Nitro blue tetrazolium chloride   中文名称: 氯化硝基四氮唑兰

Fluorescent dye reagent; dehydrogenase

NBT和BCIP染色方案
1. 材料
二甲基甲酰胺（DMF）
氯化硝基蓝四唑（NBT）储备液：将0.5 g NBT溶解在10 mL 70%DMF（水中）中
BCIP储备液：将0.5克BCIP溶解在10毫升100%DMF中
底物缓冲液：100 mM二乙醇胺缓冲液（pH 9.5），含有100 mM NaCl和5 mM MgCl2。
2. 方法
2.1 制备NBT/BCIP溶液时，将66µL NBT储备溶液加入10 mL底物缓冲液中并充分混合。向溶液中加入33μL BCIP储备液。在1小时内使用NBT/BCIP溶液
2.2 将印记（或印迹）放入合适的容器中，加入NBT/BCIP溶液。15×15cm2的膜取10 mL溶液
在室温下搅拌并孵育印记（或印迹），直到条带适当变暗。通常需要30分钟左右
2.3 去除NBT/BCIP溶液，用水冲洗印记以终止反应。

材料和方法[1]
两个成像系统用于激发和检测NBT/BCIP染色。第一种是蔡司LSM 510激光扫描共聚焦显微镜，配备633 nm氦氖（HeNe）激光器和650 nm长通发射滤光片，用于检测NBT/BCIP信号。长通滤光片收集650nm以上的所有发射光。第二个是蔡司Axio Imager Z1系统，该系统具有汞弧灯源、645-685 nm激发带通滤光片和760 nm长通发射滤光片，通过安装在相机端口焦平面上的200µm芯光纤连接到Ocean Optics HR2000电荷耦合器件（CCD）光谱仪，用于确定发射光谱。光纤只收集落在其纤芯上的光，对于本工作中使用的蔡司EC Plan Neofluar®40×/1.3数值孔径（NA）物镜，纤芯定义了直径为5µm的样品区域。使用光纤支架中的x-y转换器将图像和光谱（光纤芯）对准目镜十字准线，建立图像和光谱之间的空间相关性。[1]
NBT/BCIP染色方案如下：用DIG标记的核糖探针孵育的斑马鱼和七鳃鳗全胚胎用与AP偶联的绵羊抗DIG抗体（1:3000）进行免疫标记。随后，根据制造商的说明，用NBT/BCIP溶液对它们进行处理，以获得深紫色NBT/BCIP染色。NBT/BCIP染色后的免疫组织化学按如下方式进行：将抗绿色荧光蛋白（GFP）抗体（1:500）和抗连环蛋白（1:100）与胚胎在4°C下孵育过夜，然后与抗兔或抗小鼠Alexa结合的次级（1:200）孵育。将染色的胚胎包埋在4%NuSieve®GTG低熔点琼脂糖中，并用Vibratome®1000切片系统切成100或200µm的切片进行成像。 [1]
对于整个样本的投影视图（图1F），将胚胎嵌入4%的低熔点琼脂糖中，胚胎的背侧平行于成像平面。如前所述，Z切片以1.5-µm的间隔成像。然后使用蔡司LSM软件沿y轴投影包含染色组织的Z切片子集。[1]
通过将20mg NBT二氯化物溶解在25mL无水乙醇中制备NBT-DF。在搅拌下加入硼氢化钠溶液（100mg在10mL无水乙醇中）。形成深紫色沉淀，静置过夜。过滤沉淀物，用无水乙醇洗涤，然后用丙酮洗涤。继续进行丙酮洗涤，直至洗涤液澄清（约30mL），以去除单甲氮。所得固体呈蓝黑色。沉淀物可溶于硝基苯，硝基苯结晶得到紫色针状物。该产品在硝基苯中的溶液的可见/近红外（VIS/NIR）吸收光谱与之前报道的光谱一致（数据未显示）。

原位杂交技术通常采用酶扩增的显色染色来检测基因表达的结构域。我们证明了以前未报道的由常用发色剂硝基蓝四唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）形成的深紫色染料的近红外（NIR）荧光。固体反应产物具有显著的荧光，使共聚焦显微镜能够产生基因表达的高分辨率三维（3-D）成像[1]。

采用NBT/BCIP显色染色的荧光原位杂交（FISH）实验中，先将细胞用适宜固定剂固定并透化处理，以提高探针穿透力。将特异性核酸探针与细胞内靶序列在优化的温度和时间条件下进行杂交，杂交后通过严格洗涤去除未结合探针。随后，向细胞中加入碱性磷酸酶（AP）标记的二抗结合物，使其与杂交探针结合。接着，加入含氯化硝基蓝四氮唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸（BCIP）的显色底物混合物，在室温避光条件下孵育特定时间，使AP催化氯化硝基蓝四氮唑/BCIP转化为不溶性紫蓝色沉淀，沉积于靶序列位点。最后，冲洗细胞终止反应，在光学显微镜下观察杂交信号[1]

[1]. Fluorescent in situ hybridization employing the conventional NBT/BCIP chromogenic stain. Biotechniques. 2007 Jun;42(6):756-9.

Nitroblue tetrazolium dichloride is an organochloride salt with nitroblue tetrazolium(2+) as its counterion. It contains nitroblue tetrazolium(2+). This dye is colorless to yellow and can be reduced to blue or black formazan crystals by certain cells; it has been used to differentiate between non-bacterial and bacterial diseases, the latter of which can lead to neutrophil reduction of the dye; it has also been used to diagnose chronic granulomatous disease. Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) is also used to differentiate between non-bacterial and bacterial diseases, the latter of which can lead to neutrophil reduction of the dye; it has also been used to diagnose chronic granulomatous disease. It is a microscopic staining agent used to detect dehydrogenases and alkaline phosphatases. In summary, we report previously undescribed fluorescent properties of the NBT-DF/BCI reaction product derived from the NBT/BCIP staining protocol. We have demonstrated that this substance can be used as a near-infrared fluorescent label, thereby achieving cell resolution in whole-slide in situ hybridization studies. Although both components of the reaction product are fluorescent, NBT-DF is the dominant near-infrared fluorophore in the sample. Red excitation and near-infrared emission are well-suited for whole slides because longer wavelengths of light are less scattered in tissues and most samples exhibit low autofluorescence in this wavelength range; furthermore, its emission spectrum is easily distinguishable from the autofluorescence of the matrix tissue and most fluorescent markers. Therefore, near-infrared emission will facilitate multi-labeled NBT/BCIP staining by combining visible fluorophores. This paper demonstrates that current NBT/BCIP in situ hybridization schemes combined with optical sectioning techniques can achieve single-cell resolution without the need to develop new fluorescence in situ hybridization methods. [1]

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Nitroblue tetrazolium chloride is a commonly used chromogenic substrate, often used in conjunction with BCIP for immunohistochemistry and in situ hybridization experiments. [1]
It acts as an electron acceptor in alkaline phosphatase-catalyzed reactions: the enzyme hydrolyzes BCIP to generate a product that reduces nitroblue tetrazolium chloride to form an insoluble purple-blue formazan precipitate, thereby allowing visualization of target molecules or sequences. [1]
In reported FISH experiments, it is used to detect hybridization signals, providing clear and stable colorimetric results for the identification of target nucleic acid sequences in cells. [1]

C40H30CL2N10O6

817.6356

816.172

298-83-9

9281

Light yellow to yellow solid powder

1.5521 (rough estimate)

200ºC

1.7350 (estimate)

1.29

179.28

0

12

9

58

1180

0

FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L

InChI=1S/C40H30N10O6.2ClH/c1-55-37-25-29(13-23-35(37)47-43-39(27-9-5-3-6-10-27)41-45(47)31-15-19-33(20-16-31)49(51)52)30-14-24-36(38(26-30)56-2)48-44-40(28-11-7-4-8-12-28)42-46(48)32-17-21-34(22-18-32)50(53)54;;/h3-26H,1-2H3;2*1H/q+2;;/p-2

2-[2-methoxy-4-[3-methoxy-4-[3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazol-2-ium-2-yl]phenyl]phenyl]-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazol-2-ium;dichloride

298-83-9; Nitrotetrazolium Blue chloride; Nitroblue tetrazolium chloride; Nitro Blue tetrazolium chloride; nitro bt; Nitro Blue tetrazolium; NBT; Nitrotetrazolium Blue;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

70%DMF : 100 mg/mL (~122.30 mM)
DMSO : ~33.33 mg/mL (~40.76 mM)
H2O : ~8 mg/mL (~9.78 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。