NEDD8-activating enzyme (NAE) (IC50 = 4.7 nM)
NEDD8-activating enzyme (NAE) [1]
- NEDD8-activating enzyme (NAE) [2]
- NEDD8-activating enzyme (NAE) [4]

Pevonedistat (MLN4924) 选择性抑制密切相关的酶 UAE、SAE、UBA6 和 ATG7（IC50 分别为 1.5、8.2、1.8 和 >10 μM），同时是 NAE 的强效抑制剂（半数最大抑制剂量，IC50） =0.004μM）。使用 pevonedistat (MLN4924) 处理可降低生长的 HCT-116 细胞中的总蛋白周转率。 Pevonedistat (MLN4924) 对 HCT-116 细胞处理 24 小时，导致 NEDD8-cullin 缀合物和 Ubc12-NEDD8 硫酯呈剂量依赖性减少，IC50 < 0.1 μM。这伴随着已知 CRL 底物丰度的相互增加，例如 CDT1、p27 和 NRF2（也称为 NFE2L2），但非 CRL 底物则不然[1]。 Pevonedistat 通过诱导 CLL 细胞凋亡来克服基质介导的耐药性。 Pevonedistat 促进 CLL 细胞中 Noxa 和 Bim 的表达，从而导致 Bcl-2 家族成员重新平衡，有利于促凋亡 BH3-only 蛋白 [2]。 Pevonedistat (MLN4924) 通过转录激活 E-钙粘蛋白和抑制 MMP-9 来强烈抑制迁移。它还立即抑制 cullin 1 neddylation，并以剂量和时间依赖性方式显着降低胃癌细胞的增殖和存活以及迁移[3]。

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在追踪 E2-UBL 硫酯反应产物形成的纯化酶测定中，pevonedistat (MLN4924) 是 NAE 的有效抑制剂，并且对密切相关的酶 UAE、SAE、UBA6 和 ATG7 具有选择性（IC50=1.5、8.2、1.8，和 >10 μM，分别）。在纯酶和细胞测定中，与密切相关的泛素激活酶（UAE，也称为 UBA1）和 SUMO 激活酶（SAE；SAE1 和 UBA2 亚基的异二聚体）相比，pevonedistat (MLN4924) 优先抑制 NAE 活性。 MLN4924 对多种人类肿瘤来源的细胞系表现出强大的细胞毒活性[1]。

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MLN4924是NAE 的选择性抑制剂[1]
MLN4924是通过对n6 -苄基腺苷的反复药物化学研究发现的，n6 -苄基腺苷最初通过高通量筛选被鉴定为NAE抑制剂（见化学表征补充信息）。如图1a所示，MLN4924在结构上与腺苷5′-单磷酸腺苷（AMP）相关，AMP是NAE反应的紧密结合产物。AMP与MLN4924的主要区别在于：(1)MLN4924在N6处以氨基取代去氮嘌呤碱基取代腺嘌呤碱基；(2) MLN4924具有一个碳环代替核糖，并且缺少AMP的2′-羟基的等价物；(3) MLN4924用磺胺酸盐代替磷酸盐；(4)与AMP的立体化学结构相反，MLN4924的亚甲磺酸与去氮嘌呤呈非天然的反关系。x射线晶体学证实MLN4924结合在NAE的核苷酸结合位点。

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通过这种方法，研究人员确定了pevonedistat （MLN4924）和TNF-α之间的协同细胞毒性。Pevonedistat是nedd8活化酶（NAE）的抑制剂。NAE的抑制阻止cullin-RING连接酶的激活，而cullin-RING连接酶对于蛋白酶体介导的蛋白质降解至关重要。TNF-α是一种细胞因子，参与炎症反应和细胞死亡，以及其他生物功能。培酮远地与TNF-α联合（而非单独）治疗培养细胞可导致细胞快速死亡。确定这种细胞死亡是由caspase-8介导的。有趣的是，佩onedistat和TNF-α联合治疗也引起caspase-8的p10蛋白酶亚基的积累，这在细胞毒性剂量的TNF-α中没有观察到。在细胞凋亡被阻断的情况下，死亡机制转变为坏死下垂。［2］

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Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 是一种强效且选择性的NAE抑制剂。它可破坏cullin-RING连接酶介导的蛋白质周转，通过解除S期DNA合成的调控，诱导人类肿瘤细胞凋亡性死亡[1]
- 在大鼠肝癌H-4-II-E细胞中，Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 与TNF-α联合使用表现出协同细胞毒性，联合用药的LC₅₀约为Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 单药的1/300。该联合用药可诱导快速细胞死亡（16小时内杀死约95%的细胞），其机制为caspase-8介导的凋亡，伴随凋亡标志物（裂解型caspase-3、PARP、BID）的裂解及caspase-8 p10亚基的积累。当凋亡被阻断时，细胞死亡方式切换为坏死性凋亡，三聚化MLKL可作为坏死性凋亡的生物标志物。这种协同细胞毒性在原代大鼠肝细胞、肝枯否细胞、大鼠近端小管细胞系NRK-52E、人类急性单核细胞白血病细胞系THP-1及人类肝细胞癌系HEP-G2中均有观察到[2]
- 在人类胃癌细胞中，Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 以剂量和时间依赖性方式快速抑制cullin 1的neddylation修饰。它通过诱导G2/M期阻滞（通过积累CDT1/ORC1并触发DNA损伤反应）、衰老（通过积累p21/p27）及保护性自噬（通过积累PHLPP1），抑制细胞生长和存活。此外，它通过转录激活E-钙粘蛋白并抑制MMP-9，从而抑制细胞迁移。不同胃癌细胞系的生长抑制IC₅₀值存在差异，集落形成能力呈显著的剂量依赖性降低[4]

Pevonedistat（MLN492410，30 或 60 mg/kg，皮下注射）可降低正常小鼠组织中的 NEDD8-cullin 水平，如小鼠骨髓细胞中所证明的那样，并增加 HCT-116 荷瘤动物中 NRF2 和 CDT1 的稳态水平- 和时间相关的方式。当每日两次给予 30 和 60 mg/kg 剂量（T/C 值分别为 0.36 和 0.15）时，pevonedistat (MLN4924) 可抑制肿瘤发展[1]。 在携带 HCT-116 异种移植物的小鼠中，pevonedistat (MLN4924)（皮下、10 mg/kg、30 mg/kg 或 60 mg/kg）抑制 NEDD8 通路，导致 DNA 损伤[1]。 pevonedistat（sc，120 mg/kg）和TNF-α（10 μg/kg）的组合会损害SD大鼠的肝脏[2]。

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MLN4924在体内抑制NAE通路[1]
为了评估MLN4924在体内抑制NAE的能力，HCT-116荷瘤小鼠接受单次皮下剂量10、30或60 mg kg-1 MLN4924，并在随后的24小时内的不同时间点切除肿瘤。在肿瘤裂解物中评估了治疗的药效学效果，分析了NEDD8-cullin、NRF2和CDT1蛋白水平（图4a-c）。单剂量MLN4924可导致NEDD8-cullin水平在给药后30分钟呈剂量依赖性和时间依赖性下降（图4a），在给药后1-2小时效果最大。10、30、30 mg kg-1 （P = 0.11）、30、60 mg kg-1 （P = 0.24）组间无显著差异，但10、60 mg kg-1组间差异显著（P < 0.01）。单剂量MLN4924也导致NRF2和CDT1的稳态水平呈剂量依赖性和时间依赖性增加（图4b， c）。对于所有剂量水平，NRF2蛋白水平在给药后2-4小时达到峰值，并在给药后4-8小时开始下降。与NRF2相比，CDT1积累的时间略有延迟，在MLN4924给药后4小时达到峰值（图4c）。在单次给药30和60 mg kg-1 MLN4924后8小时，磷酸化的CHK1 （Ser 317）水平升高表明肿瘤中DNA损伤的证据（图4d）。值得注意的是，MLN4924还降低了正常小鼠骨髓细胞中NEDD8-cullin的水平（补充图5）。这些数据表明，在这种体内肿瘤模型中，MLN4924介导的NAE抑制导致了与培养细胞[1]中观察到的通路反应和细胞表型效应相一致。

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Pevonedistat和TNF-α协同引起大鼠肝损伤[2]
在Sprague-Dawley大鼠的体内实验中，观察哌酮远地和TNF-α的作用。从先前的研究中得知，给予大鼠的佩维奈远的剂量耐受性良好，重组大鼠TNF-α的剂量激活了TNF信号，没有毒副作用每组（n=8）先给药或10 μg/kg TNF-α， 1 h后再给药或120 mg/kg哌酮。2只接受联合治疗的动物表现出垂死状态，并在10小时内被安乐死。单药与联合用药对大鼠肝损伤有明显差异。表1列出了各剂量组5只代表性动物肝脏显微镜检查结果的发生率和严重程度。给药pevondistat +TNF-α的动物肝脏出现轻微至轻度单细胞坏死和中性粒细胞浸润。图6a中具有代表性的组织学图像显示，单独接受佩伏奈远治疗的动物肝脏出现核肿大（白色箭头），联合治疗的动物肝脏出现坏死（黑色箭头）和中性粒细胞浸润（白色箭头）。与接受单药治疗的动物相比，接受联合治疗的动物血清标志物丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和山梨醇脱氢酶（SDH）显著升高约5倍（图6b）。肝提取物的Western blotting在所有动物中鉴定出未裂解的caspase-8（图6c，箭头），在接受pevonedistat±TNF-α（箭头）治疗的9/10只动物中观察到caspase-8的p32片段。p10和p18（数据未显示）均未检测到。在caspase-8切割的样品中，裂解的clip - l 43-kDa片段的染色最强。与对照组相比，pevonedistat±TNF-α组caspase-8活性升高4倍（图6d）。caspase-8激活是否是大鼠毒性的主要驱动因素尚不能确定。

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Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 在小鼠中以良好耐受的化合物暴露量抑制人类肿瘤异种移植物的生长[1]
- 在Sprague-Dawley大鼠中，Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924)（120 mg/kg，皮下注射）与TNF-α（10 μg/kg，静脉注射）联合使用会导致显著的肝损伤。仅联合用药组出现血清肝损伤标志物（ALT、AST、SDH，较单药治疗组升高约5倍）升高，以及肝细胞单细胞坏死伴中性粒细胞浸润。联合用药组中有2只大鼠出现濒死状态，在10小时内被安乐死[2]

体外e1活化酶测定[1]
采用时间分辨荧光能量转移法测定NAE的体外活性。酶促反应含50 μl 50 mM HEPES， pH 7.5, 0.05% BSA, 5 mM MgCl2, 20 μM ATP， 250 μM谷胱甘肽，10 nM Ubc12-GST， 75 nM NEDD8-Flag和0.3 nM重组人NAE酶，在284孔板上24°C孵育90 min，终止前用25 μl停止/检测缓冲液(0.1 M HEPES, pH 7.5, 0.05% Tween20, 20 mM EDTA, 410 mM KF，0.53 nM euroium - crypate标记的单克隆flag - m2特异性抗体和8.125 μg ml-1 PHYCOLINK allophycocyanin （XL-APC）标记的gst特异性抗体)。24°C孵育2小时后，在LJL Analyst HT Multi-Mode仪器上使用时间分辨荧光法读取板。其他E1酶也采用了类似的测定方法。

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体蛋白周转测定[1]
将HCT-116细胞以每孔1 × 105个细胞的速度镀于12孔板中，孵育过夜。培养基中加入不含蛋氨酸的DMEM，其中含有10%的透析FBS和50 μCi /孔的[35S]蛋氨酸，细胞孵育20分钟，标记合成蛋白。然后用添加2 mM蛋氨酸的DMEM洗涤细胞三次。然后加入含有10%牛血清、2 mM蛋氨酸和图2所示试验化合物的新鲜培养基。在规定的时间点，收集50 μl的介质，进行液体闪烁计数。时间过程结束时，除去剩余培养基，加入1 ml 0.2 N NaOH溶解细胞，提取液进行液体闪烁计数。每个时间点的蛋白质周转百分比计算为[（上清液中总酸溶性计数）/（上清液中总酸溶性计数+溶解细胞中总酸溶性计数）]×100。

细胞活力测定[1]
细胞悬液以每孔3000 - 8000个细胞的速度接种于96孔培养板中，在37℃下孵育过夜。将化合物添加到完全生长培养基中的细胞中，在37℃下孵育72 h。使用ATPlite法定量细胞数量。

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Western blot分析培养细胞[1]
在6孔细胞培养皿中培养的HCT-116细胞用0.1% DMSO（对照）或MLN4924/pevonedistat处理24 h。制备全细胞提取物并进行免疫印迹分析。为了分析E2-UBL的硫酯水平，裂解物用非还原SDS-PAGE分离，并用Ubc12、Ubc9和Ubc10多克隆抗体进行免疫印迹。对于其他蛋白的分析，裂解物通过还原SDS-PAGE进行分离，并用以下一抗进行探针检测：小鼠CDT1、p27、geminin、ubiquitin、securin/PTTG和p53单克隆抗体或兔NRF2、Cyclin B1和GADD34多克隆抗体。兔NEDD8单克隆抗体和磷酸化CHK1 （Ser 317）单克隆抗体由Millennium与Epitomics， Inc.合作，分别以Ac-KEIEIDIEPTDKVERIKERVEE-amide和Ac-VKYSS(pS)QPEPRT-amide作为免疫原制备。pH3、cleaved PARP和cleaved caspase 3抗体来自Cell Signaling Technologies。根据需要使用兔IgG或小鼠IgG 二级酶标抗体。用ECL试剂进行印迹。对于补充图2，二抗为alexa -680标记的兔/小鼠IgG抗体，印迹使用Li-Cor Odyssey红外成像系统成像。

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细胞周期分析[1]
对数生长的HCT-116细胞用MLN4924/pevonedistatt 或DMSO孵育指定时间。收集的细胞在70%乙醇中固定，在4°C下保存过夜。将固定细胞离心去除乙醇，将微球在PBS中碘化丙啶和RNase A中重悬1小时，避光。流式细胞术测定细胞周期分布，用Winlist软件（Verity）分析。

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FACS分析[2]
DNA核含量的测定如前所述积极分裂的h -4- ii - e细胞用MLN4924/pevonedistat 和/或TNF-α处理8小时。在处理结束前，给细胞加10 μM溴脱氧尿苷（Brd-U）。30min后，将细胞固定在乙醇中，用fitc抗brd - u二抗孵育，再用10 μg/ml碘化丙啶（PI）孵育。在FACSCalibur流式细胞仪上检测标记细胞的Brd-U和PI染色。使用FACSDiva （v 6.1.1）分析细胞周期数据。

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siRNA敲低[2]
H-4-II-E细胞转染了非靶向siRNA对照库或单个siGenome siRNA寡核苷酸双链，旨在沉默靶大鼠基因caspase-8和cdt1。细胞稀疏地镀在无抗生素培养基中（96孔板10000个细胞/孔，6孔组织培养板500000个细胞/孔）。第二天，用Lipofectamine RNAiMAX转染细胞25 nM sirna 72 h。转染后，用MLN4924/pevonedistat 和/或TNF-α处理细胞24-48小时。western blotting证实敲除成功。实验中使用的sirna序列包含在补充信息中。

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细胞培养[2]
选择大鼠肝癌H-4-II-E细胞系模拟MLN4924/pevonedistat毒性，因为它常用于毒性化合物的评估。43,44个H-4-II-E细胞从美国型培养收集公司购买，并按照制造商的说明进行培养。简单地说，细胞在添加10%胎牛血清的MEM中培养，在37°C和5% CO2中孵育。常规培养时，细胞中分别添加10 U/l青霉素和10 ug/l链霉素。传代时，细胞用PBS洗涤一次，用0.05%胰蛋白酶- edta处理，补充新鲜培养基，在临床离心机中成粒。

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细胞活力与细胞毒性实验：将靶细胞（如H-4-II-E细胞、胃癌细胞）接种到96孔板中。用不同浓度的Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 单药或与TNF-α联合处理细胞24-72小时。使用发光法量化细胞内ATP水平以确定细胞活力，并计算LC₅₀值[2][4]
- Western blot分析：用指定浓度和时间的Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 处理细胞。裂解细胞、提取蛋白质、电泳分离、转移至膜上，并用特异性抗体孵育以检测靶蛋白（如NEDD8-cullin、游离NEDD8、裂解型caspase-3、PARP、BID、CDT1、p21、PHLPP1、E-钙粘蛋白、MMP-9）[2][4]
- 流式细胞术（FACS）分析：用Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 处理活跃分裂的细胞8-72小时。用碘化丙啶（PI）和/或Brd-U染色，分析细胞周期分布（G2/M期阻滞、DNA再复制）和DNA片段化[2][4]
- TUNEL实验：将细胞接种到盖玻片上，用Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 和/或TNF-α处理6小时。使用比色TUNEL实验检测具有缺口DNA的凋亡细胞，并用DAPI进行核染色可视化[2]
- 集落形成实验：将细胞接种到60 mm培养皿中，用指定浓度的Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 处理10天。固定并染色集落，然后计数并量化集落数量，以评估长期细胞生长抑制作用[4]
- Transwell迁移实验和划痕愈合实验：Transwell实验中，将细胞饥饿24小时，用Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 处理12小时，然后接种到Transwell小室的上室并孵育特定时间。计数下室膜上的迁移细胞。划痕愈合实验中，在融合的细胞单层上制造划痕，用Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 处理，并随时间测量划痕闭合率[4]
- siRNA敲低挽救实验：将靶向CDT1、p21、PHLPP1的siRNA或对照siRNA转染到细胞中。转染24-72小时后，用Pevonedistat HCl (MLN-4924; TAK-924) 处理细胞24-48小时。分析细胞周期分布、衰老或自噬，以验证特定底物在药物作用机制中的作用[4]

10%环糊精；60 mg/kg；皮下注射
\n荷HCT-116异种移植瘤小鼠\n肿瘤异种移植疗效实验[1]
\n所有体内研究均使用雌性无胸腺NCR小鼠。所有动物的饲养和处理均符合《实验动物饲养和使用指南》。将2 × 10⁶个HCT-116细胞（或30–40 mg H522肿瘤碎片）皮下注射到小鼠右侧腹部，并用游标卡尺测量肿瘤生长情况。当平均肿瘤体积达到约200 mm³时，皮下注射赋形剂（10%环糊精）或MLN4924。在治疗的最后一天计算肿瘤生长抑制率 (T/C)。

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\n药效学标志物分析[1]
\n将携带 300–500 mm3 HCT-116 肿瘤的小鼠单次给予 MLN4924 给药，并在指定时间切除肿瘤并制备提取物。使用 Alexa680 标记的抗 IgG（Molecular Probes）作为二抗，通过定量免疫印迹分析评估 NEDD8-cullin 和 NRF2 的相对水平。使用 Kruskal-Wallis 检验确定各组间 NEDD8-cullin 抑制的统计学差异。为了分析肿瘤切片中 CDT1 和磷酸化 CHK1 (Ser 317) 的水平，将福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤切片用相关抗体染色，用 HRP 标记的二抗进行扩增，并用 ChromoMap DAB 试剂盒进行检测。切片用苏木精复染。使用 Eclipse E800 显微镜和 Retiga EXi 彩色数码相机采集图像，并使用 Metamorph 软件进行处理。CDT1 和磷酸化 CHK1 的水平以 DAB 信号面积的函数表示。

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\n从小鼠中分离骨髓细胞 [1]
\n为了进行骨髓药效学研究，给未经处理的 NCr-Nude 小鼠注射 MLN4924，并在指定时间取出腿骨。用 PBS 从骨骼中冲洗出骨髓，通过离心沉淀，并进行速冻。解冻后的骨髓在含有蛋白酶抑制剂的 M-PER 缓冲液（Pierce）中裂解。采用免疫印迹分析法测定 NEDD8-cullin 水平。

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\n体内大鼠模型[2]
\n使用 10 周龄雄性 Sprague-Dawley 大鼠。在两项研究中，每组共 8 只动物分别接受赋形剂、TNF-α、pevonedistat 或 pevonedistat+TNF-α 给药。首先，动物经静脉注射赋形剂（1× PBS）或 10 μg/kg TNF-α。一小时后，皮下注射赋形剂（20% 磺丁基醚-β-环糊精，溶于 50 mM 柠檬酸缓冲液，pH 3.3）或 120 mg/kg pevonedistat。给药后 24 小时进行计划内安乐死。当动物出现濒死状态时，进行非计划内安乐死。在尸检时采集血清，并分析肝损伤的血清化学标志物（ALT、AST 和 SDH）。此外，每组取 5 只动物的肝脏，将其分为两部分，一部分冷冻于 -80 °C 用于后续蛋白质分析，另一部分固定于 10% 中性缓冲福尔马林溶液中，石蜡包埋，切片厚度为 4–6 μm，贴于载玻片上，苏木精-伊红染色，并使用 Olympus BX51 光学显微镜进行组织病理学评估。显微镜下观察到的结果根据大鼠肝脏病变分类的标准化命名法进行记录。\n

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\n小鼠人肿瘤异种移植模型：通过将肿瘤细胞接种到免疫缺陷小鼠体内建立人肿瘤异种移植模型。通过适当途径（未具体说明）以耐受性良好的剂量给予盐酸培沃地司他（MLN-4924；TAK-924）。监测肿瘤随时间推移的生长情况，并比较药物治疗组和对照组的肿瘤体积[1]
\n- 大鼠肝毒性试验：使用10周龄雄性Sprague-Dawley大鼠（每组n=8）。首先，静脉注射赋形剂（1× PBS）或10 μg/kg TNF-α。一小时后，皮下注射赋形剂（20%磺丁基醚β-环糊精，溶于50 mM柠檬酸缓冲液，pH 3.3）或120 mg/kg盐酸培沃地司他（MLN-4924；TAK-924）。给药后24小时处死大鼠（或濒死时提前处死）。收集血清以分析肝功能指标（ALT、AST、SDH），并解剖肝脏进行组织病理学分析（苏木精-伊红染色）和蛋白质提取[2]

体外实验表明，单独使用盐酸培沃地司他（MLN-4924；TAK-924）对多种细胞系的细胞毒性较低，但与TNF-α联用时，可通过caspase-8介导的细胞凋亡或坏死性凋亡（当细胞凋亡被阻断时）协同诱导细胞死亡[2]。体内临床试验中，高剂量盐酸培沃地司他（MLN-4924；TAK-924）与不良反应相关，包括肝转氨酶升高和多器官功能衰竭。在大鼠中，盐酸培沃地司他（MLN-4924；TAK-924）与TNF-α联用可导致显著的肝损伤（单细胞坏死、中性粒细胞浸润）和血清肝损伤标志物升高[2]。

[1]. An inhibitor of NEDD8-activating enzyme as a new approach to treat cancer. Nature. 2009 Apr 9;458(7239):732-6.

[2]. The NAE inhibitor pevonedistat (MLN4924) synergizes with TNF-α to activate apoptosis. Cell Death Discovery 1, Article number: 15034 (2015).

[3]. The Nedd8-Activating Enzyme Inhibitor MLN4924 Thwarts Microenvironment-Driven NF-κB Activation and Induces Apoptosis in Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells.

[4]. Neddylation inhibitor MLN4924 suppresses growth and migration of human gastric cancer cells. Sci Rep. 2016 Apr 11;6:24218.

培沃内司他（Pevonedistat）是一种吡咯并嘧啶类化合物，其结构为7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，在4位被(1S)-2,3-二氢-1H-茚-1-基腈基取代，在7位被(1S,3S,4S)-3-羟基-4-[(氨磺酰氧基)甲基]环戊基取代。它是一种强效且选择性的NEDD8激活酶抑制剂，IC50值为4.7 nM，目前正在进行临床研究，用于治疗急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征。它具有诱导细胞凋亡和抗肿瘤的双重作用。它是一种吡咯并嘧啶类化合物，属于仲氨基化合物、环戊醇类化合物、磺酰胺类化合物和茚满类化合物。
Pevonedistat 已用于淋巴瘤、实体瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和转移性黑色素瘤等多种肿瘤的治疗试验。
Pevonedistat 是一种小分子 Nedd8 激活酶 (NAE) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。Pevonedistat 与 NAE 结合并抑制其活性，从而可能抑制肿瘤细胞的增殖和存活。NAE 激活 Nedd8（神经前体细胞表达的发育下调蛋白 8），Nedd8 是一种泛素样蛋白 (UBL)，它通过一条与泛素-蛋白酶体途径 (UPP) 平行但不同的通路修饰细胞靶标。与 Nedd8 等 UBL 结合的蛋白质参与多种调控活动，通常不会被蛋白酶体降解。

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药物适应症
治疗急性髓系白血病，治疗骨髓增生异常综合征。

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细胞蛋白酶体功能抑制剂的临床开发表明，靶向泛素-蛋白酶体系统其他组分的化合物可能对治疗人类恶性肿瘤有效。NEDD8 激活酶 (NAE) 是 NEDD8 结合途径的重要组成部分，它控制着 cullin-RING 亚型泛素连接酶的活性，从而调节蛋白酶体上游部分蛋白质的周转。cullin-RING 连接酶的底物在与癌细胞生长和存活途径相关的细胞过程中发挥着重要作用。本文介绍了一种高效且选择性的 NAE 抑制剂 MLN4924。 MLN4924 通过一种新的作用机制——S期DNA合成失调——破坏cullin-RING连接酶介导的蛋白质周转，从而导致人类肿瘤细胞凋亡。在耐受性良好的化合物暴露剂量下，MLN4924 可抑制小鼠体内人类肿瘤异种移植瘤的生长。我们的数据表明，NAE抑制剂可能具有治疗癌症的潜力。[1]

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本文描述了MLN4924的初步特性，MLN4924是一种NAE小分子抑制剂，代表了一种靶向泛素-蛋白酶体系统（UPS）治疗癌症的新方法。MLN4924可完全抑制细胞中可检测到的NAE通路功能，破坏CRL底物的周转，而CRL底物在细胞周期进程和存活中发挥着重要作用。我们的结果表明，与蛋白酶体活性的抑制相比，NAE通路的抑制能更选择性地破坏癌细胞的蛋白质稳态，这可能导致临床疗效和安全性方面的显著差异。持续抑制NAE通路会导致细胞周期依赖性DNA重复复制，进而激活细胞凋亡。这种表型可能是由于细胞无法降解CRL底物CDT1所致，而CDT1过表达已被证实可诱导DNA重复复制。当通过RNAi降低NAE水平或在温度敏感突变细胞系中NAE活性受损时，也观察到了类似的细胞周期分布。
体内实验表明，MLN4924在耐受性良好的剂量和给药方案下能够抑制人肿瘤异种移植瘤的生长。对接受治疗动物的肿瘤进行分析证实了NEDD8通路的抑制，提示这些药效学标志物可能有助于监测接受MLN4924治疗的患者的NAE抑制情况。这些临床前研究结果支持了MLN4924进入临床开发阶段。[1]预测和理解药物诱导毒性的机制是药物开发的主要目标之一。有研究假设炎症可能在此过程中发挥协同作用。基于细胞的模型提供了一个易于操作的系统来研究此类药物毒性。一些研究团队尝试通过药物和炎症细胞因子的联合治疗来重现体内毒性。通过这种方法，研究人员发现了研究药物pevonedistat（MLN4924）与TNF-α之间的协同细胞毒性。pevonedistat是NEDD8激活酶（NAE）的抑制剂。抑制NAE可阻止cullin-RING连接酶的激活，而cullin-RING连接酶对于蛋白酶体介导的蛋白质降解至关重要。TNF-α是一种细胞因子，除其他生物学功能外，还参与炎症反应和细胞死亡。用培沃尼司他（pevonedistat）和TNF-α联合处理培养细胞，而非单独使用，可导致细胞快速死亡。这种细胞死亡被确定为由caspase-8介导。有趣的是，培沃尼司他和TNF-α联合处理还会导致caspase-8的p10蛋白酶亚基积累，而单独使用细胞毒性剂量的TNF-α则未观察到这种现象。在细胞凋亡被阻断的情况下，细胞死亡机制转变为坏死性凋亡。三聚体MLKL被证实是坏死性凋亡的生物标志物。体内大鼠实验也证实了培沃尼司他与TNF-α升高具有协同毒性。只有联合治疗才会导致血清肝损伤标志物升高和单细胞肝细胞坏死。综上所述，本研究结果揭示了pevonedistat和TNF-α驱动的一种新型协同毒性。[2]

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本研究结果表明，NAE抑制剂pevonedistat与促炎细胞因子TNF-α联用具有毒性。体外毒性的驱动因素似乎是caspase-8 p10蛋白酶的裂解/激活增强，进而激活细胞凋亡。然而，在pevonedistat和TNF-α的细胞毒性模型中，pevonedistat与caspase-8之间的分子机制尚不清楚。由于cullin-3可以泛素化caspase-8（Jin等人³⁶），并且也被pevonedistat抑制，因此它显然是一个值得研究的候选靶点，但cullin-3敲低并未增加对单药TNF-α的敏感性（补充图S4）。最终，cullin-3 在介导协同毒性中的作用并未得到证实。已知单药 pevonedistat 可稳定 ≥120 种不同蛋白质的表达⁴²，但目前尚无证据表明这些蛋白质与 caspase-8 相互作用。需要采用更高通量的方法来确定是否存在任何未知的蛋白质在 pevonedistat + TNF 刺激下变得稳定。使用 pevonedistat 作为工具化合物的进一步研究将有助于更好地理解程序性细胞死亡的分子机制^[2]。MLN4924 是一种新近发现的小分子 NEDD8 激活酶 (NAE) 抑制剂。由于 cullin RING 连接酶 (CRL) 是最大的 E3 泛素连接酶家族，其活性需要 cullin 的 NEDD8 化修饰，因此 MLN4924 通过阻断 cullin 的 NEDD8 化修饰而间接抑制 CRL。鉴于CRLs组分表达上调，且NEDDylation修饰在多种人类癌症中过度激活，MLN4924被发现能有效抑制癌细胞生长。然而，MLN4924是否对胃癌细胞有效尚不清楚。本研究表明，在胃癌细胞中，MLN4924能快速抑制cullin 1的NEDDylation修饰，并以剂量和时间依赖的方式显著抑制细胞生长、存活和迁移。机制研究结合siRNA敲低拯救实验表明，MLN4924诱导多种CRL底物（包括CDT1/ORC1、p21/p27和PHLPP1）的积累，分别触发DNA损伤反应和G2/M期细胞周期阻滞，进而诱导细胞衰老和自噬。 MLN4924 还通过转录激活 E-钙黏蛋白和抑制 MMP-9 显著抑制了细胞迁移。综上所述，我们的研究表明，NEDDylation 修饰和 CRL E3 连接酶是胃癌的潜在靶点，MLN4924 有望进一步开发成为治疗胃癌的有效药物。[4]

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盐酸培沃尼司他（MLN-4924；TAK-924）是首个 NAE 小分子抑制剂。它通过阻断 cullin 的 NEDDylation 修饰发挥作用，从而使 CRL 失活并积累通常通过泛素化途径降解的各种底物。[1][2][4]
该药物已在治疗急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、实体瘤、非血液系统恶性肿瘤、黑色素瘤、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验中进行了评估。患者纳入/排除标准排除了存在活动性未控制感染或近期使用过抗生素的患者，因为这些情况可能导致促炎状态相关的毒性[2]
- 在慢性淋巴细胞白血病B细胞中，盐酸培沃地司他（MLN-4924；TAK-924）可抑制微环境驱动的NF-κB激活并诱导细胞凋亡（更正说明：引用的勘误中未提供详细的实验数据）[3]
- 盐酸培沃地司他（MLN-4924；TAK-924）的作用机制包括：通过CDT1的积累诱导DNA再复制和细胞周期阻滞（单药效应）；通过阻止磷酸化IκBα的降解来阻断促生存的NF-κB信号通路；以及与TNF-α协同激活细胞死亡通路[1][2][4]

C21H26CLN5O4S

479.98

479.139

C, 52.55; H, 5.46; Cl, 7.39; N, 14.59; O, 13.33; S, 6.68

1160295-21-5

Pevonedistat;905579-51-3

66576990

White to off-white solid powder

4.718

140.74

4

8

6

32

734

4

C1CC2=CC=CC=C2[C@H]1NC3=C4C=CN(C4=NC=N3)[C@@H]5C[C@H]([C@H](C5)O)COS(=O)(=O)N.Cl

HJKDNNXKYODZJI-BVMPOVDASA-N

InChI=1S/C21H25N5O4S.ClH/c22-31(28,29)30-11-14-9-15(10-19(14)27)26-8-7-17-20(23-12-24-21(17)26)25-18-6-5-13-3-1-2-4-16(13)18;/h1-4,7-8,12,14-15,18-19,27H,5-6,9-11H2,(H2,22,28,29)(H,23,24,25);1H/t14-,15+,18-,19-;/m0./s1

[(1S,2S,4R)-4-[4-[[(1S)-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl]amino]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl]-2-hydroxycyclopentyl]methyl sulfamate;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.21 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.21 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.21 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。