KRAS G12C

结束了一个被药物开发失败所破坏的时代，人们对直接靶向KRAS的兴趣减弱，并认为难以解决，新技术和策略正在帮助目标的复苏。如前所述，四氢吡啶并嘧啶被鉴定为KRASG12C的不可逆共价抑制剂，它们结合在KRAS的开关II口袋中，与半胱氨酸12形成共价键。使用基于结构的药物设计，结合集中的体外吸收、分布、代谢和排泄筛选方法，合成了类似物，以提高该系列的效力并降低代谢责任。描述了临床开发候选物MRTX849作为KRASG12C的强效选择性共价抑制剂的发现[1]。

KRASG12C目标参与度[1]
肿瘤片段在6 M胍-HCl、50 mM N-（2-羟乙基）哌嗪-N′-乙磺酸（HEPES）（pH 7.5）和5 mM TCEP中均化。离心后，使用Bradford测定法测定上清液的蛋白质浓度。将内标物（13C15N重组KRASG12C）和20 mM碘乙酰胺加入200μL裂解缓冲液中的200μg肿瘤蛋白中，并在37°C下在黑暗中孵育样品30分钟。烷基化后，使用96孔Zeba旋转板将100μL反应物交换为1 M胍-HCl、50 mM HEPES（pH 7.5）。在37°C下用1μg胰蛋白酶/Lys-C混合物消化蛋白质18小时。使用C18旋转板对肽进行脱盐，并通过蒸发去除溶剂。将肽溶解在0.1%甲酸、5%乙腈、95%水中，用于LCMS分析。使用Sciex TripleTOF仪器上的靶向方法监测含Cys-12的KRASG12C肽（一种内部参考肽）以及相应的同位素标记肽。KRASG12C的参与度是按照之前的报告计算的。

基于细胞的磷酸化ERK检测[1]
所有实验均在标准条件下（37°C和5%CO2）进行。采用四参数法通过剂量反应曲线拟合计算IC50值。将携带KRASG12C突变的NCI-H358细胞接种在补充有10%胎牛血清的RPMI中的96孔板中。将培养皿孵育过夜。用抑制剂孵育细胞3小时后，用磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤细胞一次，用3.8%甲醛固定，用冰冷的甲醇渗透。然后将平板与Li-Cor阻断缓冲液一起孵育。随后，通过与针对GAPDH（小鼠）和磷酸化ERK（兔）的一抗孵育，通过细胞内蛋白质法评估ERK的磷酸化。然后将平板与小鼠或兔特异性的荧光二抗一起孵育。在Li-Cor荧光平板阅读器上以680和800nm波长对平板进行成像。将磷酸化ERK信号归一化为GAPDH信号，并生成POC值[1]。

体内研究[1]
小鼠饲养于无病原体（SPF）条件下，并自由摄取食物和水。将6-8周龄的雌性无胸腺裸鼠（Foxn1nu）右后侧皮下注射NCI-H358或MIA PaCa-2细胞，细胞悬液为100 μL PBS和Matrigel基质混合液，细胞浓度为5.0 × 10⁶个，细胞与Matrigel的比例为50:50。每日监测小鼠健康状况，当肿瘤可触及时开始使用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积的计算公式为0.5 × L × W²，其中L代表肿瘤长度，W代表肿瘤宽度。当肿瘤平均体积达到约350 mm³时，将小鼠随机分组。小鼠经口灌胃给予赋形剂（10% 研究级 Captisol，溶于 50 mM pH 5.0 的柠檬酸缓冲液）或赋形剂（研究化合物），剂量如所示。在疗效研究中，动物经口给予研究化合物或赋形剂，并每日监测，每周测量 3 次肿瘤大小，每周测量 2 次体重。疗效图中的研究日表示化合物给药后的第二天。在药代动力学/药效学研究中，于指定时间点和浓度范围内，单次给药后采集肿瘤和血浆样本。

[1]. Jay B Fell, et al. Identification of the Clinical Development Candidate MRTX849, a Covalent KRAS G12C Inhibitor for the Treatment of Cancer. J Med Chem. 2020 Jul 9;63(13):6679-6693.

稳定性——添加GSH的肝细胞溶胶[1]
将化合物（1 μM）在37 °C下于1 mg/mL肝细胞溶胶中孵育30分钟，该溶胶在KPB缓冲液中添加了5 mM GSH。在指定时间点结束时，用添加了40 mM NEM和0.2 μM拉贝洛尔（内标）的乙腈终止反应。离心后，用LC-MS/MS分析上清液。

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全血稳定性[1]
将化合物（5 μM）在37 °C下于1:1 (v/v)血液和PBS（pH 7.4）混合液中孵育30、60和240分钟。稀释后的血液在 37 °C 和 100% 湿度下预孵育 15 分钟，然后加入化合物启动反应。在每个指定时间点结束时，将红细胞与水按 1:1 的比例裂解，以 600 rpm 的速度混合 1 分钟，然后用含有 0.625 μM 拉贝洛尔（内标）的乙腈终止反应。样品经离心后，取上清液进行LC-MS/MS分析。

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kinact/KI[1]的测定
将重组KRASG12C“Lite”（C51S/C80L/C118S）与不同浓度的MRTX849在25 mM HEPES（pH 7.0）、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、10 mM辛基β-吡喃葡萄糖苷和0.5 mM TCEP的反应体系中于室温下反应0-45秒。在每个时间点，用50 mM HCl终止反应，并加入0.25 μg胃蛋白酶。KRASG12C在37℃下消化4小时，所得含Cys-12的肽段用LCMS分析。在每个时间点，根据每种 MRTX849 浓度的 0 秒对照样品计算修饰的 KRASG12C 的百分比，然后根据 ln(POC) 与时间数据的斜率计算 kobs 值。速率与浓度数据符合米氏方程。

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肝细胞代谢物鉴定[1]
将冷冻保存的小鼠、大鼠、犬和人肝细胞解冻，并使用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基稀释至 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的活细胞密度。向 1 mL 各肝细胞悬液中加入 MRTX849 (10 μM)，并在 37 °C 下孵育 2 小时。加入 1% 甲酸终止代谢，离心后将上清液上样至 3 cc Oasis HLB 固相萃取柱。 MRTX849及其代谢物用5%甲醇水溶液洗涤，并用100%甲醇洗脱。溶剂在氮气流下蒸发，代谢物用150 μL 30:70 (v/v)乙腈/水溶液复溶。代谢物在Gemini NX-C18色谱柱上分离，并通过290 nm波长下的吸光度和质谱进行检测。代谢物的相对含量通过290 nm波长下的吸光度峰强度确定，生物转化通过相关的m/z和MS/MS碎片模式进行表征。

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NCI-H358蛋白质组半胱氨酸选择性分析[1]
将NCI-H358细胞用3 μM MRTX849处理3小时，然后用含1% NP-40的裂解缓冲液裂解并进行超声处理。细胞提取物用 5 mM 碘乙酰胺脱硫生物素处理 1 小时（室温）。蛋白质用丙酮沉淀，并重悬于含有 6 M 盐酸胍、50 mM HEPES（pH 7.5）和 5 mM TCEP 的缓冲液中，于 65 °C 孵育 15 分钟。经碘乙酰胺处理后，将缓冲液置换为 1 M 盐酸胍、50 mM HEPES（pH 7.5），然后用胰蛋白酶/Lys-C 消化过夜。脱硫生物素化的肽段用链霉亲和素琼脂糖富集，并用 50% 乙腈和 0.1% TFA 洗脱。溶剂通过蒸发去除，肽段重悬于 0.1% 甲酸、5% 乙腈和水中。样品在 Sciex 6600 TripleTOF 质谱仪上进行分析。使用 Protein Pilot 5 软件，通过数据依赖型 MS/MS 扫描鉴定脱硫生物素标记的肽段，并使用 SWATH 分析进行相对定量（MTRX849 处理组与对照组）。

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点击化学靶标鉴定[1]
将两瓶 NCI-H358 细胞（每瓶 6000 万个细胞）接种于 RPMI 1640 SILAC 轻培养基中，并用 DMSO 处理作为对照；另将两瓶接种于 RPMI 1640 SILAC 重培养基（含 13C6-赖氨酸和 13C6,15N4-精氨酸）中的细胞用 1 μM MRTX849 在 37 °C 下处理 3 小时。所有细胞随后均用 2 μM 化合物 24 在 37 °C 下处理 3 小时。随后，将细胞用 50 mM HEPES、150 mM NaCl、0.5% Triton-X 100、1 mM EDTA、1 mM EGTA 和 HALT 蛋白酶抑制剂混合物裂解 5 分钟，进行超声破碎，离心，并用 45 μm 针筒式过滤器过滤上清液。每个重复实验中，将 4 mg “轻”裂解液中的蛋白质与 4 mg “重”裂解液中的蛋白质混合进行样品处理。使用氯仿/甲醇沉淀法分离蛋白质，将其重悬于 0.18% 十二烷基硫酸钠 (SDS) 的 50 mM HEPES (pH 7.5) 缓冲液中，并在室温下与 5 mM 抗坏血酸、1 mM CuSO4 和 2 mM BTTAA 孵育 2.5 小时，进行叠氮琼脂糖“点击”反应。将树脂结合的蛋白质用 10 mM DTT 处理 40 分钟，再用 20 mM 碘乙酰胺处理 30 分钟，然后依次用以下溶液洗涤：(1) 100 mM Tris（pH 8.0）、250 mM NaCl、1% SDS、5 mM EDTA；(2) 8 M 尿素、100 mM Tris（pH 8.0）；(3) 20% 乙腈水溶液。向蛋白结合的树脂中加入 1 μg 胰蛋白酶/Lys-C，悬浮于 20 mM Tris（pH 8.0）、2 mM CaCl₂、10% 乙腈溶液中，并在 37 °C 下孵育 18 小时。洗脱的肽段经C18旋转柱脱盐，蒸发除去溶剂，然后将肽段重悬于0.1%甲酸、5%乙腈和水中，用于LCMS分析。样品在Sciex 6600 TripleTOF质谱仪上进行分析。使用Protein Pilot 5软件从未标记样品的基于数据的MS/MS扫描中鉴定肽段，并使用SILAC样品的SWATH分析进行相对定量（MTRX849处理组与对照组）。

C36H39CLFN7O2

656.19

655.283

2490716-96-4

Adagrasib;2326521-71-3

162642619

Typically exists as White to off-white solid at room temperature

6

88.8Ų

0

9

10

47

1200

2

C=C(C(=O)N1CCN(C[C@@H]1CC#N)C2=NC(=NC3=C2CCN(C3)C4=CC=CC5=C4C(=CC=C5)Cl)OC[C@@H]6CCCN6CCCC#C)F

YUPCFANWZUHYAJ-NSOVKSMOSA-N

InChI=1S/C36H39ClFN7O2/c1-3-4-5-17-42-18-8-11-28(42)24-47-36-40-31-23-43(32-13-7-10-26-9-6-12-30(37)33(26)32)19-15-29(31)34(41-36)44-20-21-45(35(46)25(2)38)27(22-44)14-16-39/h1,6-7,9-10,12-13,27-28H,2,4-5,8,11,14-15,17-24H2/t27-,28-/m0/s1

2-[(2S)-4-[7-(8-chloronaphthalen-1-yl)-2-[[(2S)-1-pent-4-ynylpyrrolidin-2-yl]methoxy]-6,8-dihydro-5H-pyrido[3,4-d]pyrimidin-4-yl]-1-(2-fluoroprop-2-enoyl)piperazin-2-yl]acetonitrile

MRTX-849 analog 24; MRTX849 analog 24

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~76.20 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。