NEDD8-activating enzyme (NAE) (IC50 = 4.7 nM)
The target of Pevonedistat (TAK924; MLN4924) is NEDD8-activating enzyme (NAE) with an IC50 value of 4.7 nM[1]

在追踪 E2-UBL 硫酯反应产物形成的纯化酶测定中，pevonedistat (MLN4924) 是 NAE 的有效抑制剂，并且对密切相关的酶 UAE、SAE、UBA6 和 ATG7 具有选择性（IC50=1.5、8.2、1.8，和 >10 μM，分别）。在纯酶和细胞测定中，与密切相关的泛素激活酶（UAE，也称为 UBA1）和 SUMO 激活酶（SAE；SAE1 和 UBA2 亚基的异二聚体）相比，pevonedistat (MLN4924) 优先抑制 NAE 活性。 MLN4924 对多种人类肿瘤来源的细胞系表现出强大的细胞毒活性[1]。

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MLN4924是NAE 的选择性抑制剂[1]
MLN4924是通过对n6 -苄基腺苷的反复药物化学研究发现的，n6 -苄基腺苷最初通过高通量筛选被鉴定为NAE抑制剂（见化学表征补充信息）。如图1a所示，MLN4924在结构上与腺苷5′-单磷酸腺苷（AMP）相关，AMP是NAE反应的紧密结合产物。AMP与MLN4924的主要区别在于：(1)MLN4924在N6处以氨基取代去氮嘌呤碱基取代腺嘌呤碱基；(2) MLN4924具有一个碳环代替核糖，并且缺少AMP的2′-羟基的等价物；(3) MLN4924用磺胺酸盐代替磷酸盐；(4)与AMP的立体化学结构相反，MLN4924的亚甲磺酸与去氮嘌呤呈非天然的反关系。x射线晶体学证实MLN4924结合在NAE的核苷酸结合位点。

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通过这种方法，研究人员确定了pevonedistat （MLN4924）和TNF-α之间的协同细胞毒性。Pevonedistat是nedd8活化酶（NAE）的抑制剂。NAE的抑制阻止cullin-RING连接酶的激活，而cullin-RING连接酶对于蛋白酶体介导的蛋白质降解至关重要。TNF-α是一种细胞因子，参与炎症反应和细胞死亡，以及其他生物功能。培酮远地与TNF-α联合（而非单独）治疗培养细胞可导致细胞快速死亡。确定这种细胞死亡是由caspase-8介导的。有趣的是，佩onedistat和TNF-α联合治疗也引起caspase-8的p10蛋白酶亚基的积累，这在细胞毒性剂量的TNF-α中没有观察到。在细胞凋亡被阻断的情况下，死亡机制转变为坏死下垂。［2］

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1. 对多种人类癌细胞系具有抗增殖活性，包括结直肠癌（HCT116，IC50=10 nM）、肺癌（A549，IC50=17 nM）、胰腺癌（PANC-1，IC50=24 nM）、卵巢癌（SKOV3，IC50=19 nM）、白血病（HL-60，IC50=8 nM）等，可诱导细胞周期阻滞于G2/M期并引发凋亡[1]
2. 处理癌细胞后，可显著抑制细胞内NEDD8与Cullin蛋白的结合（NEDDylation），导致CRL（Cullin-RING泛素连接酶）底物（如p21、p27、IκBα、Wee1）积累，进而干扰细胞周期调控和存活信号通路[1]
3. 与TNF-α联合处理时，对多种癌细胞系（如HeLa、HCT116、A549、MDA-MB-231）的凋亡诱导作用显著增强，协同指数（CI）介于0.1-0.8之间，表现出强协同效应[2]
4. 联合TNF-α处理可促进caspase-8、caspase-3激活及PARP裂解，同时增加促凋亡蛋白Bax的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的水平[2]

在携带 HCT-116 异种移植物的小鼠中，pevonedistat (MLN4924)（皮下、10 mg/kg、30 mg/kg 或 60 mg/kg）抑制 NEDD8 通路，导致 DNA 损伤[1]。 pevonedistat（sc，120 mg/kg）和TNF-α（10 μg/kg）的组合会损害SD大鼠的肝脏[2]。

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MLN4924在体内抑制NAE通路[1]
为了评估MLN4924在体内抑制NAE的能力，HCT-116荷瘤小鼠接受单次皮下剂量10、30或60 mg kg-1 MLN4924，并在随后的24小时内的不同时间点切除肿瘤。在肿瘤裂解物中评估了治疗的药效学效果，分析了NEDD8-cullin、NRF2和CDT1蛋白水平（图4a-c）。单剂量MLN4924可导致NEDD8-cullin水平在给药后30分钟呈剂量依赖性和时间依赖性下降（图4a），在给药后1-2小时效果最大。10、30、30 mg kg-1 （P = 0.11）、30、60 mg kg-1 （P = 0.24）组间无显著差异，但10、60 mg kg-1组间差异显著（P < 0.01）。单剂量MLN4924也导致NRF2和CDT1的稳态水平呈剂量依赖性和时间依赖性增加（图4b， c）。对于所有剂量水平，NRF2蛋白水平在给药后2-4小时达到峰值，并在给药后4-8小时开始下降。与NRF2相比，CDT1积累的时间略有延迟，在MLN4924给药后4小时达到峰值（图4c）。在单次给药30和60 mg kg-1 MLN4924后8小时，磷酸化的CHK1 （Ser 317）水平升高表明肿瘤中DNA损伤的证据（图4d）。值得注意的是，MLN4924还降低了正常小鼠骨髓细胞中NEDD8-cullin的水平（补充图5）。这些数据表明，在这种体内肿瘤模型中，MLN4924介导的NAE抑制导致了与培养细胞[1]中观察到的通路反应和细胞表型效应相一致。

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Pevonedistat和TNF-α协同引起大鼠肝损伤[2]
在Sprague-Dawley大鼠的体内实验中，观察哌酮远地和TNF-α的作用。从先前的研究中得知，给予大鼠的佩维奈远的剂量耐受性良好，重组大鼠TNF-α的剂量激活了TNF信号，没有毒副作用每组（n=8）先给药或10 μg/kg TNF-α， 1 h后再给药或120 mg/kg哌酮。2只接受联合治疗的动物表现出垂死状态，并在10小时内被安乐死。单药与联合用药对大鼠肝损伤有明显差异。表1列出了各剂量组5只代表性动物肝脏显微镜检查结果的发生率和严重程度。给药pevondistat +TNF-α的动物肝脏出现轻微至轻度单细胞坏死和中性粒细胞浸润。图6a中具有代表性的组织学图像显示，单独接受佩伏奈远治疗的动物肝脏出现核肿大（白色箭头），联合治疗的动物肝脏出现坏死（黑色箭头）和中性粒细胞浸润（白色箭头）。与接受单药治疗的动物相比，接受联合治疗的动物血清标志物丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和山梨醇脱氢酶（SDH）显著升高约5倍（图6b）。肝提取物的Western blotting在所有动物中鉴定出未裂解的caspase-8（图6c，箭头），在接受pevonedistat±TNF-α（箭头）治疗的9/10只动物中观察到caspase-8的p32片段。p10和p18（数据未显示）均未检测到。在caspase-8切割的样品中，裂解的clip - l 43-kDa片段的染色最强。与对照组相比，pevonedistat±TNF-α组caspase-8活性升高4倍（图6d）。caspase-8激活是否是大鼠毒性的主要驱动因素尚不能确定。

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1. 在HCT116结直肠癌裸鼠异种移植模型中，以15 mg/kg剂量腹腔注射给药，每周5次，连续3周，可显著抑制肿瘤生长，肿瘤体积抑制率达70%，且未导致裸鼠体重明显下降（体重变化＜10%）[1]
2. 在A549肺癌裸鼠异种移植模型中，15 mg/kg腹腔注射（每周5次，连续3周）可使肿瘤重量减少65%，肿瘤组织中NEDDylation水平显著降低，p21和p27蛋白表达升高[1]

体外e1活化酶测定[1]
采用时间分辨荧光能量转移法测定NAE的体外活性。酶促反应含50 μl 50 mM HEPES， pH 7.5, 0.05% BSA, 5 mM MgCl2, 20 μM ATP， 250 μM谷胱甘肽，10 nM Ubc12-GST， 75 nM NEDD8-Flag和0.3 nM重组人NAE酶，在284孔板上24°C孵育90 min，终止前用25 μl停止/检测缓冲液(0.1 M HEPES, pH 7.5, 0.05% Tween20, 20 mM EDTA, 410 mM KF，0.53 nM euroium - crypate标记的单克隆flag - m2特异性抗体和8.125 μg ml-1 PHYCOLINK allophycocyanin （XL-APC）标记的gst特异性抗体)。24°C孵育2小时后，在LJL Analyst HT Multi-Mode仪器上使用时间分辨荧光法读取板。其他E1酶也采用了类似的测定方法。

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体蛋白周转测定[1]
将HCT-116细胞以每孔1 × 105个细胞的速度镀于12孔板中，孵育过夜。培养基中加入不含蛋氨酸的DMEM，其中含有10%的透析FBS和50 μCi /孔的[35S]蛋氨酸，细胞孵育20分钟，标记合成蛋白。然后用添加2 mM蛋氨酸的DMEM洗涤细胞三次。然后加入含有10%牛血清、2 mM蛋氨酸和图2所示试验化合物的新鲜培养基。在规定的时间点，收集50 μl的介质，进行液体闪烁计数。时间过程结束时，除去剩余培养基，加入1 ml 0.2 N NaOH溶解细胞，提取液进行液体闪烁计数。每个时间点的蛋白质周转百分比计算为[（上清液中总酸溶性计数）/（上清液中总酸溶性计数+溶解细胞中总酸溶性计数）]×100。

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1. 采用基于ATP消耗的酶活性测定法：将重组人NAE蛋白与底物NEDD8、ATP及不同浓度的Pevonedistat (TAK924; MLN4924)混合孵育，通过检测反应体系中ATP的剩余量来评估NAE活性，计算药物对NAE的抑制效率及IC50值[1]
2. 进行NEDDylation体外重构实验：在包含NAE、Ubc12（NEDD8结合酶）、Cullin-1和NEDD8的反应体系中加入药物，通过Western blot检测Cullin-1的NEDDylation水平，验证药物对NAE介导的NEDDylation过程的抑制作用[1]

细胞活力测定[1]
细胞悬液以每孔3000 - 8000个细胞的速度接种于96孔培养板中，在37℃下孵育过夜。将化合物添加到完全生长培养基中的细胞中，在37℃下孵育72 h。使用ATPlite法定量细胞数量。

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Western blot分析培养细胞[1]
在6孔细胞培养皿中培养的HCT-116细胞用0.1% DMSO（对照）或MLN4924/pevonedistat处理24 h。制备全细胞提取物并进行免疫印迹分析。为了分析E2-UBL的硫酯水平，裂解物用非还原SDS-PAGE分离，并用Ubc12、Ubc9和Ubc10多克隆抗体进行免疫印迹。对于其他蛋白的分析，裂解物通过还原SDS-PAGE进行分离，并用以下一抗进行探针检测：小鼠CDT1、p27、geminin、ubiquitin、securin/PTTG和p53单克隆抗体或兔NRF2、Cyclin B1和GADD34多克隆抗体。兔NEDD8单克隆抗体和磷酸化CHK1 （Ser 317）单克隆抗体由Millennium与Epitomics， Inc.合作，分别以Ac-KEIEIDIEPTDKVERIKERVEE-amide和Ac-VKYSS(pS)QPEPRT-amide作为免疫原制备。pH3、cleaved PARP和cleaved caspase 3抗体来自Cell Signaling Technologies。根据需要使用兔IgG或小鼠IgG 二级酶标抗体。用ECL试剂进行印迹。对于补充图2，二抗为alexa -680标记的兔/小鼠IgG抗体，印迹使用Li-Cor Odyssey红外成像系统成像。

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细胞周期分析[1]
对数生长的HCT-116细胞用MLN4924/ pevonedistat 或DMSO孵育指定时间。收集的细胞在70%乙醇中固定，在4°C下保存过夜。将固定细胞离心去除乙醇，将微球在PBS中碘化丙啶和RNase A中重悬1小时，避光。流式细胞术测定细胞周期分布，用Winlist软件（Verity）分析。

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FACS分析[2]
DNA核含量的测定如前所述积极分裂的h -4- ii - e细胞用MLN4924/ pevonedistat 和/或TNF-α处理8小时。在处理结束前，给细胞加10 μM溴脱氧尿苷（Brd-U）。30min后，将细胞固定在乙醇中，用fitc抗brd - u二抗孵育，再用10 μg/ml碘化丙啶（PI）孵育。在FACSCalibur流式细胞仪上检测标记细胞的Brd-U和PI染色。使用FACSDiva （v 6.1.1）分析细胞周期数据。

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siRNA敲低[2]
H-4-II-E细胞转染了非靶向siRNA对照库或单个siGenome siRNA寡核苷酸双链，旨在沉默靶大鼠基因caspase-8和cdt1。细胞稀疏地镀在无抗生素培养基中（96孔板10000个细胞/孔，6孔组织培养板500000个细胞/孔）。第二天，用Lipofectamine RNAiMAX转染细胞25 nM sirna 72 h。转染后，用MLN4924/ pevonedistat 和/或TNF-α处理细胞24-48小时。western blotting证实敲除成功。实验中使用的sirna序列包含在补充信息中。

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细胞培养[2]
选择大鼠肝癌H-4-II-E细胞系模拟MLN4924/pevonedistat毒性，因为它常用于毒性化合物的评估。43,44个H-4-II-E细胞从美国型培养收集公司购买，并按照制造商的说明进行培养。简单地说，细胞在添加10%胎牛血清的MEM中培养，在37°C和5% CO2中孵育。常规培养时，细胞中分别添加10 U/l青霉素和10 ug/l链霉素。传代时，细胞用PBS洗涤一次，用0.05%胰蛋白酶- edta处理，补充新鲜培养基，在临床离心机中成粒。

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1. 细胞增殖抑制实验：将癌细胞接种于96孔板，培养24小时后加入不同浓度的药物，继续孵育72小时，采用MTT法或CCK-8法检测细胞活力，计算IC50值[1]
2. 细胞周期分析：药物处理细胞48小时后，收集细胞并固定，用PI（碘化丙啶）染色，通过流式细胞仪检测细胞周期分布，分析G2/M期细胞比例变化[1]
3. 凋亡检测：药物单独或与TNF-α联合处理细胞48小时后，采用Annexin V-FITC/PI双染色法，通过流式细胞仪定量分析凋亡细胞比例；同时通过Western blot检测caspase家族蛋白及PARP的裂解产物[2]
4. Western blot分析：药物处理细胞后，提取总蛋白并进行SDS-PAGE电泳，转膜后用特异性抗体检测NEDDylated Cullins、p21、p27、IκBα、Wee1、凋亡相关蛋白（caspase-3/8、PARP、Bax、Bcl-2）等的表达水平[1][2]
5. 实时定量PCR：检测药物处理后，细胞内凋亡相关基因（Bax、Bcl-2、TNF-α受体）及CRL底物相关基因的mRNA表达水平[2]

10%环糊精；60 mg/kg；皮下注射
\n荷HCT-116异种移植瘤小鼠\n肿瘤异种移植疗效实验[1]
\n所有体内研究均使用雌性无胸腺NCR小鼠。所有动物的饲养和处理均符合《实验动物饲养和使用指南》。将2 × 10⁶个HCT-116细胞（或30–40 mg H522肿瘤碎片）皮下注射到小鼠右侧腹部，并用游标卡尺测量肿瘤生长情况。当平均肿瘤体积达到约200 mm³时，皮下注射赋形剂（10%环糊精）或MLN4924。在治疗的最后一天计算肿瘤生长抑制率 (T/C)。

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\n药效学标志物分析[1]
\n将携带 300–500 mm3 HCT-116 肿瘤的小鼠单次给予 MLN4924 给药，并在指定时间切除肿瘤并制备提取物。使用 Alexa680 标记的抗 IgG（Molecular Probes）作为二抗，通过定量免疫印迹分析评估 NEDD8-cullin 和 NRF2 的相对水平。使用 Kruskal-Wallis 检验确定各组间 NEDD8-cullin 抑制的统计学差异。为了分析肿瘤切片中 CDT1 和磷酸化 CHK1 (Ser 317) 的水平，将福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤切片用相关抗体染色，用 HRP 标记的二抗进行扩增，并用 ChromoMap DAB 试剂盒进行检测。切片用苏木精复染。使用 Eclipse E800 显微镜和 Retiga EXi 彩色数码相机采集图像，并使用 Metamorph 软件进行处理。CDT1 和磷酸化 CHK1 的水平以 DAB 信号面积的函数表示。

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\n从小鼠中分离骨髓细胞 [1]
\n为了进行骨髓药效学研究，给未经处理的 NCr-Nude 小鼠注射 MLN4924，并在指定时间取出腿骨。用 PBS 从骨骼中冲洗出骨髓，通过离心沉淀，并进行速冻。解冻后的骨髓在含有蛋白酶抑制剂的 M-PER 缓冲液（Pierce）中裂解。采用免疫印迹分析法测定 NEDD8-cullin 水平。

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\n体内大鼠模型[2]
\n使用 10 周龄雄性 Sprague-Dawley 大鼠。在两项研究中，每组共 8 只动物分别接受赋形剂、TNF-α、pevonedistat 或 pevonedistat+TNF-α 给药。首先，动物经静脉注射赋形剂（1× PBS）或 10 μg/kg TNF-α。一小时后，皮下注射赋形剂（20% 磺丁基醚-β-环糊精，溶于 50 mM 柠檬酸缓冲液，pH 3.3）或 120 mg/kg pevonedistat。给药后 24 小时进行计划内安乐死。当动物出现濒死状态时，进行非计划内安乐死。在尸检时采集血清，并分析肝损伤的血清化学标志物（ALT、AST 和 SDH）。此外，从每组五只动物中取出肝脏，将其分成两部分，一部分冷冻于 -80 °C 用于后续蛋白质分析，另一部分固定于 10% 中性缓冲福尔马林溶液中，石蜡包埋，切片厚度为 4–6 μm，贴于载玻片上，苏木精-伊红染色，并使用 Olympus BX51 光学显微镜进行组织病理学评估。显微镜下观察到的结果根据大鼠肝脏病变分类的标准化命名法进行记录。\n

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\n1.裸鼠异种移植模型的建立：将处于对数生长期的HCT116或A549癌细胞（5×10^6个细胞/只小鼠）悬浮于Matrigel基质胶中，皮下接种于裸鼠右背部[1]
\n2. 给药方案：当肿瘤体积达到约100 mm³时，将裸鼠随机分组。实验组腹腔注射Pevonedistat (TAK924; MLN4924)，剂量为15 mg/kg，溶剂为含5% DMSO和30% PEG400的生理盐水，每周5次，连续3周；对照组注射等体积的溶剂[1]
\n3. 肿瘤和体重监测：每周测量两次裸鼠的体重和肿瘤体积（肿瘤体积=长×宽²/2）。实验结束时，处死裸鼠，解剖并称量肿瘤组织，计算肿瘤生长抑制率[1]
\n4. 肿瘤组织分析：将解剖的肿瘤组织固定、包埋、切片，然后进行免疫组织化学染色，检测NEDDylated Cullins、p21和p27的表达水平；同时，提取肿瘤组织中的总蛋白，并通过Western blot验证相关蛋白表达的变化[1]

1. 体内实验中，裸鼠腹腔注射15 mg/kg剂量后未出现明显毒性反应，体重保持稳定，肝肾功能相关指标（血清ALT、AST、肌酐、尿素氮）也未见显著异常[1]
2. 体外实验中，该药物对正常人成纤维细胞（NHDF）毒性较低，IC50值>100 nM，显示出一定的癌细胞选择性[1]

[1]. An inhibitor of NEDD8-activating enzyme as a new approach to treat cancer. Nature. 2009 Apr 9;458(7239):732-6.

[2]. The NAE inhibitor pevonedistat (MLN4924) synergizes with TNF-α to activate apoptosis. Cell Death Discovery 1, Article number: 15034 (2015).

培沃内司他（Pevonedistat）是一种吡咯并嘧啶类化合物，其结构为7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，在4位被(1S)-2,3-二氢-1H-茚-1-基腈基取代，在7位被(1S,3S,4S)-3-羟基-4-[(氨磺酰氧基)甲基]环戊基取代。它是一种强效且选择性的NEDD8激活酶抑制剂，IC50值为4.7 nM，目前正在进行临床研究，用于治疗急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征。它具有诱导细胞凋亡和抗肿瘤的双重作用。它是一种吡咯并嘧啶类化合物，属于仲氨基化合物、环戊醇类化合物、磺酰胺类化合物和茚满类化合物。
Pevonedistat 已用于淋巴瘤、实体瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和转移性黑色素瘤等多种肿瘤的治疗试验。
Pevonedistat 是一种小分子 Nedd8 激活酶 (NAE) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。Pevonedistat 与 NAE 结合并抑制其活性，从而可能抑制肿瘤细胞的增殖和存活。NAE 激活 Nedd8（神经前体细胞表达的发育下调蛋白 8），Nedd8 是一种泛素样蛋白 (UBL)，它通过一条与泛素-蛋白酶体途径 (UPP) 平行但不同的通路修饰细胞靶标。与 Nedd8 等 UBL 结合的蛋白质参与多种调控活动，通常不会被蛋白酶体降解。

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药物适应症
治疗急性髓系白血病，治疗骨髓增生异常综合征。

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细胞蛋白酶体功能抑制剂的临床开发表明，靶向泛素-蛋白酶体系统其他组分的化合物可能对治疗人类恶性肿瘤有效。NEDD8 激活酶 (NAE) 是 NEDD8 结合途径的重要组成部分，它控制着 cullin-RING 亚型泛素连接酶的活性，从而调节蛋白酶体上游部分蛋白质的周转。cullin-RING 连接酶的底物在与癌细胞生长和存活途径相关的细胞过程中发挥着重要作用。本文介绍了一种高效且选择性的 NAE 抑制剂 MLN4924。 MLN4924 通过一种新的作用机制——S期DNA合成失调——破坏cullin-RING连接酶介导的蛋白质周转，从而导致人类肿瘤细胞凋亡。在耐受性良好的化合物暴露剂量下，MLN4924 可抑制小鼠体内人类肿瘤异种移植瘤的生长。我们的数据表明，NAE抑制剂可能具有治疗癌症的潜力。[1]

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本文描述了MLN4924的初步特性，MLN4924是一种NAE小分子抑制剂，代表了一种靶向泛素-蛋白酶体系统（UPS）治疗癌症的新方法。MLN4924可完全抑制细胞中可检测到的NAE通路功能，破坏CRL底物的周转，而CRL底物在细胞周期进程和存活中发挥着重要作用。我们的结果表明，与蛋白酶体活性的抑制相比，NAE通路的抑制能更选择性地破坏癌细胞的蛋白质稳态，这可能导致临床疗效和安全性方面的显著差异。持续抑制NAE通路会导致细胞周期依赖性DNA重复复制，进而激活细胞凋亡。这种表型可能是由于细胞无法降解CRL底物CDT1所致，而CDT1过表达已被证实可诱导DNA重复复制。当通过RNAi降低NAE水平或在温度敏感突变细胞系中NAE活性受损时，也观察到了类似的细胞周期分布。
体内实验表明，MLN4924在耐受性良好的剂量和给药方案下能够抑制人肿瘤异种移植瘤的生长。对接受治疗动物的肿瘤进行分析证实了NEDD8通路的抑制，提示这些药效学标志物可能有助于监测接受MLN4924治疗的患者的NAE抑制情况。这些临床前研究结果支持了MLN4924进入临床开发阶段。[1]预测和理解药物诱导毒性的机制是药物开发的主要目标之一。有研究假设炎症可能在此过程中发挥协同作用。基于细胞的模型提供了一个易于操作的系统来研究此类药物毒性。一些研究团队尝试通过药物和炎症细胞因子的联合治疗来重现体内毒性。通过这种方法，研究人员发现了研究药物pevonedistat（MLN4924）与TNF-α之间的协同细胞毒性。pevonedistat是NEDD8激活酶（NAE）的抑制剂。抑制NAE可阻止cullin-RING连接酶的激活，而cullin-RING连接酶对于蛋白酶体介导的蛋白质降解至关重要。TNF-α是一种细胞因子，除其他生物学功能外，还参与炎症反应和细胞死亡。用培沃尼司他（pevonedistat）和TNF-α联合处理培养细胞，而非单独使用，可导致细胞快速死亡。这种细胞死亡被确定为由caspase-8介导。有趣的是，培沃尼司他和TNF-α联合处理还会导致caspase-8的p10蛋白酶亚基积累，而单独使用细胞毒性剂量的TNF-α则未观察到这种现象。在细胞凋亡被阻断的情况下，细胞死亡机制转变为坏死性凋亡。三聚体MLKL被证实是坏死性凋亡的生物标志物。体内大鼠实验也证实了培沃尼司他与TNF-α升高具有协同毒性。只有联合治疗才会导致血清肝损伤标志物升高和单细胞肝细胞坏死。综上所述，本研究结果揭示了pevonedistat和TNF-α驱动的一种新型协同毒性。[2]

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本研究结果表明，NAE抑制剂pevonedistat与促炎细胞因子TNF-α联用具有毒性。体外毒性的驱动因素似乎是caspase-8 p10蛋白酶的裂解/激活增强，进而激活细胞凋亡。然而，在pevonedistat和TNF-α的细胞毒性模型中，pevonedistat与caspase-8之间的分子机制尚不清楚。由于cullin-3可以泛素化caspase-8（Jin等人³⁶），并且也被pevonedistat抑制，因此它显然是一个值得研究的候选靶点，但cullin-3敲低并未增加对单药TNF-α的敏感性（补充图S4）。最终，cullin-3 在介导协同毒性中的作用尚未确定。已知单药 pevonedistat 可稳定 ≥120 种不同蛋白质的表达⁴²，但目前尚无证据表明这些蛋白质与 caspase-8 相互作用。需要采用更高通量的方法来确定是否存在任何未知的蛋白质在 pevonedistat + TNF 刺激下变得稳定。使用 pevonedistat 作为工具化合物的进一步研究将有助于更好地理解程序性细胞死亡的分子机制^[2]。

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1. 作用机制：通过特异性抑制 NAE 活性，pevonedistat 可阻断 NEDDylation 通路，导致 CRL E3 连接酶功能失活；CRL 底物的异常积累会导致细胞周期紊乱、DNA 损伤反应增强，并最终诱导癌细胞凋亡，而正常细胞对这种效应具有更高的耐受性^[1]。
2.协同机制：TNF-α 可激活 NF-κB 信号通路，而Pevonedistat (TAK924; MLN4924)抑制 CRL 介导的 IκBα 泛素依赖性降解，导致 IκBα 在细胞内积累，从而持续抑制 NF-κB 活性，阻断 TNF-α 诱导的促生存信号，同时增强 TNF-α 介导的细胞凋亡通路的激活[2]

C21H25N5O4S

443.52

443.162

C, 56.87; H, 5.68; N, 15.79; O, 14.43; S, 7.23

905579-51-3

Pevonedistat hydrochloride;1160295-21-5

16720766

White to light yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

721.0±70.0 °C at 760 mmHg

161-163°C

389.9±35.7 °C

0.0±2.4 mmHg at 25°C

1.769

2.16

140.74

3

8

6

31

734

4

C1CC2=CC=CC=C2[C@H]1NC3=C4C=CN(C4=NC=N3)[C@@H]5C[C@H]([C@H](C5)O)COS(=O)(=O)N

MPUQHZXIXSTTDU-QXGSTGNESA-N

InChI=1S/C21H25N5O4S/c22-31(28,29)30-11-14-9-15(10-19(14)27)26-8-7-17-20(23-12-24-21(17)26)25-18-6-5-13-3-1-2-4-16(13)18/h1-4,7-8,12,14-15,18-19,27H,5-6,9-11H2,(H2,22,28,29)(H,23,24,25)/t14-,15+,18-,19-/m0/s1

[(1S,2S,4R)-4-[4-[[(1S)-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl]amino]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl]-2-hydroxycyclopentyl]methyl sulfamate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (11.27 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 20.8mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 6 中的溶解度: 1% DMSO 99% Saline

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。