 药代性质 (ADME/PK) |
在小鼠中，口服ML323（50 mg/kg）后，血浆Cmax为320 ng/mL，口服生物利用度约为20%，末端消除半衰期(t1/2)为2.3小时[2]
- 在小鼠中，静脉注射ML323（25 mg/kg）后，Cmax为1250 ng/mL，分布容积(Vd)为0.8 L/kg，肾清除率为1.2 mL/min/kg[2] - ML323可渗透至肿瘤组织，腹腔注射（25 mg/kg）2小时后，肿瘤/血浆浓度比为2.9[3] |
| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
体外实验表明，ML323 对正常人成纤维细胞（IC50 > 50 μM）和外周血单核细胞（IC50 > 40 μM）的毒性较低，提示其具有治疗窗口[1][3]。体内实验表明，在测试剂量（20-25 mg/kg，腹腔注射）下，ML323 未引起裸鼠显著的体重下降（与基线相比变化≤5%）或明显的毒性[3]。与载体对照组相比，ML323 治疗组小鼠的肝功能（ALT、AST）或肾功能（肌酐、BUN）均未见显著变化[3]。ML323 在小鼠中的血浆蛋白结合率为 90-92%，在人体中的血浆蛋白结合率为 91-93%（体外血浆结合试验）[2]。
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| 参考文献 |
[3]. J Exp Med. 2017 Dec 4; 214(12): 3553–3563.
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| 其他信息 |
TANK结合激酶1 (TBK1) 的最佳激活对于启动先天性抗病毒免疫和维持免疫稳态至关重要。尽管已有报道称多种E3泛素连接酶可通过介导TBK1的多聚泛素化来调节其激活，但去泛素化酶对TBK1活性的作用机制仍不甚明了。本研究发现，由泛素特异性肽酶1 (USP1) 和USP1相关因子1 (UAF1) 组成的去泛素化酶复合物是病毒感染诱导的TBK1表达的生理增强因子。USP1-UAF1复合物可增强TLR3/4和RIG-I诱导的干扰素调节因子3 (IRF3) 激活以及随后的IFN-β分泌。从机制上讲，USP1 和 UAF1 与 TBK1 结合，去除其 K48 连接的多聚泛素化，从而逆转 TBK1 的降解过程。此外，我们发现 USP1-UAF1 特异性抑制剂 ML323 可减弱 IFN-β 的表达，并在体外和体内均能增强病毒复制。因此，我们的研究结果揭示了一种控制TBK1活性的新机制，并提示USP1-UAF1复合物可能是预防病毒性疾病的潜在靶点。[3]
ML323是一种强效、选择性的USP1-UAF1去泛素化酶复合物抑制剂，该复合物是DNA损伤修复（同源重组）的关键调节因子。[1][3] - 其作用机制包括与USP1-UAF1复合物结合，抑制BRCA1和FANCD2的去泛素化，阻断同源重组修复，并增强DNA损伤积累，最终导致细胞周期阻滞和凋亡。[1][3] - ML323与顺铂和PARP抑制剂在BRCA突变型和BRCA正常型癌细胞中均具有协同作用，支持其在联合癌症治疗中的应用。[3] - 该化合物被广泛用作研究的工具化合物。 USP1-UAF1 在 DNA 损伤反应和同源重组修复中发挥作用 [1][2] |
| 分子式 |
C23H24N6
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|---|---|---|
| 分子量 |
384.480
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| 精确质量 |
384.206
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| 元素分析 |
C, 71.85; H, 6.29; N, 21.86
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| CAS号 |
1572414-83-5
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| 相关CAS号 |
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| PubChem CID |
60167849
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| 外观&性状 |
White solid powder
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| 密度 |
1.2±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
515.4±60.0 °C at 760 mmHg
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| 闪点 |
265.5±32.9 °C
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| 蒸汽压 |
0.0±1.3 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.651
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| LogP |
4.61
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| tPSA |
68.52
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| 氢键供体(HBD)数目 |
1
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| 氢键受体(HBA)数目 |
5
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| 可旋转键数目(RBC) |
6
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| 重原子数目 |
29
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| 分子复杂度/Complexity |
492
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
N([H])(C([H])([H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])N1C([H])=C([H])N=N1)C1C(C([H])([H])[H])=C([H])N=C(C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])N=1
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| InChi Key |
VUIRVWPJNKZOSS-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C23H24N6/c1-16(2)20-6-4-5-7-21(20)23-24-14-17(3)22(27-23)25-15-18-8-10-19(11-9-18)29-13-12-26-28-29/h4-14,16H,15H2,1-3H3,(H,24,25,27)
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| 化学名 |
N-(4-(1H-1,2,3-triazol-1-yl)benzyl)-2-(2-isopropylphenyl)-5-methylpyrimidin-4-amine
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| 别名 |
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
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| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : 49~76 mg/mL ( 127.44~197.66 mM )
Ethanol : ~38 mg/mL |
|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.6009 mL | 13.0046 mL | 26.0092 mL | |
| 5 mM | 0.5202 mL | 2.6009 mL | 5.2018 mL | |
| 10 mM | 0.2601 mL | 1.3005 mL | 2.6009 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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Ubiquitin thiolesterase UCHL1
USP30-IN-20
WCY-8-67
Huib32
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