K-Ras(G12C)

MRTX849 (0.1-10000 nM; 3天/2D条件，12天/3D条件)对基质KRAS G12C突变体细胞系的生长有明显的抑制作用，其IC50在2D条件下为10~973 nM，3D MRTX849 (0.24-1000nM; 24小时)抑制KRAS依赖的信号转导靶点，包括ERK1/2磷酸化(Thr202/Tyr204 ERK1; pERK)、S6磷酸化细胞活力测定，条件为0.2〜1042 nM[1]。 [1]细胞系：MIA PaCa-2、H1373、H358、H2122、SW1573、H2030、KYSE-410细胞（G12C）； H1299（WT）； A549 (G12S)、HCT116 (G13D) 细胞 浓度：0.1、1、10、100、1000、10000 nM 孵育时间：24 小时 结果：抑制绝大多数 KRAS G12C 突变细胞系的细胞生长，IC50 值介于2D 格式为 10 至 973 nM，3D 格式为 0.2 至 1042 nM。 Western Blot 分析[1] 细胞系：MIA PaCa-2 细胞 浓度：0.24、0.5、1.0、2.0、3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000 nM 孵育时间：24 小时 结果：抑制KRAS 依赖性信号传导靶点，包括 ERK1/2 磷酸化（Thr202/Tyr204 ERK1；pERK）、S6 磷酸化（RSK 依赖性 Ser235/236；pS6）和 ERK 调节的 DUSP6 表达，每个靶点的 IC50 均在个位数纳摩尔范围内在细胞系中。

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抗增殖活性：Adagrasib能有效抑制KRAS G12C突变的癌细胞系生长。在17种KRAS G12C突变和3种非KRAS G12C突变的癌细胞系中，其在2D（3天贴壁细胞）培养中的IC50值介于10 nM至973 nM之间，在3D（12天球体）培养中介于0.2 nM至1042 nM之间，表明对KRAS G12C突变细胞具有较强的抗增殖活性。

MRTX849（1-100 mg/kg；口腔灌胃。；每日一次至第16天）在耐受良好的剂量范围内显示剂量怀疑抗肿瘤疗效，MRTX849的最大有效剂量在30-100 mg/kg动物模型：MIA PaCa-2模型(6-8周龄，雌性，无胸腺裸-Foxn1 nu小鼠)[1] 剂量：1、3、10、30和100 mg//天之间[1]。 kg 给药方式：口服强饲；每天一次，直至第 16 天 结果：在最早的治疗后肿瘤测量中观察到肿瘤快速消退，30 和 100 mg/kg 组中的动物在研究第 15 天表现出完全缓解的证据。在研究第 16 天停止给药，所有 4 只小鼠在研究第 70 天，100 mg/kg 组中的 7 只小鼠和 30 mg/kg 组中的 7 只小鼠中有 2 只保持无肿瘤状态。

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抗肿瘤功效：Adagrasib可在动物模型中引起肿瘤快速消退。在实验中，30 mg/kg和100 mg/kg剂量组的动物在研究第15天显示出完全缓解的迹象。在研究第16天停止给药后，100 mg/kg剂量组的4只小鼠和30 mg/kg剂量组的7只小鼠中有2只在研究第70天仍无肿瘤，表明其具有显著的体内抗肿瘤作用。

KRASG12C target engagement[2]
将肿瘤片段在6M胍-HCl、50mM N-（2-羟乙基）哌嗪-N′-乙磺酸（HEPES）（pH 7.5）和5mM TCEP中匀浆。离心后，使用Bradford测定法测定上清液的蛋白质浓度。将内标物（13C15N重组KRASG12C）和20mM碘代乙酰胺添加到200μL裂解缓冲液中的200μg肿瘤蛋白中，并将样品在37°C下黑暗孵育30分钟。烷基化后，使用96孔Zeba旋转板将100μL反应物交换为1M胍-HCl和50mM HEPES（pH 7.5）。用1μg胰蛋白酶/Lys-C混合物在37°C下消化蛋白质18小时。使用C18旋转板对肽进行脱盐，并通过蒸发去除溶剂。将肽溶解在0.1%甲酸、5%乙腈和95%水中，用于LCMS分析。使用Sciex TripleTOF仪器上的靶向方法来监测含有Cys-12的KRASG12C肽（一种内部参考肽）以及相应的同位素标记的肽。KRASG12C的参与度按照之前的报告进行计算。[2]

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kinact/KI的测量[2]
在室温下，将重组KRASG12C“Lite”（C51S/C80L/C118S）与一定浓度的MRTX849在25 mM HEPES（pH 7.0）、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、10 mM辛基β-吡喃葡糖苷和0.5 mM TCEP中反应0–45 s。在每个时间点，用50mM HCl猝灭反应，并加入0.25μg胃蛋白酶。将KRASG12C在37°C下消化4小时，并通过LCMS分析所得的含有Cys-12的肽。对于每种浓度的MRTX849，从0s对照样品计算每个时间点的修饰KRASG12C的百分比，随后根据ln（POC）相对于时间数据的斜率计算kobs。速率与浓度的数据符合Michaelis–Menten方程。

所有细胞系均保存在37℃、5%CO2的加湿培养箱中，并常规检查其支原体水平。使用 CellTiter-Glo 测定对 7 个 KRAS G12C 突变细胞系和 3 个非 KRAS G12C 突变细胞系进行细胞活力评估，这些细胞系在 12 天测定中使用 96 孔 ULA 板在 3D 条件下生长，或在 2D 组织中生长3 天测定中的培养条件。

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Cell Viability Assay[1]

Cell Types: MIA PaCa-2, H1373, H358, H2122, SW1573, H2030, KYSE-410 cells (G12C); H1299 (WT); A549 (G12S), HCT116 (G13D) cells
Tested Concentrations: 0.1, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM
Incubation Duration: 24 h
Experimental Results: Inhibits cell growth in the vast majority of KRAS G12C-mutant cell lines with IC₅₀ values ranging between 10 and 973 nM in the 2D format and between 0.2 and 1042 nM in the 3D format.

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Western Blot Analysis[1]

Cell Types: MIA PaCa-2 cells
Tested Concentrations: 0.24, 0.5, 1.0, 2.0, 3.9, 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1000 nM
Incubation Duration: 24 h
Experimental Results: Inhibits KRAS-dependent signaling targets including ERK1/2 phosphorylation (Thr202/Tyr204 ERK1; pERK), S6 phosphorylation (RSK-dependent Ser235/236; pS6) and expression of the ERK-regulated DUSP6, each with IC₅₀s in the single-digit nanomolar range in cell lines.

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细胞活力测定：培养17种KRAS G12C突变和3种非KRAS G12C突变的癌细胞系，设置2D（贴壁细胞培养3天）和3D（球体培养12天）培养体系。向培养基中加入不同浓度的Adagrasib，在规定的培养时间后，采用合适的方法检测细胞活力，从而评估Adagrasib对KRAS G12C突变癌细胞生长的抑制作用。

动物/疾病模型： MIA PaCa-2 模型（6-8 周龄，雌性，无胸腺裸鼠-Foxn1 nu 小鼠）[1]
剂量： 1、3、10、30、100 mg/kg
给药途径： 口服，连续 16 天，每日一次
实验结果： 在治疗后最早的肿瘤测量中观察到肿瘤快速消退，30 mg/kg 和 100 mg/kg 组的动物在研究第 15 天表现出完全缓解的迹象。给药于研究第 16 天停止，100 mg/kg 组的 4 只小鼠和 30 mg/kg 组的 7 只小鼠中的 2 只在研究第 70 天仍保持无瘤状态。

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向动物模型给药 Adagrasib采用灌胃法（具体溶剂和配方未在文献中描述）。设置30 mg/kg和100 mg/kg两个剂量组，观察不同时间点动物肿瘤体积的变化。结果显示，在治疗后最早的肿瘤测量中即可观察到肿瘤快速消退，部分动物达到完全缓解，部分动物在停药后仍能长期保持无瘤状态。

吸收、分布和排泄
阿达格拉西布的AUC和Cmax在400 mg至600 mg（批准推荐剂量的0.67至1倍）之间呈剂量比例增加。在推荐剂量下，阿达格拉西布在8天内达到稳态，蓄积量为6倍。阿达格拉西布的Tmax约为6小时。服用高脂肪高热量餐（900-1000卡路里，其中50%来自脂肪）对阿达格拉西布的药代动力学没有临床意义上的影响。阿达格拉西布具有较高的口服生物利用度，并且能够穿透中枢神经系统。
阿达格拉西布主要通过粪便和尿液排泄。在接受单剂量放射性标记的阿达格拉西布治疗的患者中，75%的剂量从粪便中回收（其中14%为原形），4.5%从尿液中回收（其中2%为原形）。
阿达格拉西布的表观分布容积为942升。
阿达格拉西布的表观口服清除率（CL/F）为37升/小时。

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代谢/代谢物
单次给药后，阿达格拉西布主要通过CYP3A4代谢。然而，由于多次给药后阿达格拉西布会抑制 CYP3A4，因此在稳态下，其他酶如 CYP2C8、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9 和 CYP2D6 也会参与其代谢。

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生物半衰期
阿达格拉西布的末端消除半衰期为 23 小时。

肝毒性
在阿达格拉西布（adagrasib）上市前针对携带KRAS G12C突变的实体瘤患者的临床试验中，肝功能异常较为常见，但通常为自限性且程度较轻。28%至46%的阿达格拉西布治疗患者出现不同程度的ALT升高，5%至7%的患者ALT升高超过正常值上限（ULN）的5倍。在这些纳入约366例患者的试验中，8%的患者因AST或ALT升高而提前终止阿达格拉西布治疗。此外，少数患者出现临床上明显的肝毒性，需要停止阿达格拉西布治疗。肝功能异常的中位发病时间为治疗开始后3周。虽然血清转氨酶偶尔会升高至正常值上限的 5 至 20 倍，但血清胆红素并未升高，也没有患者出现伴有黄疸的临床肝损伤。阿达格拉西布的产品说明书建议在治疗前、治疗的前 3 个月内每 3 周进行一次常规肝功能检查，之后根据临床需要进行检查。
可能性评分：D（可能导致但很少见的临床肝损伤）。

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蛋白结合
体外实验表明，阿达格拉西布的人血浆蛋白结合率为 98%。

[1]. Cancer Discov. 2020 Jan;10(1):54-71.

[2]. J Med Chem. 2020 Jul 9;63(13):6679-6693.

Adagrasib (MRTX849) 是由 Mirati Therapeutics 公司开发的一种口服小分子 KRAS 抑制剂。KRAS 突变在癌症中非常常见，约占所有 RAS 家族突变的 85%。然而，由于 KRAS 对鸟苷三磷酸 (GTP) 和鸟苷二磷酸 (GDP) 具有高亲和力，且缺乏明确的结合口袋，因此 KRAS 抑制剂的开发一直面临挑战。Adagrasib 靶向 KRASG12C（最常见的 KRAS 突变之一）的第 12 位半胱氨酸残基，从而抑制 KRAS 依赖性信号通路。在一项纳入 KRASG12C 突变型晚期实体瘤患者的 I/IB 期临床研究 (NCT03785249) 中，adagrasib 显示出抗肿瘤活性。同一项研究的II期结果显示，在KRASG12C突变型非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，adagrasib疗效显著且未发现新的安全性信号。2022年2月，FDA受理了adagrasib用于治疗既往接受过治疗的KRASG12C阳性NSCLC患者的新药申请（NDA）。2022年12月，FDA加速批准adagrasib用于治疗至少接受过一种既往全身治疗的KRASG12C突变型局部晚期或转移性NSCLC患者。Adagrasib是继sotorasib之后，又一种获得FDA批准的KRASG12C抑制剂。
Adagrasib是一种KRAS G12C突变蛋白的小分子抑制剂，该突变蛋白存在于高达13%的难治性非小细胞肺癌病例中。阿达格拉西布治疗期间，血清转氨酶升高较为常见，部分患者会出现临床上明显的肝损伤，且病情可能较为严重。
阿达格拉西布是一种口服小分子抑制剂，靶向致癌的KRAS基因G12C突变，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，阿达格拉西布与GDP结合的KRAS G12C的II型转换口袋中的胞嘧啶12共价结合，从而抑制突变KRAS依赖的信号传导。KRAS是RAS癌基因家族的成员，在细胞信号传导、分裂和分化中发挥着重要作用。 KRAS基因突变可诱导组成型信号转导，进而导致肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移。

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药物适应症
Adagrasib适用于治疗经FDA批准的检测确诊为KRAS G12C突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）成人患者，且这些患者此前至少接受过一种全身治疗。该适应症基于客观缓解率（ORR）和缓解持续时间（DOR）获得加速批准。该适应症的持续批准可能取决于在验证性试验中对临床获益的验证和描述。
治疗所有实体瘤和血液系统恶性肿瘤

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作用机制
在正常细胞中，KRAS通过与鸟苷三磷酸（GTP）结合而被激活，从而促进MAP激酶通路和细胞内信号转导的激活。当GTP水解为鸟苷二磷酸（GDP）时，KRAS失活。这种机制如同一个“开/关”系统，调控细胞生长。KRAS中Gly12被半胱氨酸取代（KRAS^G12C）会抑制GTP水解，使KRAS保持活性状态。因此，这种突变会导致细胞增殖和生长失控，以及恶性转化。Adagrasib是一种KRAS^G12C共价抑制剂，它能不可逆且选择性地结合KRAS^G12C，并将其锁定在与鸟苷二磷酸结合的非活性状态。因此，阿达格拉西布可抑制携带 KRAS^G12C 突变的癌症的肿瘤细胞生长和存活，且脱靶活性极低。

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药效学
阿达格拉西布的暴露-反应关系和药效学反应时间进程尚未阐明。使用阿达格拉西布可导致 QTc 间期延长。QTc 间期的延长与药物浓度相关。在每日两次服用 600 mg 阿达格拉西布的患者中，平均稳态最大浓度下 QTcF 较基线的平均变化 (ΔQTcF) 为 18 ms。使用阿达格拉西布还可能导致严重的胃肠道不良反应、肝毒性和间质性肺病/肺炎。

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- 作用机制：阿达格拉西布 是一种强效、选择性的共价 KRAS G12C 抑制剂。它能选择性地修饰GDP结合的KRAS G12C中的突变半胱氨酸12，从而抑制KRAS依赖性信号传导，发挥抗肿瘤作用。- 治疗效果：在治疗KRAS G12C突变型非小细胞肺癌方面显示出一定的疗效。临床试验中，它能使部分患者产生部分缓解，但缓解不持久，并会出现获得性耐药。例如，一名KRAS G12C突变型非小细胞肺癌患者最初对阿达格拉西布（Adagrasib）有部分缓解，但后来出现耐药，该耐药与继发性KRAS Y96D突变的出现有关，该突变影响了药物与KRAS开关II口袋的结合。- 适应症：主要用于治疗至少接受过一种既往全身治疗的KRAS G12C突变型局部晚期或转移性非小细胞肺癌成人患者。

C32H35CLFN7O2

604.1174

603.25

C, 63.62; H, 5.84; Cl, 5.87; F, 3.14; N, 16.23; O, 5.30

2326521-71-3

MRTX849 analog 24; 2490716-96-4; LC-2; 2502156-03-6

138611145

White to yellow solid powder

From > 262 mg/mL to < 0.010 mg/mL

5

88.8Ų

0

9

7

43

1060

2

CN1CCC[C@H]1COC2=NC3=C(CCN(C3)C4=CC=CC5=C4C(=CC=C5)Cl)C(=N2)N6CCN([C@H](C6)CC#N)C(=O)C(=C)F

PEMUGDMSUDYLHU-ZEQRLZLVSA-N

InChI=1S/C32H35ClFN7O2/c1-21(34)31(42)41-17-16-40(18-23(41)11-13-35)30-25-12-15-39(28-10-4-7-22-6-3-9-26(33)29(22)28)19-27(25)36-32(37-30)43-20-24-8-5-14-38(24)2/h3-4,6-7,9-10,23-24H,1,5,8,11-12,14-20H2,2H3/t23-,24-/m0/s1

2-[(2S)-4-[7-(8-chloronaphthalen-1-yl)-2-[[(2S)-1-methylpyrrolidin-2-yl]methoxy]-6,8-dihydro-5H-pyrido[3,4-d]pyrimidin-4-yl]-1-(2-fluoroprop-2-enoyl)piperazin-2-yl]acetonitrile

Adagrasib; MRTX 849; MRTX849; KRAZATI; Kras G12C inhibitor MRTX849; 8EOO6HQF8Y; Adagrasib [USAN]; MRTX-849; brand name: Krazati

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 25~100 mg/mL (41.4~165.5 mM)
Ethanol: ~100 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.62 mg/mL (4.34 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.14 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.14 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900μL玉米油中，混合均匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: in 5%DMSO+ 40%PEG300+ 5%Tween 80+ 50%ddH2O: 5.0mg/ml (8.28mM) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加),

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。