α7 nicotinic acetylcholine receptor (α7 nAChR) [1]
PKCα, ERK1/2 (physiological kinases for Bcl2 and c-Myc) [1]

NNK（100 pM；0-60 分钟）通过刺激 PKCα 和 MAPK ERK1/2 的激活，直接导致 c-Myc 磷酸化 [1]。NNK（100 pM；96 小时）可促进表达野生型 (WT) 的细胞增殖，但对表达 AAc-Myc 突变体的细胞无此作用 [1]。Western blot 检测显示，NNK（100 pM）在 NCI-H69 细胞中特异性地诱导 Bcl2 在 Ser70 位点的磷酸化，并在 15 分钟时达到峰值，同时诱导 c-Myc 在 Thr58 和 Ser62 位点的磷酸化，这通过双磷酸化特异性抗体检测得到 [1]。NNK（100 pM）显著刺激 NCI-H69 细胞的增殖（如图所示）。 [1]
用顺铂 (10 μM) 处理 96 小时后，NNK (100 pM) 可增强表达野生型 Bcl2 的细胞的存活率，但对表达 S70A Bcl2 突变体的细胞无此作用，该结果通过膜联蛋白 V 结合（活细胞百分比）测定。[1]
与野生型相比，在没有 NNK 的情况下，磷酸化模拟突变体 S70E Bcl2 的表达表现出更强的抗凋亡活性；NNK 对表达 S70E 的细胞没有额外的存活作用。[1]
用 WST-1 法测定，96 小时后，NNK (100 pM) 可增强表达野生型 c-Myc 的 H1299 细胞的增殖，但对表达不可磷酸化的 AA (T58A/S62A) c-Myc 突变体的细胞无此作用。 [1]
NNK 可在 60 分钟内诱导 NCI-H82 细胞中 PKCα 和 ERK1/2 的激活，但对 JNK1 或 p38 无影响。[1]
星形孢菌素（PKC 抑制剂）和 PD98059（MEK 抑制剂）以剂量依赖的方式阻断 NNK 诱导的 Bcl2 和 c-Myc 磷酸化，并降低 NNK 诱导的细胞增殖。与野生型相比，表达 S70E Bcl2 的细胞对星形孢菌素或 PD98059 的抑制作用不敏感。[1]
α-银环蛇毒素（α7 nAChR 特异性抑制剂）阻断 NNK 诱导的 Bcl2 和 c-Myc 磷酸化，抑制 NNK 诱导的 ERK1/2 激活，并显著降低 NNK 刺激的细胞增殖。 [1]
如共免疫沉淀实验所示，NNK促进Bcl2与c-Myc之间的直接相互作用；这种相互作用可被α-BTX以剂量依赖的方式抑制。磷酸化模拟物S70E Bcl2与c-Myc的结合率约为50%，而S70A几乎没有结合（<1%）。[1]
Bcl2/c-Myc的结合延长了c-Myc蛋白的半衰期：在表达S70E Bcl2的H82细胞中，结合态c-Myc的半衰期>60分钟，而游离态c-Myc的半衰期约为30分钟（脉冲追踪分析）。[1]

PKCα活性测定：用NNK处理细胞后，从细胞裂解液中免疫沉淀PKCα。将免疫沉淀的PKCα悬浮于激酶测定缓冲液中，该缓冲液包含20 mM Hepes（pH 7.4）、100 μM CaCl₂、10 mM MgCl₂、200 μg/ml组蛋白-1、100 μM ATP、100 μg/ml磷脂酰丝氨酸、2 μCi [γ-³²P]ATP和0.03% Triton X-100。混合物在30℃孵育30分钟。加入2× SDS上样缓冲液并煮沸5分钟终止反应。样品经SDS-PAGE分离，并通过放射自显影法测定PKCα活性。 [1]
体外Bcl2和c-Myc磷酸化：使用特异性抗体从细胞裂解液中免疫沉淀Bcl2或c-Myc。然后将免疫复合物与纯化的活化PKCα、ERK1或ERK2在含有[γ-32P]ATP的测定缓冲液中孵育。通过放射自显影分析磷酸化情况。[1]
肝和肺微粒体中NNK代谢：孵育体系包含5 μCi [5-3H]NNK、5 mM MgCl2、5 mM葡萄糖-6-磷酸、2.5 mM NADP+、5单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、8 mg微粒体蛋白和0.1 M Tris-Cl缓冲液（pH 7.5），总体积为4 ml。通过加入底物启动反应，并在37°C下进行15分钟。加入3 ml冰乙醇终止反应。采用高效液相色谱法（HPLC）测定NNK代谢物。[2]

Western blot 分析
细胞类型： NCI-H82 细胞 [1]
测试浓度： 100 pM
孵育时间： 0-60 分钟
实验结果： 刺激 PKCα 和 MAPK ERK1/2 的激活，并直接诱导 c-Myc 磷酸化。

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细胞凋亡分析
细胞类型：H1299肺癌细胞[1]
测试浓度：100 pM
孵育时间：96小时
实验结果：表达野生型c-Myc而非T58A/S62A突变体的细胞增殖增强。

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代谢标记和Bcl2磷酸化分析：用无磷酸盐RPMI培养基洗涤细胞，并用³²P正磷酸进行90分钟的代谢标记。激动剂或抑制剂处理后，用冰冷的PBS洗涤细胞，并在去污剂缓冲液中裂解细胞。使用Bcl2抗体进行Bcl2免疫沉淀。将样品进行10-20%梯度SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜，并进行胶片曝光。 Bcl2磷酸化通过放射自显影法测定，并用Bcl2抗体对同一滤膜进行Western blotting检测。[1]
c-Myc磷酸化评估：细胞用NNK处理不同时间后收集并裂解。使用Thr58/Ser62双磷酸化特异性c-Myc抗体通过Western blotting检测c-Myc的磷酸化。用c-Myc抗体对同一滤膜进行复染，以定量总c-Myc蛋白。[1]
细胞增殖实验（WST-1）：将细胞以2×10⁴个/孔的密度接种于100 μl培养基中，并在有或无各种抑制剂的情况下用NNK处理。使用基于线粒体脱氢酶在活细胞中裂解四唑盐WST-1的比色法评估细胞增殖，并使用酶标仪分析吸光度。 [1]
细胞活力检测（Annexin-V）：使用Annexin-V试剂盒检测凋亡细胞和活细胞。通过流式细胞仪分析确定Annexin-V低表达细胞（活细胞）或Annexin-V高表达细胞（凋亡细胞）的百分比。细胞活力也通过台盼蓝染色排除法进行验证。[1]
c-Myc半衰期脉冲追踪分析：将细胞用³⁵S甲硫氨酸代谢标记60分钟，然后洗涤并在新鲜的富含甲硫氨酸的培养基中孵育不同时间点（最长60分钟）。在每个时间点收集细胞，裂解细胞，并使用c-Myc抗体对³⁵S标记的c-Myc进行免疫沉淀。使用 Bcl2 抗体对 Bcl2 结合的 c-Myc 进行共免疫沉淀，然后用 c-Myc 抗体从同一裂解液中免疫沉淀未结合的 c-Myc。将样品进行 SDS-PAGE 电泳，并通过电子放射自显影法测定半衰期。[1]
RNA 干扰敲低 c-Myc：使用脂质体转染法将 c-Myc siRNA（21 个碱基的双链）转染到细胞中。使用对照 siRNA（与任何已知基因序列均无同源性）作为阴性对照。通过蛋白质印迹法分析 c-Myc 的表达水平。处理后评估细胞活力或增殖情况。[1]
亚细胞组分分离：将细胞匀浆并离心，以分离核、线粒体和胞质组分。线粒体沉淀物通过13,000×g离心获得，核沉淀物通过500×g离心获得。纯度通过检测prohibitin（线粒体标志物）和增殖细胞核抗原（核标志物）进行确认。[1]

本研究使用6-7周龄的雌性A/J小鼠。将NNK溶于自来水中，通过饮水灌胃给药，持续7周。NNK的初始浓度为62.4 μg/ml，之后根据每笼小鼠的饮水量进行调整。总剂量为9.0-9.4 mg/只（高剂量，约188 μg/只/天）或3.1 mg/只（低剂量，约62 μg/只/天）。从NNK处理前2周开始，小鼠自由采食AIN-76A粉状饲料或添加化学预防剂的饲料，直至实验结束。所有小鼠在致癌物处理结束后16周进行解剖。肺脏和主要器官用Tellyesniczky氏固定液固定7天，并在解剖显微镜下计数表面腺瘤。 [2]
胃肠道吸收研究：测定了[5-3H]NNK从离体胃和十二指肠的吸收率。将NNK溶解于pH值为2.0（胃）或7.4（十二指肠）的林格氏液中，并注入结扎的组织中。每隔15分钟（胃）或5分钟（十二指肠）测量吸收物的放射性。[2]

吸收、分布和排泄
大量研究已探讨了NNK及其代谢物4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)在人体和实验动物体内的代谢，以及其与DNA的加合物形成；DNA加合物的代谢途径和结构已被全面表征。在无烟烟草使用者的唾液中检测到了NNK和NNAL，并且在人尿液中定量检测到了NNAL及其另一种代谢物NNAL-葡萄糖醛酸苷。这些代谢物是烟草制品暴露特有的（例如，吸烟者、无烟烟草使用者以及暴露于二手烟的非吸烟者），它们的存在表明NNK在人体内被吸收和代谢。对这些代谢物的定量可以估算NNK的吸收剂量。剂量计算表明，长期使用烟草制品30年或以上的个体摄入的NNK总量大致相当于在大鼠体内诱发肿瘤的总量。
通过在血浆和尿液中检测到NNK代谢物4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)和NNAL-葡萄糖醛酸苷(Gluc)，以及在尿液中检测到NNAL-N-氧化物，证实了无烟烟草使用者对NNK的吸收。吸烟者也获得了类似的结果，尽管NNAL仅在血浆中检测到。在吸烟者的尿液中，NNAL-N-Gluc占总NNAL-Gluc的50±25%，而在鼻烟使用者中，这一比例为24±12%。图姆巴克烟斗吸烟者体内排泄的NNAL和NNAL-Gluc水平异常高（每日0.12至0.14毫克），表明人体对NNK的吸收率高于任何其他非职业性致癌物。在吸烟母亲的羊水中检测到了4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇（NNAL），但未检测到NNAL-Gluc。在吸烟母亲的新生儿尿液中检测到了NNAL和NNAL-Gluc，但在非吸烟母亲的新生儿尿液中未检测到。这些结果表明，NNK在子宫内转化为NNAL，并且NNAL可以穿过胎盘屏障，在胎儿发育后期被吸收并代谢为NNAL-Gluc。戒烟或停止使用无烟烟草制品后，4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇 (NNAL) 和 NNAL-Gluc 的尿排泄速度比根据其结构预期的要慢。戒烟一周后，尿液中仍可检测到基线水平 34.5% 的 NNAL 和 NNAL-Gluc，而结构相关的化合物可替宁和尼古丁的检测率分别为 1.1% 和 0.5%。即使在戒烟六周后，尿液中仍残留 7.6% 的 NNAL 和 NNAL-Gluc。NNAL 和 NNAL-Gluc 的分布半衰期为 3 至 4 天，消除半衰期为 40 至 45 天。 NNAL 的总清除率估计为 61.4 ± 35.4 mL/min，β 相分布容积估计为 3800 ± 2100 L，表明其在组织中分布广泛。停止使用无烟烟草后，吸烟者体内 NNAL（1.32 ± 0.85 天 vs. 3.35 ± 1.86 天）和 NNAL-Gluc（1.53 ± 1.22 天 vs. 3.89 ± 2.43 天）的分布半衰期均显著缩短。末端半衰期无显著差异。/NNAL/
有关 4-(N-亚硝基甲基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（共 10 项）的吸收、分布和排泄的更完整数据，请访问 HSDB 记录页面。

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代谢/代谢物
许多研究报告称，通过测量尿液代谢物4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇及其葡萄糖醛酸苷（总NNAL）来评估NNK的吸收，但文献中缺乏关于无烟烟草使用者体内NNK剂量转化为NNAL百分比的数据。……15名男性受试者在吸烟前3周戒烟，并在吸烟前30分钟将2克无烟烟草置于脸颊和牙龈之间。他们继续戒烟，并连续三个24小时收集尿液样本。本研究测量了吸烟前后烟草和唾液中的NNK含量。计算出的NNK剂量与接下来72小时内排出的总NNAL量进行了比较。这些数据结合之前的药代动力学数据表明，无烟烟草使用者体内NNK转化为总NNAL的比例约为14%至17%。该值可用于计算无烟烟草使用者每日NNK暴露量（约6微克）。本研究结果还表明，无烟烟草使用者体内NNK的主要代谢途径是代谢活化为可与DNA反应的中间体。NNK可转化为吡啶氧化产物4-(甲基亚硝基氨基)-1-[3-(6-羟基吡啶基)]-1-丁酮(6-HONNK)和NNK-N-氧化物。脱亚硝基化后，NNK被氧化为肌氨酸。NNK可取代NADP+或NADPH中的烟酰胺，生成NNK腺苷二核苷酸磷酸((NNK)ADP+)和(NNK)ADPH（还原型）。 NNK的羰基还原生成NNAL，NNAL可通过葡萄糖醛酸化进一步转化为四种NNAL-Gluc非对映异构体：两种4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-(O-β-D-葡萄糖醛酸吡喃糖苷)丁烷异构体(NNAL-O-Gluc)和两种4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基-N-β-D-葡萄糖醛酸吡喃糖苷)-1-丁烷内盐异构体(NNAL-N-Gluc)。NNAL也可转化为NNAL-N-氧化物和NNAL(ADP+)。NNK与4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)的α-羟基化反应生成DNA和血红蛋白加合物。 NNK甲基羟基化生成4-(羟甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(α-HOMeNNK)，后者可与葡萄糖醛酸结合生成α-HOMeNNK-Gluc。α-HOMeNNK自发分解生成4-氧代-4-(3-吡啶基)-1-丁烷重氮氢氧化物(POB-DZH)和甲醛。POB-DZH与水反应生成4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(HPB)，后者可与葡萄糖醛酸结合生成HPB-Gluc。POB-DZH还可与DNA和血红蛋白反应生成一系列加合物。 NNK亚甲基的α-羟基化生成4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-(4-羟基)丁酮（α-HOMethyleneNNK）。该代谢物自发分解为4-(3-吡啶基)-4-氧代丁醛（酮醛）和甲基重氮氢氧化物（Me-DZH）。酮醛进一步代谢为4-(3-吡啶基)-4-氧代丁酸（酮酸），后者可转化为4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸（羟基酸）。如图2和图5所示，Me-DZH与水反应生成甲醇，与DNA反应生成甲基加合物。类似地，NNAL的亚甲基发生α-羟基化反应生成4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-(4-羟基)丁醇（α-HOMethyleneNNAL），其甲基发生α-羟基化反应生成4-(羟甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇（α-HOMeNNAL）。α-HOMethyleneNNAL自发分解为Me-DZH和5-(3-吡啶基)-2-羟基四氢呋喃（内酯醇），后者可转化为羟基酸。 α-亚甲基NNAL可自发分解为4-羟基-4-(3-吡啶基)-1-丁烷重氮氢氧化物（PHB-DZH）和甲醛。PHB-DZH与水反应生成4-(3-吡啶基)丁烷-1,4-二醇（二醇），二醇环化生成2-(3-吡啶基)四氢呋喃（吡啶基四氢呋喃），并可与DNA和血红蛋白反应生成加合物。细胞色素P450（CYP）是人和啮齿动物体内NNK α-羟基化的主要催化剂。人CYP在NNK代谢中的相对效率（从最高到最低）为：2A13 > 2B6 > 2A6 > 1A2 ~ 1A1 > 2D6 ~ 2E1 ~ 3A4。这些酶在体内实际参与NNK代谢取决于多种因素，包括相对表达水平、特定组织中CYP氧化还原酶的表达水平、各CYP的组织定位和诱导性，以及人体组织中NNK的浓度。在肝脏CYP中，CYP2B6对NNK的亲和力最高。然而，大多数肝脏样本中该酶的含量较低。CYP2A6的含量也相对较低，仅占总CYP的1%至4%。CYP1A2的含量比CYP2A6高4至20倍。因此，尽管CYP1A2的Km值略高，Vmax/Km值略低，但它很可能像CYP2A6一样，是人肝脏中NNK α-羟基化的重要催化剂。 CYP3A4 也可能参与肝脏 NNK 的 α-羟基化，因为其浓度通常比 CYP2A6 高 10 到 50 倍。不能完全排除肝脏中存在 CYP2A13（目前已知最重要的 NNK 代谢催化剂）。然而，肝脏中 CYP2A13 的 mRNA 水平远低于 CYP2A6，这表明即使该酶存在，其水平也极低。迄今为止，尚未确定肝脏中有任何单一的 CYP 酶是 NNK 活化的关键参与者。包括 CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6 和 CYP3A4 在内的多种酶显然都发挥着作用。这些 CYP 酶的相对贡献因人而异，它们的相对丰度和催化效率表明，其中很少有（如果有的话）是主要的催化剂。有关 4-(N-亚硝基甲基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（共 19 种代谢物）的更完整代谢物数据，请访问 HSDB 记录页面。
4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮 (NNK) 已知的三手烟代谢物包括 4-羟基-4-吡啶-3-基丁醛、4-氧代-4-吡啶-3-基丁烷-1-重氮盐、5-(3-吡啶基)-四氢呋喃-2-酮（内酯）和 5-(3-吡啶基)-2-羟基四氢呋喃（内酯醇）。 NNAL-O-葡糖醛酸苷、NNAL-N-葡糖醛酸苷、4-[(羟甲基)亚硝基氨基]-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、1-(甲基亚硝基氨基)-4-(3-吡啶基)-1,4-丁二醇、NNAL-N-氧化物、1-(3-吡啶基)-1,4-丁二醇（1,4-二醇）、3-(氧杂环戊烷-2-基)吡啶、4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮 (HPB)、4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮 (NNK)、4-羟基-4-(3-吡啶基)-丁酸 (HPBA)、4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇 (NNAL)、异构NNAL α-[3-[(羟甲基)亚硝基氨基]丙基]-3-吡啶甲醇、4-氧代-4-(吡啶-3-基)丁醛、2-羟基-1-吡啶-3-基丙-1-酮、NNK-N-氧化物、4-氧代-4-(3-吡啶基)丁酸 (OPBA) 和 4-羟基-4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮。4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮 (NNK) 是一种已知的三手烟代谢物。
已知的 NNK 人体代谢物包括 4-[(羟甲基)亚硝基氨基]-1-(3-吡啶基)-1-丁酮。

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吸收：NNK 在十二指肠的吸收速度比在胃的吸收速度快。吸收速率常数：胃 0.0049 ± 0.0015 min⁻¹，十二指肠 0.0905 ± 0.0108 min⁻¹。鞣花酸不影响吸收速率。[2]
代谢（α-碳羟基化）：在离体胃和十二指肠中，主要代谢产物为酮醇和酮酸。45 分钟后，十二指肠中的 α-碳羟基化水平（84.6 ± 13.1 pmol）高于胃（29.7 ± 3.1 pmol），120 分钟后也观察到此现象。鞣花酸可降低胃中的 α-碳羟基化水平，但对十二指肠中的 α-碳羟基化水平无影响。[2]
代谢（吡啶 N-氧化）：该途径在胃中的活性高于十二指肠。 [2]
代谢（羰基还原）：十二指肠中NNK还原为NNAL的速率是胃的10倍。[2]
肝微粒体与肺微粒体代谢：肝微粒体的总α-碳羟基化（pmol/min/mg蛋白）高于肺微粒体。校正细胞色素P-450含量后，每nmol P-450的α-碳羟基化在肺中高于肝。吡啶N-氧化在肺微粒体中比在肝微粒体中强5倍。含黄素单加氧酶的活性在肺微粒体中高于肝微粒体。[2]

毒性概述
暴露途径：烟草特异性N-亚硝胺，包括4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮 (NNK)、N'-亚硝基降烟酸 (NNN)、N'-亚硝基阿纳巴辛 (NAB) 和 N'-亚硝基阿纳他宾 (NAT)，广泛存在于烟草和烟草烟雾中。它们由尼古丁和其他烟草生物碱的亚硝化作用形成，已在普通烟草 (Nicotiana tabacum) 和锈烟草 (N. rustica) 的绿叶中检测到；然而，烟草特异性N-亚硝胺的主要形成发生在烟草的烘烤和加工过程中，吸烟过程中也会产生少量。所有市售和非市售的烟草制品，包括卷烟、雪茄、米曲、烟斗烟丝和无烟烟草制品，都含有烟草特异性N-亚硝胺。 N-亚硝胺广泛存在于各种食品和非食品中，但所有烟草制品中烟草特有的N-亚硝胺含量比其他商业产品高几个数量级。无烟烟草制品中烟草特有的N-亚硝胺含量最高。……接触烟草特有的N-亚硝胺的程度不仅取决于烟草制品或烟雾中这些化合物的含量，还取决于产品的使用方法。对人类的影响：尚无相关数据。对动物的影响：在多项小鼠研究中，无论给药途径如何，NNK均可诱发肺腺瘤。在皮下注射研究中，大鼠诱发了肺、鼻腔和肝脏的良性和恶性肿瘤。在四项仓鼠研究中的两项中，雄性和雌性仓鼠均诱发了肺腺瘤、腺癌或腺鳞癌。在另外两项研究中也观察到了腺瘤。一项针对水貂的有限研究观察到了累及前脑的鼻腔肿瘤。在一项通过饮用水给药和另一项通过口腔拭子给药的研究中，雄性大鼠诱发了良性和恶性肺肿瘤（腺瘤、腺鳞癌和癌）。在饮用水给药的研究中，NNK诱发了良性和恶性胰腺肿瘤。在口腔拭子给药的研究中，观察到了肝脏和鼻腔的良性和恶性肿瘤。当将NNK灌注到雌性大鼠的膀胱中时，肝脏和肺部肿瘤的发生率显著增加。在两项研究中，通过腹腔注射将NNK给予小鼠后代。两项研究均在雄性后代中观察到了肝脏肿瘤，其中一项研究还在雌性后代中观察到了肝脏肿瘤。在一项研究中，雄性后代中也观察到了肺部肿瘤。在对妊娠期接受NNK治疗的仓鼠后代的研究中，母鼠气管内滴注NNK导致雄性后代发生鼻腺癌，其中一项研究还发现雄性和雌性后代均出现肾上腺嗜铬细胞瘤。另一项研究中，雌性小鼠皮下注射NNK诱发雄性和雌性后代呼吸道（鼻腔、喉和气管）肿瘤。第三项研究中，雌性小鼠皮下注射或气管内滴注NNK导致雄性和雌性后代均出现鼻腔和肾上腺肿瘤。腹腔注射NNK-N-氧化物可诱发雌性小鼠肺腺瘤。一项口腔拭子研究表明，NNK和NNN联合使用会增加大鼠口腔肿瘤的发生率。相互作用……雄性ICR小鼠连续10天每日灌胃给予NNK（0.5 mg/只）和亚砷酸钠（0、10或20 mg/kg），并在第10天收集尿液进行NNK代谢物分析。同时收集肝脏样本进行CYP2A酶活性和DNA加合物评估。砷处理组小鼠肝脏中cyp2a4/5 mRNA水平和CYP2A酶活性显著升高。此外，与单独使用NNK处理的小鼠相比，NNK联合砷处理的小鼠尿液中NNK代谢物水平升高。同时，NNK联合砷处理的小鼠肝脏中DNA加合物（N(7)-甲基鸟嘌呤和O(6)-甲基鸟嘌呤）含量显著升高。我们的研究结果清楚地表明，砷通过上调CYP2A的表达和活性来增加NNK的代谢，从而导致NNK代谢增加以及DNA加合物（N(7)-甲基鸟嘌呤和O(6)-甲基鸟嘌呤）的生成。这些发现提示，在砷存在的情况下，NNK可能诱导肝组织中形成更多的DNA加合物，从而导致更高的致癌潜力。NNK/小鼠肺模型已被众多研究人员广泛用于鉴定能够调控小鼠肺肿瘤形成的因素、条件、药物或化学预防化合物。以下概述了其中一项研究。该研究旨在确定香烟烟雾诱导肺肿瘤的能力以及促进NNK诱导的肺肿瘤发展的能力。 20只7周龄雌性A/J小鼠被随机分为四组，分别暴露于过滤空气（FA）、香烟烟雾（CS；稀释后的主流烟雾，目标总颗粒物浓度为250 mg/m³，取自IR3研究中使用的香烟）、NNK或NNK+CS，持续26周，每周5天。在完全暴露前，小鼠先暴露于目标浓度50%的CS 3天，随后暴露于目标浓度75%的CS 4天。在CS暴露前3天，小鼠腹腔注射100 mg/kg体重的NNK（溶于0.1 mL生理盐水）。暴露结束后5周处死小鼠。通过目测计数肿瘤总数，并在显微镜下进行表征。进行Kaplan-Meier生存分析，并使用Breslow统计量分析生存差异。采用 Bonferroni 校正的 Student's t 检验来检验各组间肺重量、所有动物肿瘤数量以及荷瘤动物肿瘤数量的差异，显著性水平设定为 p < 0.05。四组肺肿瘤发生率如下：FA 组，5/19 (26%)；CS 组，0/19 (0%)；FA + NNK 组，19/20 (95%)；CS + NNK 组，13/16 (81%)。各组肺肿瘤数量（每只动物的肿瘤总数）如下：FA 组，每只动物 0.32 ± 0.58 个肿瘤；FA + NNK 组，每只动物 2.50 ± 1.67 个肿瘤；CS + NNK 组，每只动物 2.50 ± 1.97 个肿瘤。荷瘤动物肺部肿瘤数量如下：FA组，每只动物1.20 ± 0.44个肿瘤；FA + NNK组，每只动物2.63 ± 1.61个肿瘤；CS + NNK组，每只动物3.08 ± 1.71个肿瘤。CS暴露降低了动物的体重和肺重，但NNK治疗没有额外影响。在所有动物中，FA+NNK组和CS+NNK组的肿瘤数量均高于FA组和CS组（p<0.05），但在荷瘤动物中，FA组、FA+NNK组和CS+NNK组之间的肿瘤数量无显著差异。

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非人类毒性值
小鼠腹腔注射LD50 1 g/kg

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NNK在两种剂量水平（9.2和3.1 mg/只小鼠）下均表现出轻微毒性，与未处理的对照组相比，抑制了A/J小鼠的正常体重增长。停止NNK治疗后，小鼠体重有所增加，但始终未达到未处理小鼠的水平。处死时，未处理小鼠的平均体重显著高于NNK处理组（第2、4、7、8组）。[2]

[1]. Tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone promotes functional cooperation of Bcl2 and c-Myc through phosphorylation in regulating cell survival and proliferation. J Biol Chem. 2004;279(38):40209-40219.

[2]. Lung tumorigenicity of NNK given orally to A/J mice: its application to chemopreventive efficacy studies. Exp Lung Res. 1991;17(2):485-499.

根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）的报告，4-(N-亚硝基甲基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮具有潜在致癌性。4-(N-亚硝基-N-甲基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（nnk）是一种淡黄色结晶固体。(NTP, 1992) 4-(N-亚硝基甲基氨基)-1-(3-吡啶基)丁酮是一种亚硝胺，属于吡啶类化合物。已有报道称烟草（Nicotiana tabacum）中存在4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，并且已有相关数据。 4-甲基亚硝基氨基-1,3-吡啶基-1-丁酮是一种淡黄色结晶固体亚硝胺，天然存在于烟草制品中，是烟草生产和消费过程中尼古丁氧化和亚硝化的产物。4-甲基亚硝基氨基-1,3-吡啶基-1-丁酮目前仅用作诱导肿瘤发生的科研化学品。该物质被认为对人类具有潜在致癌性。(NCI05)
另见：烟草（部分）。

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作用机制
NNK和4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)代谢活化为DNA加合物是其致癌活性的关键。该代谢活化过程已在实验动物中得到广泛证实。细胞色素P450酶是该过程的主要催化剂，其中2A家族的酶在人类和实验动物中似乎效率最高。NNK是一种基因毒性化合物。体外实验表明，它对细菌、啮齿动物成纤维细胞和人类淋巴母细胞具有致突变性。它对多种哺乳动物细胞具有细胞遗传学效应，并能诱导仓鼠胰管细胞转化。体内实验表明，NNK可诱导小鼠骨髓微核形成，并导致大鼠和仓鼠肝细胞DNA链断裂。一项研究报道，NNAL对沙门氏菌具有致突变性。除了通过DNA加合物形成这一经典的致癌机制外，NNK还可以与尼古丁受体和其他受体结合，从而导致下游效应，最终促进癌症的发生发展。这些效应已在包括人类和实验动物的胰腺和肺细胞在内的实验系统中观察到。 4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮和N'-亚硝基烟酰胺是无烟烟草中最丰富且最有效的致癌物；在无烟烟草使用者体内已观察到这些物质的吸收和代谢活化。在大鼠中，4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮和N'-亚硝基烟酰胺的联合使用可诱发口腔肿瘤，这与无烟烟草的致瘤作用一致。一种致癌机制是细胞色素P450介导的α-羟基化，该过程会导致形成在烟草使用者体内常见的DNA和血红蛋白加合物。结构-活性研究表明，DNA甲基化和吡啶基丁基化在NNK诱导的大鼠肺肿瘤发生过程中均起着关键作用。持续存在的 O6-MeGua 是 A/J 小鼠肺肿瘤发生的关键决定因素，但它并不能解释 A/J 小鼠和 C57BL/6 小鼠对 NNK 诱导的肺肿瘤发生敏感性的差异。在 A/J 小鼠中，治疗 96 小时后测得的 O6-甲基鸟嘌呤 (O6-MedGuo) 水平与肿瘤数量密切相关，且与甲基化剂（例如 NNK）的来源无关。此外，在 A/J 小鼠中，NNK 诱导的肺肿瘤中 K-ras 基因第 12 位密码子处发生高比例的 GC 到 AT 的转换，这与 O6-MeGuo 的重要性相符。吡啶氧丁基加合物抑制 O6-烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶 (AGT)，该酶负责修复 O6-MedGuo。由于 O6-MedGuo 也是 NNK 代谢活化的产物，因此这种现象可能对 NNK 暴露组织中 O6-MedGuo 的持续存在具有重要意义。有关 4-(N-亚硝基甲基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（共 13 种化合物）作用机制的更完整数据，请访问 HSDB 记录页面。

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NNK 由尼古丁亚硝化形成，是香烟烟雾中最有效的致癌物，对吸烟相关的肺癌有显著影响。[1]
NNK 作为一种位点选择性高亲和力激动剂与 α7 尼古丁乙酰胆碱受体 (α7 nAChR) 结合，导致 Ca²⁺ 内流并激活 PKC/Raf/MEK/ERK1/2 蛋白激酶级联反应。 [1]
NNK诱导的Bcl2 Ser70位点磷酸化促进Bcl2与c-Myc在细胞核和线粒体外膜上的直接相互作用，延长c-Myc蛋白的半衰期并增加c-Myc的活性，从而促进肺癌的发生发展和肿瘤细胞的生长。[1]
在A/J小鼠中，口服NNK以剂量依赖的方式诱导肺腺瘤：9.2 mg/只小鼠可产生15.7 ± 2.7个肿瘤；3.1 mg/只小鼠可产生1.2 ± 0.3个肿瘤。化学预防剂：鞣花酸（4 g/kg饲料）可抑制肿瘤数量52%；2(3)-BHA（5 g/kg饲料）可将发病率从100%降低至68%，并将肿瘤数量降低88%。舒林酸（0.13 g/kg 饲料）可使繁殖力降低 52%；β-胡萝卜素+视黄醇和亚硒酸钠无效。[2]

C10H13N3O2

207.23

207.1

64091-91-4

NNK-d4;764661-24-7;NNK-d3;86270-92-0

47289

White to light yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

423.9±25.0 °C at 760 mmHg

63-65ºC

210.2±23.2 °C

0.0±1.0 mmHg at 25°C

1.557

0.09

62.63

0

5

5

15

221

0

FLAQQSHRLBFIEZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C10H13N3O2/c1-13(12-15)7-3-5-10(14)9-4-2-6-11-8-9/h2,4,6,8H,3,5,7H2,1H3

4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone

Nicotine-derived nitrosamine ketoneNNK

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 62.5 mg/mL (~301.60 mM)

配方 1 中的溶解度: 3.33 mg/mL (16.07 mM) in 1% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。 (<50°C).
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。