DNA-PK (IC50 = 0.23 μM); PI3K (IC50 = 13 μM)
DNA-dependent protein kinase (DNA-PK): NU7026 potently and selectively inhibits DNA-PK with an IC50 of 0.23 μM (using purified human DNA-PK and a p53-derived peptide substrate); it shows minimal inhibition of other DNA repair kinases, including ATM (IC50 > 100 μM) and ATR (IC50 > 100 μM) [1]
- DNA-dependent protein kinase (DNA-PK): NU7026 inhibits DNA-PK-mediated DNA double-strand break (DSB) repair in malignant B lymphocytes (Raji, Daudi cells) with an EC50 of ~1 μM (assessed by neutral comet assay for DSB accumulation); no Ki values reported [2]

NU7026 (10 μM) 在呈指数增长的 DNA-PK 熟练但不缺乏的细胞中增强电离辐射 (IR) 细胞毒性 [90% 细胞杀灭时的增强因子 (PF90)=1.51±0.04][1]。 NU7026 协同使 I83 细胞对苯丁酸氮芥 (CLB) 敏感达 3.5 倍[2]。 NU7026，一种全新的DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）抑制剂。对 CH1 人卵巢癌细胞的显着放射增敏作用需要至少 NU7026 暴露 4 小时以及 10 M 剂量的 3 Gy 辐射，这对细胞本身无毒[3]。体外溶液：NU7026溶解。使用 NU7026 处理细胞，最终 DMSO (v/v) 浓度为 0.25% DMSO (v/v)[4]。

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肺癌细胞放射增敏作用：A549和H460非小细胞肺癌细胞在照射（0-8 Gy）前1小时用NU7026（0.5-2 μM）处理。克隆形成实验显示放射敏感性呈剂量依赖性增加：2 μM NU7026处理时，A549细胞的增敏比（SER）为1.4，H460细胞为1.3。γ-H2AX（DSB标志物）免疫荧光染色表明，NU7026（2 μM）延长DSB滞留时间：照射后48小时，处理组细胞的γ-H2AX焦点数是溶媒对照组的约3倍，证实DSB修复被抑制[1]
- 与苯丁酸氮芥（Chlorambucil）在B淋巴细胞中的协同细胞毒性：Raji（伯基特淋巴瘤）和Daudi（伯基特淋巴瘤）细胞用NU7026（0.1-5 μM）联合苯丁酸氮芥（0.1-10 μM）处理。MTT活力实验显示协同细胞毒性（联合指数CI<0.8）：1 μM NU7026+2 μM苯丁酸氮芥处理时，Raji细胞活力下降约60%（单独苯丁酸氮芥处理仅下降20%），Daudi细胞活力下降约55%（单独苯丁酸氮芥处理仅下降18%）。中性彗星实验证实，NU7026（1 μM）使苯丁酸氮芥诱导的DSB增加约2.5倍[2]
- 激酶面板特异性：NU7026（10 μM）对28种其他激酶（如CDK1、CDK2、EGFR、PI3Kγ）的抑制率<10%，证实其对DNA-PK的选择性[1]

NU7026是一种新型DNA-PK（DNA修复酶DNA依赖性蛋白激酶）抑制剂。以 5 mg/kg 的剂量静脉注射给小鼠后，NU7026 经历了快速的血浆清除（0.108 L/h），这在很大程度上归因于广泛的代谢。通过 ip 或 po 给药 20 mg/kg 后，生物利用度分别为 20% 和 15%[3]。

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裸鼠A549移植瘤放射增敏模型：6-8周龄雌性裸鼠皮下接种A549细胞，待肿瘤体积达~100 mm³后随机分为4组：（1）溶媒（5% DMSO/PBS，腹腔注射，每日1次）；（2）NU7026单药（25 mg/kg，腹腔注射，每日1次）；（3）单独照射（8 Gy，单剂量，肿瘤局部铅屏蔽保护）；（4）NU7026+照射（照射前1小时腹腔注射25 mg/kg NU7026，之后每日1次，共5天）。每周两次测量肿瘤体积：处理后21天，NU7026+照射组的肿瘤生长延迟（TGD）为12天，单独照射组为4天，NU7026单药组为2天。各组均无明显体重下降或死亡[3]
- 裸鼠Raji移植瘤化疗增敏模型：雄性裸鼠皮下接种Raji细胞，待肿瘤体积达~100 mm³后处理：（1）溶媒（腹腔注射，每日1次）；（2）NU7026单药（25 mg/kg，腹腔注射，每日1次，共14天）；（3）苯丁酸氮芥单药（10 mg/kg，腹腔注射，每周1次，共2周）；（4）联合组（NU7026每日25 mg/kg + 苯丁酸氮芥每周10 mg/kg）。处理28天后，联合组肿瘤退缩率约40%，单药组均<5%。Ki-67（增殖标志物）染色显示联合组阳性细胞率下降约60%[2]

使用 Q-Sepharose、S-Sepharose 和肝素琼脂糖进行层析后，从 HeLa 细胞核提取物中分离出哺乳动物 DNA-PK (500 ng/μL)。在聚丙烯 96 孔板中，在含有 25 mM HEPES (pH 7.4)、12.5 mM MgCl2、50 mM KCl、1 mM DTT、10% v/v 甘油、0.1% 的缓冲液中评估 DNA-PK (250 ng) 活性w/v NP-40 和 1 mg 底物 GST-p53N66，30°C，最终体积为 40 μL。将不同浓度的 NU7026 添加到测定混合物中（在 DMSO 中，最终浓度为 1% v/v）。孵育 10 分钟后，添加 30 聚体双链 DNA 寡核苷酸（终浓度为 0.5 ng/mL）和 ATP，使终浓度为 50 μM，以开始反应。振荡 1 小时后，向反应液中加入 150 L PBS，然后将 5 µL 转移至每孔含有 45 µl PBS 的 96 孔不透明白色板中。然后给予 GSTp53N66 底物 1 小时以与孔结合。由图形包 Prism 生成的 S 形图绘制了一系列化合物浓度中酶活性与化合物浓度的关系图，用于计算每次酶测定中每种化合物的 IC50。

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纯化DNA-PK活性检测：将重组人DNA-PK（催化亚基+Ku70/Ku80异二聚体）与生物素化p53肽底物（1-39位氨基酸）及系列浓度的NU7026（0.01-10 μM）在反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、200 μM ATP）中孵育。加入[γ-³²P]ATP（10 μCi/反应）启动反应，30°C孵育30分钟。链霉亲和素包被滤膜捕获磷酸化肽，洗涤后通过液体闪烁计数检测放射性。根据剂量-反应曲线（抑制率vs.NU7026浓度）计算IC50[1]
- ATM/ATR活性检测（选择性验证）：纯化ATM或ATR与各自底物（ATM：p53肽；ATR：Chk1肽）及NU7026（0.1-100 μM）在上述相同缓冲液和放射性ATP体系中孵育。检测放射性以计算抑制效率：NU7026在100 μM浓度下对两种激酶的抑制率均<5%[1]

将 I83 细胞接种于含有 10% FBS (1.5×105 cells/mL) 的 RPMI 1640 培养基中，并用媒介物 (DMSO)、5 μM CLB、CLB IC50、10 μM NU7026 或两种药物的组合处理 0、6、 24 和 48 小时。测定细胞周期分布、细胞凋亡、DNA-PK磷酸化和γH2AX测定，并将它们表示为细胞周期各阶段的百分比。 DNA 含量使用配备 CellQuest 软件的 FACSCalibur 流式细胞仪进行分析[2]。

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A549/H460克隆形成实验：细胞接种于6孔板（200-1000个细胞/孔），贴壁过夜后，用NU7026（0.5、1、2 μM）或溶媒（DMSO，终浓度0.1%）处理1小时，再进行照射（0、2、4、6、8 Gy）。照射后更换无药培养基，培养10-14天。甲醇固定菌落，结晶紫染色后计数（>50个细胞为一个菌落）。存活分数=（形成菌落数/接种细胞数×贴壁效率），通过线性二次模型拟合计算SER[1]
- Raji/Daudi MTT活力实验：细胞接种于96孔板（5×10³个细胞/孔，含10% FBS的RPMI 1640培养基），同时加入NU7026（0.1-5 μM）和苯丁酸氮芥（0.1-10 μM），37°C（5% CO₂）孵育72小时。每孔加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL），4小时后加入100 μL DMSO溶解甲臜。检测570 nm吸光度，活力（%）=（处理组吸光度/对照组吸光度）×100%。采用Chou-Talalay法判断协同效应（CI<1为协同）[2]
- γ-H2AX免疫荧光实验：A549细胞接种于盖玻片，用NU7026（2 μM）+4 Gy照射处理，在照射后0、6、24、48小时固定细胞。0.2% Triton X-100透化，5% BSA封闭，抗γ-H2AX抗体4°C孵育过夜，再加入Alexa Fluor标记二抗。DAPI染核后，荧光显微镜计数每细胞焦点数（每组100个细胞）[1]

Mice[3]
The BALB/c mice used are female. For i.p. and peroral (p.o.) administration, NU7026 is formulated in 10% DMSO and 5% Tween 20 in saline at 20 and 50 mg/kg, respectively. NU7026 is formulated in 10% ethanol, 25% PEG 200, and 5% Tween 20 in saline for i.v. dosing at 5 mg/kg. The vehicle is given to the control animals alone. Per time point, injections are given to groups of three mice. Following halothane's transient anesthesia, blood is taken by cardiac puncture at time points of 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, and 24 hours after administration. Samples are kept at 20°C until analysis after being centrifuged at 1500 g for 2 min to obtain plasma. NU7026 is injected at a rate of 5 mg/kg for studies on urinary excretion. In metabolic cages, urine is collected over a 24-hour period and kept in storage until needed at 20°C.

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A549 xenograft radiosensitization study: Female nude mice (n=6/group) were injected subcutaneously with 5×10⁶ A549 cells in Matrigel. When tumors reached ~100 mm³, treatments began: (1) Vehicle: 5% DMSO in PBS, ip, once daily for 5 days; (2) NU7026: 25 mg/kg (dissolved in 5% DMSO/PBS), ip, once daily for 5 days; (3) Irradiation: 8 Gy, single dose (tumor-localized using lead shielding); (4) NU7026 + irradiation: 25 mg/kg NU7026 ip 1 hour before irradiation, then once daily for 4 more days. Tumor volume was measured with calipers (volume = length × width² / 2) twice weekly; mice were weighed weekly to monitor toxicity [3]
- Raji xenograft chemo-sensitization study: Male nude mice (n=6/group) were injected subcutaneously with 1×10⁷ Raji cells. When tumors reached ~100 mm³: (1) Vehicle: 5% DMSO/PBS, ip, once daily; (2) NU7026: 25 mg/kg, ip, once daily for 14 days; (3) Chlorambucil: 10 mg/kg, ip, once weekly for 2 weeks; (4) Combination: NU7026 (25 mg/kg daily) + chlorambucil (10 mg/kg weekly). Tumor volume and body weight were measured twice weekly; tumors were excised at study end for Ki-67 staining [2]
- Rat pharmacokinetic study: Male Wistar rats (n=3/time point) received NU7026 via two routes: (1) Intravenous (iv) bolus: 10 mg/kg (dissolved in 5% DMSO/PBS); (2) Oral gavage: 50 mg/kg (suspended in 0.5% methylcellulose). Blood samples (0.2 mL) were collected from the tail vein at 0, 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 hours post-dose. Plasma was separated by centrifugation, and NU7026 concentrations were measured by HPLC-MS/MS. Pharmacokinetic parameters were calculated using non-compartmental analysis [3]

吸收：大鼠口服NU7026的生物利用度约为10%（基于口服50 mg/kg与静脉注射10 mg/kg后的AUC₀₋∞比较）。口服给药后血浆峰浓度（Cmax）为0.8 μM（1小时），静脉给药后为6.2 μM（0.083小时）[3]
- 分布：大鼠静脉注射NU7026后分布容积（Vd）约为1.5 L/kg，表明其组织渗透性中等。在A549异种移植瘤中，肿瘤与血浆浓度比约为0.7（腹腔注射25 mg/kg后1小时测得）[3]
- 代谢：NU7026主要在大鼠肝微粒体中通过N-去甲基化（生成M1代谢物）和羟基化（生成M2代谢物）代谢。静脉注射后2小时，M1和M2分别占血浆代谢物的约60%和约25%；两种代谢物均无DNA-PK抑制活性[3]
- 排泄：在大鼠中，静脉注射的NU7026（放射性标记）约45%在72小时内经粪便排泄，约30%经尿液排泄；未代谢药物占总排泄量的<10%，表明其在消除前经过广泛的代谢[3]
- 半衰期：在大鼠中，NU7026的消除半衰期(t₁/₂)在静脉给药后约为1.5小时，口服给药后约为2.1小时[3]

急性毒性：在小鼠中，单次腹腔注射高达 200 mg/kg 的 NU7026，7 天内未观察到死亡或明显的毒性反应（例如嗜睡、体重减轻 >5%）[3]
- 亚急性毒性：与溶剂对照组相比，接受 NU7026 治疗（25 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续 14 天）的小鼠，其体重、肝功能（ALT、AST）或肾功能（BUN、肌酐）均未发生显著变化。肝脏、肾脏、脾脏和肿瘤组织的组织病理学分析显示，未观察到药物引起的损伤[3]
- 血浆蛋白结合率：NU7026 在大鼠和人血浆中的血浆蛋白结合率约为 90%（通过平衡透析法测定，浓度为 1–10 μM）[3]

[1]. Radiosensitization and DNA repair inhibition by the combined use of novel inhibitors of DNA-dependent protein kinase and poly(ADP-ribose) polymerase-1. Cancer Res. 2003 Sep 15;63(18):6008-15.

[2]. Chlorambucil cytotoxicity in malignant B lymphocytes is synergistically increased by 2-(morpholin-4-yl)-benzo[h]chomen-4-one (NU7026)-mediated inhibition of DNA double-strand break repair via inhibition of DNA-dependent protein kinase. J

[3]. Preclinical pharmacokinetics and metabolism of a novel prototype DNA-PK inhibitor NU7026. Br J Cancer. 2005 Oct 31;93(9):1011-8.

[4]. Interleukin-4 enhances PARP-dependent DNA repair activity in vitro. J Interferon Cytokine Res. 2014 Sep;34(9):734-40.

2-(4-吗啉基)-4-苯并[h][1]苯并吡喃酮是一种含氧有机化合物和有机杂三环化合物。

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氯苯丁酸氮芥 (CLB) 用于治疗慢性淋巴细胞白血病 (CLL)，但 CLB 耐药性的产生与 CLB 诱导的 DNA 损伤修复加速有关。磷酸化组蛋白 H2AX (γH2AX) 位于 DNA 双链断裂 (DSB) 位点；此外，它还能募集并保留损伤反应蛋白。这种损伤可通过非同源 DNA 末端连接 (NHEJ) 和/或同源重组修复 (HR) 途径进行修复。NHEJ 的关键组成部分是 DNA 依赖性蛋白激酶 (DNA-PK) 复合物。DNA-PK 活性的增加与 CLL 中的 CLB 耐药性相关。我们使用特异性DNA-PK抑制剂2-(吗啉-4-基)-苯并[h]色烯-4-酮 (NU7026) 来增强慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞对苯丁酸氮芥的敏感性。结果表明，在CLL细胞系(I83)和原代CLL淋巴细胞中，苯丁酸氮芥联合NU7026在无毒剂量下具有协同细胞毒活性。苯丁酸氮芥(CLB)处理可导致G2/M期阻滞，而NU7026可增强CLB诱导的G2/M期阻滞。此外，动力学时间进程表明，NU7026抑制了CLB诱导的DNA-PK活性，这直接证明了NU7026抑制DNA-PK功能的能力。 DSB（以γH2AX形式可视化）在CLB处理后24至48小时增强，CLB联合NU7026进一步增强了DSB，表明该联合用药的协同作用是由NU7026抑制DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）进而抑制DSB修复介导的。[2]

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本研究探讨了新型DNA修复酶DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）抑制剂NU7026的体外放射增敏作用、药代动力学和代谢的时间依赖性。在10 μM的剂量下（该剂量本身对细胞无毒性），在CH1人卵巢癌细胞中，至少需要4小时的NU7026暴露联合3 Gy辐射才能产生显著的放射增敏作用。小鼠静脉注射5 mg/kg NU7026后，血浆清除率迅速（0.108 lh⁻¹），这主要归因于其广泛的代谢。腹腔注射（ip）和口服（po）20 mg kg⁻¹ 给药后的生物利用度分别为 20% 和 15%。对血浆和尿液中 NU7026 代谢谱的研究表明，该化合物发生多次羟基化反应。双羟基化代谢物的葡萄糖醛酸苷结合物是尿液中的主要排泄产物。通过以下事实证实了主要氧化位点为吗啉环的 C-2 位：NU7107（NU7026 的类似物，吗啉环的 C-2 和 C-6 位均被甲基化）的血浆清除率比 NU7026 慢四倍。进行的药代动力学模拟预测，为了获得放射增敏所需的药物暴露量，NU7026 必须每天以 100 mg kg(-1) ip 给药 4 次。[3]

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NU7026 是第一个合成的、选择性的 DNA-PK 抑制剂，靶向 DNA DSB 修复的非同源末端连接 (NHEJ) 途径。其作用机制涉及阻断 DNA-PK 介导的 Ku 蛋白和 Artemis 的磷酸化，而 Ku 蛋白和 Artemis 对非同源末端连接 (NHEJ) 至关重要 [1]
- NU7026 的放射增敏作用归因于 DSB 的长期滞留：受照射的细胞无法有效修复 DSB，导致细胞凋亡增加和克隆形成存活率降低 [1]
- 与苯丁酸氮芥（一种烷化剂）产生协同作用，是因为苯丁酸氮芥诱导 DSB，而 NU7026 抑制其修复，从而增强了对 DNA 修复能力正常的恶性 B 细胞的细胞毒性 [2]
- NU7026 的口服生物利用度低（由于吸收不良和首过代谢），限制了其临床应用；体内疗效需要静脉或腹腔注射 [3]

C17H15NO3

281.3059

281.105

C, 72.58; H, 5.37; N, 4.98; O, 17.06

154447-35-5

503465-21-2 (NU-7107); 79105-88-7 (NU-7031); 842122-14-9 (NU-7200); 69541-04-4 (NU-7199)

9860529

Yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

459.9±45.0 °C at 760 mmHg

231.9±28.7 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.673

3.29

42.68

0

4

1

21

441

0

O=C1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2OC(N4CCOCC4)=C1

KKTZALUTXUZPSN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H15NO3/c19-15-11-16(18-7-9-20-10-8-18)21-17-13-4-2-1-3-12(13)5-6-14(15)17/h1-6,11H,7-10H2

2-morpholino-4H-benzo[h]chromen-4-one

DNA-PK Inhibitor II; LY-293646; DNA-PK Inhibitor II; 2-(Morpholin-4-yl)-benzo[h]chromen-4-one; NU-7026; 2-morpholino-4H-benzo[h]chromen-4-one; 2-morpholin-4-ylbenzo[h]chromen-4-one; LY 293646; LY293646; NU7026; NU-7026; NU 7026

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~1 mg/mL (~3.5 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL