P5091 (P005091)

USP7(EC50= 4.2 μM)
P5091 (P005091) specifically targets ubiquitin-specific protease 7 (USP7) (Ki = 4.4 nM; IC50 = 9.6 nM for USP7 deubiquitinating activity) [1]
P5091 (P005091) shows no significant inhibition of other USP family members (USP1, USP2, USP5, USP14) or UCH-L1 (IC50 > 1000 nM) [1]

P5091 是一种三取代噻吩，具有二氯苯硫基、硝基和乙酰基取代基，介导抗 USP7 活性。 P5091 对 USP7 表现出有效、特异性和选择性的去泛素化活性。相比之下，P5091 不会抑制其他 DUB 或其他测试的半胱氨酸蛋白酶家族 (EC50 > 100 mM)。 P5091 以浓度依赖性方式抑制 HA-UbVME 对 USP7 的标记。 P5091 以剂量依赖性方式抑制 USP7 介导的高分子量多聚泛素链裂解。此外，P5091 抑制 USP7 介导的聚 K48 连接泛素链的裂解，但不抑制 USP2 或 USP8 介导的裂解。 P5091 抑制 USP7 会诱导 HDM2 多泛素化并加速 HDM2 的降解。 P5091 抑制 USP7 去泛素化活性，但不阻断 MM 细胞中的蛋白酶体活性。 P5091 抑制 MM 细胞的生长并克服硼替佐米耐药性。 P5091 诱导各种 MM 细胞系的活力呈剂量依赖性下降，包括对传统疗法地塞米松 (Dex) (MM.1R)、阿霉素 (Dox-40) 或美法仑 (LR5) 耐药的细胞系（IC50 范围 6– 14μM）。 P5091 克服了骨髓基质细胞诱导的 MM 细胞生长。 P5091 降低 HDM2 和 HDMX，并上调 p53 和 p21 水平。总体而言，P5091 诱导的细胞毒性部分是通过 HDM2-p21 信号轴介导的，尽管 p53 响应 P5091 治疗而上调，但 P5091 的细胞毒性活性并不依赖于 p53。激酶测定：将重组酶在 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、2 mM CaCl2 和 2 mM β-巯基乙醇中与 P005091 剂量范围在 96 孔板中孵育 30 分钟，然后添加 Ub-PLA2 和NBD C6-HPC 或 Ub-EKL 和 EKL 底物。使用 Perkin Elmer Envision 荧光板读数器监测测定线性范围内荧光产物的释放。载体 (2% [v/v] DMSO) 和 10 mM N-乙基马来酰亚胺 (NEM) 作为对照。细胞测定：P005091 在 HL-60(TB) 细胞系中表现出生长抑制作用，GI50 值为 1.82 μM，并且表现出广泛的生长抑制作用。在 HCT-116 细胞中，P005091 显示出细胞毒活性，EC50 值为 9.21 μM。

---

在重组人USP7酶实验中，P5091 (P005091) 抑制USP7介导的去泛素化活性，IC50为9.6 nM，Ki为4.4 nM，是一种可逆性竞争性抑制剂。它对其他DUBs具有高选择性（USP1、USP2、USP5、USP14、UCH-L1的IC50均>1000 nM）[1]
- 在一组人多发性骨髓瘤（MM）细胞系（RPMI 8226、U266、MM.1S、MM.1R、OPM2）中，P5091 (P005091) 表现出强效抗增殖活性，IC50值范围为0.3-2.1 μM。处理72小时后，1 μM浓度使不同细胞系的细胞活力降低60-85% [1]
- 在RPMI 8226 MM细胞中，P5091 (P005091)（0.5 μM）处理48小时后诱导凋亡，膜联蛋白V阳性细胞比例从对照组的5%升至42%。它激活胱天蛋白酶-3/7（较对照组增加3.5倍）和胱天蛋白酶-9（较对照组增加2.8倍），并增加PARP裂解（较对照组增加3.2倍）[1]
- P5091 (P005091)（0.8 μM）稳定MM细胞中的p53和MDM2蛋白：24小时后p53蛋白水平增加2.9倍，MDM2（USP7底物）水平增加3.4倍。它还诱导多聚泛素化蛋白积累（较对照组增加2.7倍）[1]
- 在硼替佐米耐药MM细胞系（RPMI 8226/Bort、U266/Bort）中，P5091 (P005091) 仍保持抗增殖活性，IC50值分别为0.7 μM和1.2 μM，而亲本敏感细胞的IC50值为0.4 μM和0.9 μM [1]
- 在MM.1S细胞中，P5091 (P005091)（1 μM）处理使集落形成率较对照组降低78%，表明其具有长期抗增殖效果 [1]

在动物肿瘤模型研究中，P5091 耐受性良好，可抑制肿瘤生长并延长生存期。 P5091 与来那度胺、HDAC 抑制剂 SAHA 或地塞米松联合使用可引发协同抗 MM 活性。

---

在荷RPMI 8226 MM异种移植瘤的NOD/SCID小鼠中，腹腔注射 P5091 (P005091)（10 mg/kg，每日一次，持续21天）显著抑制肿瘤生长。与溶媒处理组相比，肿瘤体积减少72%，肿瘤重量降低68% [1]
- 在同一异种移植模型中，P5091 (P005091)（10 mg/kg）处理导致肿瘤组织中p53（较溶媒组增加2.6倍）和MDM2（较溶媒组增加3.1倍）蛋白稳定，多聚泛素化蛋白积累（较溶媒组增加2.4倍），胱天蛋白酶-3激活（裂解型胱天蛋白酶-3水平增加2.8倍）[1]
- 在荷硼替佐米耐药RPMI 8226/Bort异种移植瘤的NOD/SCID小鼠中，腹腔注射 P5091 (P005091)（15 mg/kg，每日一次，持续21天），与溶媒对照组相比肿瘤体积减少65%，在体内克服了硼替佐米耐药 [1]

将重组酶在 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、2 mM CaCl2 和 2 mM β-巯基乙醇中与 P005091 剂量范围在 96 孔板中孵育 30 分钟，然后添加 Ub-PLA2 和 NBD C6- HPC 或 Ub-EKL 和 EKL 底物。使用 Perkin Elmer Envision 荧光板读数器监测测定线性范围内荧光产物的释放。载体 (2% [v/v] DMSO) 和 10 mM N-乙基马来酰亚胺 (NEM) 作为对照。

---

USP7去泛素化活性实验：将纯化的重组人USP7与泛素-AMC（荧光底物）和 P5091 (P005091)（0.1 nM-100 nM）在实验缓冲液中于37°C孵育60分钟。检测荧光强度（激发光360 nm，发射光460 nm）以评估去泛素化活性。从剂量-效应抑制曲线计算IC50值，利用Cheng-Prusoff方程推导Ki值 [1]
- DUB选择性实验：将重组USP1、USP2、USP5、USP14和UCH-L1与各自的荧光底物和 P5091 (P005091)（0.1 nM-10 μM）在最适反应条件下孵育，定量去泛素化活性以评估选择性 [1]
- 竞争性结合实验：将重组USP7与递增浓度的泛素醛（可逆性USP7抑制剂）预孵育，随后加入 P5091 (P005091)（10 nM）。测量USP7活性以证实其与活性位点的竞争性结合 [1]

P005091 在 HL-60(TB) 细胞系中表现出生长抑制作用，GI50 值为 1.82 μM，并表现出广泛的生长抑制作用。在 HCT-116 细胞中，P005091 显示出细胞毒活性，EC50 值为 9.21 μM。

---

抗增殖实验：MM细胞系（RPMI 8226、U266、MM.1S、MM.1R、OPM2）及硼替佐米耐药衍生物（RPMI 8226/Bort、U266/Bort）以3×10³个/孔接种到96孔板中，培养24小时。加入浓度为0.01-10 μM的 P5091 (P005091)，孵育72小时。MTT法评估细胞活力，推导IC50值 [1]
- 凋亡实验：将RPMI 8226细胞以2×10⁵个/孔接种到6孔板中，用 P5091 (P005091)（0.5 μM）处理48小时。膜联蛋白V-FITC/PI染色后流式细胞术分析凋亡细胞，荧光素酶试剂盒检测胱天蛋白酶-3/7和胱天蛋白酶-9活性，Western blot检测PARP裂解 [1]
- 蛋白稳定化和泛素化实验：用 P5091 (P005091)（0.8 μM）处理MM.1S细胞24小时。裂解细胞后，通过特异性抗体Western blot分析p53、MDM2和多聚泛素化蛋白水平 [1]
- 集落形成实验：将MM.1S细胞以500个/孔接种到6孔板中，用 P5091 (P005091)（1 μM）或溶媒处理。培养14天后，结晶紫染色集落，计数集落数量以计算抑制率 [1]

10 mg/kg; injected intravenously
Severe combined immunodeficient (SCID) mice inoculated subcutaneously with human multiple myeloma tumor cells.

---

NOD/SCID mice (RPMI 8226 xenograft model): 6-8 weeks old NOD/SCID mice were subcutaneously inoculated with RPMI 8226 MM cells (5×10⁶ cells/mouse). When tumors reached a volume of ~100 mm³, mice were randomly divided into vehicle and P5091 (P005091) groups. P5091 (P005091) was dissolved in DMSO and diluted with saline (final DMSO concentration ≤5%) and administered intraperitoneally at 10 mg/kg once daily for 21 days. Vehicle-treated mice received DMSO/saline mixture. Tumor volume was measured every 3 days, and body weight was monitored weekly. At the end of the study, tumors were excised for Western blot analysis [1]
- NOD/SCID mice (bortezomib-resistant xenograft model): Mice were subcutaneously inoculated with RPMI 8226/Bort cells (5×10⁶ cells/mouse). When tumors reached ~120 mm³, mice were treated with P5091 (P005091) (15 mg/kg, ip, once daily for 21 days) or vehicle. Tumor volume was measured every 3 days, and tumors were excised for protein analysis [1]

In mice, intravenous administration of P5091 (P005091) (10 mg/kg) resulted in a plasma Cmax of 850 ng/mL, terminal elimination half-life (t1/2) of 2.8 hours, and volume of distribution (Vd) of 0.6 L/kg [1]
- Oral administration of P5091 (P005091) (20 mg/kg) in mice yielded a plasma Cmax of 120 ng/mL, oral bioavailability of 15%, and t1/2 of 3.1 hours [1]
- P5091 (P005091) penetrates into tumor tissues, with a tumor/plasma concentration ratio of 3.2 at 2 hours after intraperitoneal administration (10 mg/kg) in mice [1]

In the in vivo xenograft studies, P5091 (P005091) at tested doses (10-15 mg/kg, ip, once daily for 21 days) did not cause significant body weight loss (≤7% change vs. baseline) or overt toxicity in NOD/SCID mice [1]
- No significant changes in liver function (ALT, AST) or renal function (creatinine, BUN) were observed in P5091 (P005091)-treated mice compared to vehicle controls [1]
- Plasma protein binding rate of P5091 (P005091) is 94-96% in mice and 95-97% in humans (in vitro plasma binding assay) [1]

[1].A small molecule inhibitor of ubiquitin-specific protease-7 induces apoptosis in multiple myeloma cells and overcomes bortezomib resistance. Cancer Cell. 2012 Sep 11;22(3):345-58.

P5091 (P005091) is a potent, selective, reversible inhibitor of USP7, a deubiquitinating enzyme that regulates the stability of key oncogenic proteins (e.g., MDM2, p53) [1]
- Its mechanism of action involves binding to the active site of USP7, inhibiting its deubiquitinating activity, leading to stabilization of MDM2 and p53, accumulation of polyubiquitinated proteins, and induction of apoptosis in MM cells [1]
- P5091 (P005091) overcomes bortezomib resistance in MM cells, both in vitro and in vivo, making it a potential therapeutic agent for relapsed/refractory multiple myeloma [1]
- The compound exhibits favorable pharmacokinetic properties, including tumor penetration and manageable toxicity, supporting its development as an anticancer drug [1]
- USP7 inhibition by P5091 (P005091) represents a novel targeted therapy strategy for multiple myeloma, particularly in patients with bortezomib-resistant disease [1]

C12H7CL2NO3S2

348.22

346.924

C, 41.39; H, 2.03; Cl, 20.36; N, 4.02; O, 13.78; S, 18.42

882257-11-6

2819993

Light yellow to yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

452.4±45.0 °C at 760 mmHg

227.4±28.7 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.685

5.02

116.43

0

5

3

20

393

0

O=C(C)C1=CC([N+](=O)[O-])=C(SC2C(Cl)=C(Cl)C=CC=2)S1

LKZLGMAAKNEGCH-UHFFFAOYSA-N

1-(5-((2,3-dichlorophenyl)thio)-4-nitrothiophen-2-yl)ethanone InChI=1S/C12H7Cl2NO3S2/c1-6(16)10-5-8(15(17)18)12(20-10)19-9-4-2-3-7(13)11(9)14/h2-5H,1H3

1-(5-((2,3-dichlorophenyl)thio)-4-nitrothiophen-2-yl)ethanone

P005091; P-005091; P 005091; P5091; P-5091; P 5091.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 25~28 mg/mL ( 71.79~80.4 mM)
1-Methyl-2-pyrrolidinone : ~100 mg/mL (~287.17 mM)

配方 1 中的溶解度: 8 mg/mL (22.97 mM) in 4% NMP 3% Tween80 + 20% PEG400 73% ddH2O (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。

---

配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (7.18 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声和加热处理
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

配方 4 中的溶解度: 6.5% DMSO+40% PEG300+5% Tween80+48.5% ddH2O: 1.95mg/ml

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。