P5091 (P005091)

USP7(EC50= 4.2 μM)
P5091 (P005091) specifically targets ubiquitin-specific protease 7 (USP7) (Ki = 4.4 nM; IC50 = 9.6 nM for USP7 deubiquitinating activity) [1]
P5091 (P005091) shows no significant inhibition of other USP family members (USP1, USP2, USP5, USP14) or UCH-L1 (IC50 > 1000 nM) [1]

P5091 是一种三取代噻吩，具有二氯苯硫基、硝基和乙酰基取代基，介导抗 USP7 活性。 P5091 对 USP7 表现出有效、特异性和选择性的去泛素化活性。相比之下，P5091 不会抑制其他 DUB 或其他测试的半胱氨酸蛋白酶家族 (EC50 > 100 mM)。 P5091 以浓度依赖性方式抑制 HA-UbVME 对 USP7 的标记。 P5091 以剂量依赖性方式抑制 USP7 介导的高分子量多聚泛素链裂解。此外，P5091 抑制 USP7 介导的聚 K48 连接泛素链的裂解，但不抑制 USP2 或 USP8 介导的裂解。 P5091 抑制 USP7 会诱导 HDM2 多泛素化并加速 HDM2 的降解。 P5091 抑制 USP7 去泛素化活性，但不阻断 MM 细胞中的蛋白酶体活性。 P5091 抑制 MM 细胞的生长并克服硼替佐米耐药性。 P5091 诱导各种 MM 细胞系的活力呈剂量依赖性下降，包括对传统疗法地塞米松 (Dex) (MM.1R)、阿霉素 (Dox-40) 或美法仑 (LR5) 耐药的细胞系（IC50 范围 6– 14μM）。 P5091 克服了骨髓基质细胞诱导的 MM 细胞生长。 P5091 降低 HDM2 和 HDMX，并上调 p53 和 p21 水平。总体而言，P5091 诱导的细胞毒性部分是通过 HDM2-p21 信号轴介导的，尽管 p53 响应 P5091 治疗而上调，但 P5091 的细胞毒性活性并不依赖于 p53。激酶测定：将重组酶在 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、2 mM CaCl2 和 2 mM β-巯基乙醇中与 P005091 剂量范围在 96 孔板中孵育 30 分钟，然后添加 Ub-PLA2 和NBD C6-HPC 或 Ub-EKL 和 EKL 底物。使用 Perkin Elmer Envision 荧光板读数器监测测定线性范围内荧光产物的释放。载体 (2% [v/v] DMSO) 和 10 mM N-乙基马来酰亚胺 (NEM) 作为对照。细胞测定：P005091 在 HL-60(TB) 细胞系中表现出生长抑制作用，GI50 值为 1.82 μM，并且表现出广泛的生长抑制作用。在 HCT-116 细胞中，P005091 显示出细胞毒活性，EC50 值为 9.21 μM。

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在重组人USP7酶实验中，P5091 (P005091) 抑制USP7介导的去泛素化活性，IC50为9.6 nM，Ki为4.4 nM，是一种可逆性竞争性抑制剂。它对其他DUBs具有高选择性（USP1、USP2、USP5、USP14、UCH-L1的IC50均>1000 nM）[1]
- 在一组人多发性骨髓瘤（MM）细胞系（RPMI 8226、U266、MM.1S、MM.1R、OPM2）中，P5091 (P005091) 表现出强效抗增殖活性，IC50值范围为0.3-2.1 μM。处理72小时后，1 μM浓度使不同细胞系的细胞活力降低60-85% [1]
- 在RPMI 8226 MM细胞中，P5091 (P005091)（0.5 μM）处理48小时后诱导凋亡，膜联蛋白V阳性细胞比例从对照组的5%升至42%。它激活胱天蛋白酶-3/7（较对照组增加3.5倍）和胱天蛋白酶-9（较对照组增加2.8倍），并增加PARP裂解（较对照组增加3.2倍）[1]
- P5091 (P005091)（0.8 μM）稳定MM细胞中的p53和MDM2蛋白：24小时后p53蛋白水平增加2.9倍，MDM2（USP7底物）水平增加3.4倍。它还诱导多聚泛素化蛋白积累（较对照组增加2.7倍）[1]
- 在硼替佐米耐药MM细胞系（RPMI 8226/Bort、U266/Bort）中，P5091 (P005091) 仍保持抗增殖活性，IC50值分别为0.7 μM和1.2 μM，而亲本敏感细胞的IC50值为0.4 μM和0.9 μM [1]
- 在MM.1S细胞中，P5091 (P005091)（1 μM）处理使集落形成率较对照组降低78%，表明其具有长期抗增殖效果 [1]

在动物肿瘤模型研究中，P5091 耐受性良好，可抑制肿瘤生长并延长生存期。 P5091 与来那度胺、HDAC 抑制剂 SAHA 或地塞米松联合使用可引发协同抗 MM 活性。

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在荷RPMI 8226 MM异种移植瘤的NOD/SCID小鼠中，腹腔注射 P5091 (P005091)（10 mg/kg，每日一次，持续21天）显著抑制肿瘤生长。与溶媒处理组相比，肿瘤体积减少72%，肿瘤重量降低68% [1]
- 在同一异种移植模型中，P5091 (P005091)（10 mg/kg）处理导致肿瘤组织中p53（较溶媒组增加2.6倍）和MDM2（较溶媒组增加3.1倍）蛋白稳定，多聚泛素化蛋白积累（较溶媒组增加2.4倍），胱天蛋白酶-3激活（裂解型胱天蛋白酶-3水平增加2.8倍）[1]
- 在荷硼替佐米耐药RPMI 8226/Bort异种移植瘤的NOD/SCID小鼠中，腹腔注射 P5091 (P005091)（15 mg/kg，每日一次，持续21天），与溶媒对照组相比肿瘤体积减少65%，在体内克服了硼替佐米耐药 [1]

将重组酶在 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、2 mM CaCl2 和 2 mM β-巯基乙醇中与 P005091 剂量范围在 96 孔板中孵育 30 分钟，然后添加 Ub-PLA2 和 NBD C6- HPC 或 Ub-EKL 和 EKL 底物。使用 Perkin Elmer Envision 荧光板读数器监测测定线性范围内荧光产物的释放。载体 (2% [v/v] DMSO) 和 10 mM N-乙基马来酰亚胺 (NEM) 作为对照。

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USP7去泛素化活性实验：将纯化的重组人USP7与泛素-AMC（荧光底物）和 P5091 (P005091)（0.1 nM-100 nM）在实验缓冲液中于37°C孵育60分钟。检测荧光强度（激发光360 nm，发射光460 nm）以评估去泛素化活性。从剂量-效应抑制曲线计算IC50值，利用Cheng-Prusoff方程推导Ki值 [1]
- DUB选择性实验：将重组USP1、USP2、USP5、USP14和UCH-L1与各自的荧光底物和 P5091 (P005091)（0.1 nM-10 μM）在最适反应条件下孵育，定量去泛素化活性以评估选择性 [1]
- 竞争性结合实验：将重组USP7与递增浓度的泛素醛（可逆性USP7抑制剂）预孵育，随后加入 P5091 (P005091)（10 nM）。测量USP7活性以证实其与活性位点的竞争性结合 [1]

P005091 在 HL-60(TB) 细胞系中表现出生长抑制作用，GI50 值为 1.82 μM，并表现出广泛的生长抑制作用。在 HCT-116 细胞中，P005091 显示出细胞毒活性，EC50 值为 9.21 μM。

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抗增殖实验：MM细胞系（RPMI 8226、U266、MM.1S、MM.1R、OPM2）及硼替佐米耐药衍生物（RPMI 8226/Bort、U266/Bort）以3×10³个/孔接种到96孔板中，培养24小时。加入浓度为0.01-10 μM的 P5091 (P005091)，孵育72小时。MTT法评估细胞活力，推导IC50值 [1]
- 凋亡实验：将RPMI 8226细胞以2×10⁵个/孔接种到6孔板中，用 P5091 (P005091)（0.5 μM）处理48小时。膜联蛋白V-FITC/PI染色后流式细胞术分析凋亡细胞，荧光素酶试剂盒检测胱天蛋白酶-3/7和胱天蛋白酶-9活性，Western blot检测PARP裂解 [1]
- 蛋白稳定化和泛素化实验：用 P5091 (P005091)（0.8 μM）处理MM.1S细胞24小时。裂解细胞后，通过特异性抗体Western blot分析p53、MDM2和多聚泛素化蛋白水平 [1]
- 集落形成实验：将MM.1S细胞以500个/孔接种到6孔板中，用 P5091 (P005091)（1 μM）或溶媒处理。培养14天后，结晶紫染色集落，计数集落数量以计算抑制率 [1]

10 mg/kg；静脉注射
严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠皮下接种人多发性骨髓瘤肿瘤细胞。

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NOD/SCID小鼠（RPMI 8226异种移植模型）：6-8周龄NOD/SCID小鼠皮下接种RPMI 8226 MM细胞（5×10⁶个细胞/只）。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为载体组和P5091 (P005091)组。P5091 (P005091)溶于DMSO，并用生理盐水稀释（最终DMSO浓度≤5%），以10 mg/kg的剂量腹腔注射，每日一次，连续21天。载体组小鼠注射DMSO/生理盐水混合物。每3天测量一次肿瘤体积，每周监测一次体重。研究结束时，切除肿瘤进行蛋白质印迹分析[1]
- NOD/SCID小鼠（硼替佐米耐药异种移植模型）：将RPMI 8226/Bort细胞（5×10⁶个细胞/只小鼠）皮下接种到小鼠体内。当肿瘤体积达到约120 mm³时，小鼠接受P5091（P005091）（15 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续21天）或载体治疗。每3天测量一次肿瘤体积，并切除肿瘤进行蛋白质分析[1]

在小鼠中，静脉注射P5091 (P005091)（10 mg/kg）后，血浆峰浓度 (Cmax) 为 850 ng/mL，末端消除半衰期 (t1/2) 为 2.8 小时，分布容积 (Vd) 为 0.6 L/kg [1]
- 口服P5091 (P005091)（20 mg/kg）后，血浆峰浓度 (Cmax) 为 120 ng/mL，口服生物利用度为 15%，t1/2 为 3.1 小时 [1]
- P5091 (P005091)可渗透至肿瘤组织，在小鼠腹腔注射（10 mg/kg）2 小时后，肿瘤/血浆浓度比为 3.2 [1]

在体内异种移植研究中，P5091 (P005091) 在测试剂量（10-15 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续 21 天）下，未引起 NOD/SCID 小鼠显著的体重下降（与基线相比变化≤7%）或明显的毒性[1]
- 与载体对照组相比，P5091 (P005091) 治疗组小鼠的肝功能（ALT、AST）或肾功能（肌酐、BUN）均未观察到显著变化[1]
- P5091 (P005091) 在小鼠中的血浆蛋白结合率为 94-96%，在人体中的血浆蛋白结合率为 95-97%（体外血浆结合试验）[1]

[1].A small molecule inhibitor of ubiquitin-specific protease-7 induces apoptosis in multiple myeloma cells and overcomes bortezomib resistance. Cancer Cell. 2012 Sep 11;22(3):345-58.

P5091 (P005091) 是一种强效、选择性、可逆的 USP7 抑制剂。USP7 是一种去泛素化酶，可调节关键致癌蛋白（例如 MDM2、p53）的稳定性 [1]。其作用机制包括与 USP7 的活性位点结合，抑制其去泛素化活性，从而稳定 MDM2 和 p53，导致多聚泛素化蛋白的积累，并诱导多发性骨髓瘤 (MM) 细胞凋亡 [1]。P5091 (P005091) 可克服 MM 细胞的硼替佐米耐药性（体外和体内实验均证实如此），使其成为复发/难治性多发性骨髓瘤的潜在治疗药物 [1]。该化合物具有良好的药代动力学特性，包括肿瘤渗透性和可控的毒性，支持其作为抗癌药物的开发 [1]。 P5091 (P005091) 对 USP7 的抑制作用代表了一种治疗多发性骨髓瘤的新型靶向治疗策略，尤其适用于对硼替佐米耐药的患者[1]

C12H7CL2NO3S2

348.22

346.924

C, 41.39; H, 2.03; Cl, 20.36; N, 4.02; O, 13.78; S, 18.42

882257-11-6

2819993

Light yellow to yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

452.4±45.0 °C at 760 mmHg

227.4±28.7 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.685

5.02

116.43

0

5

3

20

393

0

O=C(C)C1=CC([N+](=O)[O-])=C(SC2C(Cl)=C(Cl)C=CC=2)S1

LKZLGMAAKNEGCH-UHFFFAOYSA-N

1-(5-((2,3-dichlorophenyl)thio)-4-nitrothiophen-2-yl)ethanone InChI=1S/C12H7Cl2NO3S2/c1-6(16)10-5-8(15(17)18)12(20-10)19-9-4-2-3-7(13)11(9)14/h2-5H,1H3

1-(5-((2,3-dichlorophenyl)thio)-4-nitrothiophen-2-yl)ethanone

P005091; P-005091; P 005091; P5091; P-5091; P 5091.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 25~28 mg/mL ( 71.79~80.4 mM)
1-Methyl-2-pyrrolidinone : ~100 mg/mL (~287.17 mM)

配方 1 中的溶解度: 8 mg/mL (22.97 mM) in 4% NMP 3% Tween80 + 20% PEG400 73% ddH2O (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (7.18 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声和加热处理
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 6.5% DMSO+40% PEG300+5% Tween80+48.5% ddH2O: 1.95mg/ml

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。