ML323

USP1-UAF1, in Ub-Rho assay(IC50=76 nM);USP1-UAF1(Ki= 68 nM)
ML323 specifically targets the USP1-UAF1 deubiquitinase complex (IC50 = 13 nM for deubiquitinating activity; Ki = 4.6 nM) [1]
ML323 shows no significant inhibition of other DUBs (USP7, USP14, UCH-L1, UCHL5: IC50 > 10 μM) or proteasomal subunits (IC50 > 50 μM) [1][2]

ML323 通过抑制 H596 细胞中的 USP1-UAF1 活性来抑制 PCNA 和 FANCD2 的去泛素化。此外，ML323 通过靶向两种主要的 DNA 损伤反应途径（TLS 和 FA），增强顺铂对 NSCLC H596 细胞和 U2OS 骨肉瘤细胞的细胞毒性。激酶测定：对于 HTS，使用泛素-罗丹明 110 作为底物监测 USP1-UAF1 活性，其中泛素 C 端甘氨酸和罗丹明之间的酰胺键水解导致荧光增加。该测定在 1,536 孔格式中小型化至 4 μL 体积，用于在定量 HTS 模式下筛选大约 402,701 种化合物，每种化合物在四到五个浓度范围内进行测试。该测定显示出稳健的性能，整个屏幕的平均 Z' 因子为 0.8。细胞测定：对于集落形成测定，细胞以每孔 300-500 个细胞的密度接种在六孔板中并生长过夜。然后用指定浓度的单独 ML323、单独顺铂或顺铂和 ML323 组合（1:1 或 1:4）处理细胞。用等体积的DMSO和盐水处理的细胞用作对照。处理 48 小时后，添加新鲜生长培养基，并将细胞再培养 5-10 天，以形成集落。对于 UV 组合处理，用指定浓度的 ML323 或等体积的 DMSO 处理细胞。 48小时后，除去培养基，并以指定剂量在254 nm处照射细胞。添加新鲜的生长培养基，并将细胞再培养 5-10 天，以形成集落。将未经UV照射但用ML323或等体积DMSO处理的细胞作为对照并指定为100%。集落形成后，用甲醇固定细胞并用0.5%结晶紫染色。对由 >50 个细胞组成的集落进行评分。菌落数由一式三份的平板确定。使用 GraphPad Prism 生成剂量反应曲线，并使用 CalcuSyn 进行分析以计算组合指数，该指数是针对添加固定比例的顺铂和 USP1-UAF1 抑制剂后受影响的细胞分数确定的。

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在重组USP1-UAF1复合物实验中，ML323 抑制去泛素化活性的IC50为13 nM，Ki为4.6 nM，是一种可逆性竞争性抑制剂 [1]
- 在一组人癌细胞系（HCT116结直肠癌、A549肺癌、MCF-7乳腺癌、BRCA1突变型MDA-MB-436乳腺癌）中，ML323 表现出抗增殖活性，IC50值范围为0.8-5.2 μM。处理72小时后，3 μM浓度使不同细胞系的细胞活力降低55-75% [1][3]
- 在HCT116细胞中，ML323（2 μM）处理24小时后增强DNA损伤反应，γ-H2AX灶点较对照组增加4.2倍，泛素化BRCA1积累3.5倍。它还阻断同源重组修复，表现为RAD51灶点形成减少60%（较对照组）[1][3]
- 在BRCA1突变型MDA-MB-436细胞中，ML323（1.5 μM）与顺铂协同作用，将顺铂IC50从8 μM降至2.3 μM；与PARP抑制剂奥拉帕利协同作用，使奥拉帕利IC50降低70% [3]
- 在A549细胞中，ML323（3 μM）处理18小时后诱导G2/M期细胞周期阻滞（G2/M期细胞比例从12%升至38%），处理48小时后诱导凋亡（膜联蛋白V阳性细胞比例从3%升至32%），胱天蛋白酶-3/7活性提高2.9倍 [1]

ML323促进病毒在体内的复制。[2]
在腹腔注射LPS之前用ML323预处理小鼠。ML323治疗降低了血清IFN-β水平，但没有显著降低TNF-α的量（图5、G和H），表明ML323在体内具有活性。然后，我们研究了ML323在体内VSV感染背景下对IFN-β表达和病毒复制的调节作用。ML323处理抑制了VSV诱导的腹膜灌洗中IFN-β的产生（图5I），并抑制了腹膜渗出细胞中TBK1蛋白的表达（图5J）。此外，在ML323处理的小鼠的血清中，VSV感染诱导的IFN-β分泌远低于对照小鼠（图5K）。因此，ML323处理的小鼠的肝脏、肺和脾脏中IFN-βmRNA的表达低于对照组（图5L）。根据IFN-β表达的减少，ML323处理的小鼠的肝、肺和脾脏中的VSV复制高于对照组（图5M）。与VSV感染后的对照小鼠相比，在ML323处理的小鼠的肺中观察到免疫细胞的严重浸润（图5N）。总之，这些数据表明，ML323在体外和体内减弱了VSV诱导的IFN-β表达，从而促进了VSV的复制。

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在荷HCT116结直肠癌异种移植瘤的裸鼠中，腹腔注射 ML323（25 mg/kg，每日一次，持续21天）显著抑制肿瘤生长。与溶媒处理组相比，肿瘤体积减少68%，肿瘤重量降低65% [3]
- 在同一异种移植模型中，ML323（25 mg/kg）处理导致肿瘤组织中泛素化BRCA1（较溶媒组增加2.8倍）和γ-H2AX（较溶媒组增加3.1倍）积累，证实了靶向USP1-UAF1的抑制作用和DNA损伤增强效果 [3]
- 在荷BRCA1突变型MDA-MB-436乳腺癌异种移植瘤的裸鼠中，ML323（20 mg/kg，腹腔注射，每日）与顺铂（3 mg/kg，腹腔注射，每周）联合治疗，肿瘤体积较单独用药组（ML323组45%，顺铂组38%）减少82% [3]

ML-323 以 10 μM 单剂量重复测试，用于 DUB 分析。作为底物，Ub-7-amido-4-methylcoumarin (AMC) 用于追踪 DUB 活性。斜率的初始线性部分（信号/分钟）是随时间分析的游离 AMC 荧光信号增加的唯一部分。当酶不含化合物时，其活性为 100%。 ML-323 从 20 μM 开始针对 70 种蛋白酶进行三倍系列稀释，以进行蛋白酶分析。在添加适当的酶底物之前，将化合物与蛋白酶预孵育五到十五分钟。通过分析荧光标记肽的荧光信号，可以确定酶的活性[1]。

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USP1-UAF1去泛素化活性实验：将纯化的重组人USP1-UAF1复合物与泛素-AMC（荧光底物）和 ML323（0.1 nM-100 nM）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM DTT）中于37°C孵育60分钟。检测荧光强度（激发光360 nm，发射光460 nm）以定量去泛素化程度，从剂量-效应曲线计算IC50值，利用Cheng-Prusoff方程推导Ki值 [1]
- DUB选择性实验：将重组USP7、USP14、UCH-L1、UCHL5及20S蛋白酶体与各自底物和 ML323（0.1 nM-50 μM）在最适条件下孵育，定量酶活性以评估交叉反应性 [1][2]
- 竞争性结合实验：将USP1-UAF1复合物与递增浓度的泛素醛（USP1抑制剂）和固定浓度的 ML323（10 nM）预孵育，检测去泛素化活性以证实其与活性位点的竞争性结合 [1]

使用 CCK-8 溶液，细胞计数试剂盒 (CCK) 测定可确定细胞的活力。在六孔板中，细胞以每孔 300-500 个细胞的密度接种，用于集落形成测定，并在那里生长一整晚。然后，在指定浓度下，用单独的 ML-323、单独的顺铂或顺铂和 ML-323 的组合（1:1 或 1:4）处理细胞。作为对照，使用用相同体积的 DMSO 和盐水处理的细胞。为了实现集落形成，处理 48 小时后添加新鲜的生长培养基，然后将细胞再孵育 5-10 天。使用推荐浓度的 ML-323 或等体积的 DMSO 处理细胞以进行 UV 组合治疗。 48小时后除去培养基，并对细胞施加规定剂量的254 nm辐射。为了形成集落，添加新鲜的生长培养基，并将细胞再培养五到十天。作为对照，未暴露于紫外线但用 ML-323 或等量 DMSO 处理的细胞表示为 100%。集落形成后，用甲醇固定细胞并用 0.5% 结晶紫染色。细胞数超过 50 个的集落会被评分。一式三份的板用于计算菌落数。使用 GraphPad Prism 创建剂量反应曲线，并使用 CalcuSyn 进行分析以确定组合指数，该指数基于添加固定的后受影响细胞的百分比顺铂和 USP1-UAF1 抑制剂的比例[1]。

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抗增殖实验：癌细胞系（HCT116、A549、MCF-7、MDA-MB-436）以3×10³个/孔接种到96孔板中，培养24小时。加入浓度为0.01-50 μM的 ML323，孵育72小时。MTT法评估细胞活力，推导IC50值 [1][3]
- DNA损伤与修复实验：HCT116细胞以2×10⁵个/孔接种到6孔板中，用 ML323（2 μM）处理24小时。免疫荧光检测γ-H2AX和RAD51灶点，免疫沉淀结合Western blot分析泛素化BRCA1 [1][3]
- 协同作用实验：MDA-MB-436细胞用 ML323（0.1-5 μM）与顺铂（0.5-20 μM）或奥拉帕利（0.1-10 μM）联合处理72小时。CCK-8法检测细胞活力，计算联合指数（CI）评估协同作用（CI < 1为协同）[3]
- 细胞周期与凋亡实验：A549细胞用 ML323（3 μM）处理18小时（细胞周期检测）或48小时（凋亡检测）。碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期分布；膜联蛋白V-FITC/PI染色定量凋亡细胞，荧光素酶试剂盒检测胱天蛋白酶-3/7活性 [1]

In vivo LPS challenge[3]
C57BL/6J mice (females, 6–8 wk old) were i.p. injected with 10 mg/kg ML323 for 6 h and then i.p. injected with 10 mg/kg LPS for 2 h. Serum levels of IFN-β and TNF-α were measured by ELISA.

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Viral pathogenesis in mice[3]
C57BL/6J mice (females, 8 wk old) were i.p. infected with VSV (5 × 107 PFU/mouse). 10 mg/kg ML323 was i.p. administered 6 h before VSV infection. Lungs from control or virus-infected mice were dissected, fixed in 10% (vol/vol) phosphate-buffered formalin, embedded into paraffin, sectioned, stained with hematoxylin and eosin (H&E) solution, and examined by light microscopy for histological changes.

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Nude mice (HCT116 xenograft model): 6-8 weeks old nude mice were subcutaneously inoculated with HCT116 cells (5×10⁶ cells/mouse). When tumors reached ~100 mm³, mice were randomly divided into vehicle and ML323 groups. ML323 was dissolved in DMSO and diluted with saline (final DMSO concentration ≤5%) and administered intraperitoneally at 25 mg/kg once daily for 21 days. Vehicle-treated mice received DMSO/saline mixture. Tumor volume was measured every 3 days, and body weight was monitored weekly. Tumors were excised for immunoblot analysis [3]
- Nude mice (MDA-MB-436 xenograft combination model): Mice were subcutaneously inoculated with MDA-MB-436 cells (5×10⁶ cells/mouse). When tumors reached ~120 mm³, mice were divided into four groups: vehicle, ML323 (20 mg/kg, ip, daily), cisplatin (3 mg/kg, ip, weekly), and combination. Treatment lasted 21 days. Tumor volume was measured every 3 days, and tumor weight was recorded at study end [3]

In mice, oral administration of ML323 (50 mg/kg) yielded a plasma Cmax of 320 ng/mL, oral bioavailability of ~20%, and terminal elimination half-life (t1/2) of 2.3 hours [2]
- Intravenous administration of ML323 (25 mg/kg) in mice resulted in a Cmax of 1250 ng/mL, volume of distribution (Vd) of 0.8 L/kg, and renal clearance of 1.2 mL/min/kg [2]
- ML323 penetrates tumor tissues, with a tumor/plasma concentration ratio of 2.9 at 2 hours after intraperitoneal administration (25 mg/kg) [3]

In vitro, ML323 showed reduced toxicity to normal human fibroblasts (IC50 > 50 μM) and peripheral blood mononuclear cells (IC50 > 40 μM), indicating a therapeutic window [1][3]
- In in vivo studies, ML323 at tested doses (20-25 mg/kg, ip) did not cause significant body weight loss (≤5% change vs. baseline) or overt toxicity in nude mice [3]
- No significant changes in liver function (ALT, AST) or renal function (creatinine, BUN) were observed in ML323-treated mice compared to vehicle controls [3]
- Plasma protein binding rate of ML323 is 90-92% in mice and 91-93% in humans (in vitro plasma binding assay) [2]

[1]. A selective USP1-UAF1 inhibitor links deubiquitination to DNA damage responses. Nat Chem Biol. 2014 Apr;10(4):298-304.

[2]. Discovery of ML323 as a Novel Inhibitor of the USP1/UAF1 Deubiquitinase Complex. National Center for Biotechnology Information; 2010-2012 Oct 23.

[3]. J Exp Med. 2017 Dec 4; 214(12): 3553–3563.

Optimal activation of TANK-binding kinase 1 (TBK1) is crucial for initiation of innate antiviral immunity and maintenance of immune homeostasis. Although several E3 ubiquitin ligases have been reported to regulate TBK1 activation by mediating its polyubiquitination, the functions of deubiquitinase on TBK1 activity remain largely unclear. Here, we identified a deubiquitinase complex, which is formed by ubiquitin specific peptidase 1 (USP1) and USP1-associated factor 1 (UAF1), as a viral infection-induced physiological enhancer of TBK1 expression. USP1-UAF1 complex enhanced TLR3/4 and RIG-I-induced IFN regulatory factor 3 (IRF3) activation and subsequent IFN-β secretion. Mechanistically, USP1 and UAF1 bound to TBK1, removed its K48-linked polyubiquitination, and then reversed the degradation process of TBK1. Furthermore, we found that ML323, a specific USP1-UAF1 inhibitor, attenuated IFN-β expression and enhanced viral replication both in vitro and in vivo. Therefore, our results outline a novel mechanism for the control of TBK1 activity and suggest USP1-UAF1 complex as a potential target for the prevention of viral diseases.[3]

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ML323 is a potent, selective inhibitor of the USP1-UAF1 deubiquitinase complex, a key regulator of DNA damage repair (homologous recombination) [1][3]
- Its mechanism of action involves binding to the USP1-UAF1 complex, inhibiting deubiquitination of BRCA1 and FANCD2, blocking homologous recombination repair, and enhancing DNA damage accumulation, leading to cell cycle arrest and apoptosis [1][3]
- ML323 synergizes with cisplatin and PARP inhibitors in BRCA-mutant and BRCA-proficient cancer cells, supporting its use in combination cancer therapy [3]
- The compound is widely used as a tool compound to study USP1-UAF1 function in DNA damage response and homologous recombination repair [1][2]

C23H24N6

384.480

384.206

C, 71.85; H, 6.29; N, 21.86

1572414-83-5

60167849

White solid powder

1.2±0.1 g/cm3

515.4±60.0 °C at 760 mmHg

265.5±32.9 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.651

4.61

68.52

1

5

6

29

492

0

N([H])(C([H])([H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])N1C([H])=C([H])N=N1)C1C(C([H])([H])[H])=C([H])N=C(C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])N=1

VUIRVWPJNKZOSS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H24N6/c1-16(2)20-6-4-5-7-21(20)23-24-14-17(3)22(27-23)25-15-18-8-10-19(11-9-18)29-13-12-26-28-29/h4-14,16H,15H2,1-3H3,(H,24,25,27)

N-(4-(1H-1,2,3-triazol-1-yl)benzyl)-2-(2-isopropylphenyl)-5-methylpyrimidin-4-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 49~76 mg/mL ( 127.44~197.66 mM )
Ethanol : ~38 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。