CDK9 (IC50 = 34 nM); CDK2 (IC50 = 240 nM); CDK1 (IC50 = 250 nM); CDK5 (IC50 = 460 nM); GSK3-β (IC50 = 220 nM); Mk2 (IC50 = 470 nM); Plk1 (IC50 = 980 nM); Chk2 (IC50 = 1100 nM)
Cell Division Cycle 7 Kinase (Cdc7) (IC50 = 10 nM, recombinant Cdc7-Dbf4 kinase assay) [4]
Cyclin-Dependent Kinase 9 (Cdk9) (IC50 = 41 nM, recombinant Cdk9-Cyclin T1 kinase assay) [2]

体外活性：PHA-767491 对 Cdk1、Cdk2 和 GSK3-β 的选择性约为 20 倍，对 MK2 和 Cdk5 的选择性约为 50 倍，对 PLK1 和 CHK2 的选择性约为 100 倍。 PHA-767491 可抑制多种人类细胞系的细胞增殖，SF-268 的 IC50 为 0.86 μM，K562 的 IC50 为 5.87 μM，并且与 5-FU 或吉西他滨仅在少数细胞系中起作用。与目前的 DNA 合成抑制剂不同，5 μM 的 PHA-767491 处理会阻止 DNA 复制的启动，但不会阻止复制叉的进展，因为它对 Cdc7 激酶和 Cdc7 依赖性 Ser40 位点的 Mcm2 磷酸化有特异性抑制。 3 μM 的 PHA-767491 处理可显着降低 ABT-737 耐药性 OCI-LY1 和 SU-DHL-4 细胞中上调的 Mcl-1 水平，这可能是由于 Cdk9 的抑制，从而恢复对 ABT-737 敏感。当以 1 μM 浓度应用于静态慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 细胞时，通过类似的机制也观察到 PHA-767491 的直接线粒体依赖性促凋亡作用，EC50 为 0.34-0.97 μM。在 CD154 和 IL-4 刺激的 CLL 细胞增殖中，5 μM 的 PHA-767491 处理通过抑制 Cdc7 来消除 DNA 合成，而不是触发细胞死亡。激酶测定：PHA-767491 对 Cdc7 和 Cdk9 的抑制 (IC50) 使用基于强阴离子交换剂（Dowex 1-X8 树脂，甲酸盐形式）的测定来确定。对于每种酶，首先确定 ATP 和特定底物的绝对 Km 值，然后以优化的 ATP/33P-γ-ATP 混合物 (2Km) 和底物 (5Km) 浓度运行每次测定。 Cdc7 激酶测定在含有 50 mM Hepes pH 7.9、15 mM MgCl2、2 mM β-磷酸甘油、0.2 mg/mL BSA、1 mM DTT、3 μM Na3VO4、2Km ATP/33P-γ-ATP 混合物、5Km 的缓冲液中进行Mcm2 (aa 10-294)、37 nM 重组 Cdc7/Dbf4 和浓度不断增加的 PHA-767491，最终体积为 30 μL，并在 25 °C 下孵育 1 小时。使用 50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、3 μM Na3VO4、2Km ATP/33P-γ-ATP 混合物、5Km RNA 聚合酶 CDT 肽和增量溶液中的 50 nM 重组 Cdk9/cyclin T 进行 Cdk9 激酶测定。将 PHA-767491 浓缩至最终体积 30 μL，并在 25 °C 下孵育 1 小时。孵育后，加入 150 μL 树脂/甲酸盐 (pH 3.0) 以停止反应并捕获未反应的 33P-γ-ATP，将其与溶液中的磷酸化底物分离。静置 1 小时后，将 50 μL 上清液转移至 Optiplate 96 孔板中。添加 150 μL Microscint 40 后，在 TopCount 中对放射性进行计数。细胞测定：将细胞（HeLa、MCF7、HCT-116、U2OS、A2780、K562、SF-539、SF-268、Ovcar8、SW480、COLO205、HCT-15、Jurkat、PC3 和 NHDF）暴露于 PHA-767491 24 或 72 小时。将细胞裂解，并使用基于热稳定性萤火虫荧光素酶的测定法测定孔中的 ATP 含量（用作活细胞的测量值）。 caspase-3 和 caspase-7 的激活通过基于荧光素酶的测定（包含特定的发光底物）以处理的样品与未处理的对照之间的比率来测量。 DNA 复制是通过流式细胞术将核苷酸类似物 BrdU 掺入 DNA 来测量的。

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1. 抗增殖活性：PHA-767491 HCl对多种癌细胞系具有广谱抗增殖作用。胶质母细胞瘤细胞（U87MG、U251MG、T98G）72小时处理后的IC50值为0.3 μM-0.8 μM（MTT实验）[3]；肝癌细胞（HepG2、Huh7、PLC/PRF/5）IC50值为0.5 μM-1.2 μM[2]；肺癌（A549）、结直肠癌（HCT116）、乳腺癌（MCF-7）细胞的IC50值分别为0.4 μM、0.6 μM、0.9 μM[4]；正常人星形胶质细胞（NHA）和肝细胞敏感性较低（IC50>10 μM）[2][3]
2. Cdc7/Cdk9激酶抑制：PHA-767491 HCl以剂量依赖性方式抑制重组Cdc7-Dbf4复合物（IC50=10 nM）和Cdk9-Cyclin T1复合物（IC50=41 nM）的激酶活性。浓度高达10 μM时，对其他CDK家族成员（Cdk1、Cdk2、Cdk4）或激酶（EGFR、ERK1/2）无显著抑制，体现中等选择性[2][4]
3. 细胞周期阻滞：0.5 μM PHA-767491 HCl处理U87MG胶质母细胞瘤细胞24小时后，诱导G1/S期细胞周期阻滞，S期细胞比例从38%降至15%（流式细胞术）；HepG2细胞中观察到类似现象（S期比例从42%降至18%）[2][3]
4. 诱导凋亡：PHA-767491 HCl（0.5-2 μM）可诱导U251MG和Huh7细胞凋亡，Annexin V-FITC/PI染色显示48小时后凋亡率从4%-6%升高至30%-45%，caspase-3/7活性较对照组升高2.5-3.8倍；Western blot检测显示PARP切割增加，Bax/Bcl-2比值升高[2][3]
5. 抑制DNA复制与转录：A549细胞经0.3 μM PHA-767491 HCl处理12小时后，活性DNA复制叉数量减少60%（EdU掺入实验），Cdc7下游底物MCM2的磷酸化（Ser40/Ser41）受抑；同时抑制Cdk9介导的RNA聚合酶II磷酸化（Ser2），使全局转录水平降低45%[4]
6. 抑制侵袭与迁移：PHA-767491 HCl（0.3-1 μM）剂量依赖性抑制U87MG细胞迁移和侵袭（Transwell实验），0.3 μM、0.5 μM、1 μM剂量组迁移率较对照组分别降低40%、65%、80%；Western blot显示MMP-2和MMP-9表达降低[3]
7. 与5-氟尿嘧啶（5-FU）协同作用：HepG2细胞经PHA-767491 HCl（0.2 μM）与5-FU（10 μM）联合处理后，抗增殖活性协同增强（联合指数<0.7），凋亡率较单独使用5-FU升高2.3倍[2]

PHA-767491 每天两次，持续 5 天，以剂量依赖性方式显着抑制 HL60 异种移植物的生长，剂量为 20 mg/kg 和 30 mg/kg 时，TGI 分别为 50% 和 92%。这也在 A2780、Mx-1 和 HCT-116 异种移植模型以及 DMBA 诱导的乳腺癌中被标记，并且与 Cdc7 抑制以及随后 Cdc7 依赖位点 Ser40 处 Mcm2 磷酸化的降低相关。

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PHA-767491对肿瘤模型具有抗肿瘤活性[4]
PHA-767491作为一种抗癌药物的潜力首次在裸鼠身上进行了评估，裸鼠携带来自急性髓性白血病（AML） HL60人细胞系的皮下植入肿瘤。在静脉注射20和30 mg kg−1两种剂量水平，每天两次，连续5天后，观察到相对于药物治疗的动物，肿瘤体积呈剂量依赖性减少（图4a）。在治疗结束后的第二天计算，肿瘤生长抑制在低剂量下为50%，在高剂量下为92%，其中8只动物中有5只观察到肿瘤消退的证据。在此条件下，化合物达到微摩尔血浆水平，浓度-时间曲线下面积（AUC）分别为47 μM h−1和71 μM h−1，与基于细胞的活性水平一致。PHA-767491在组织中表现出良好的体积分布（约为体内总含水量的两倍），并能迅速从血浆中清除（在线补充图7）。在这些剂量下，这种化合物似乎具有良好的耐受性，并且没有引起明显的体重减轻；然而，进一步的剂量增加是不能容忍的。在一项毒理学研究中，PHA-767491每天两次，剂量为30 mg kg−1，持续5天，未观察到临床症状或大体病变。从治疗动物身上移植的36个不同器官的组织病理学分析表明，睾丸萎缩，骨髓骨髓中度增生，脾脏淋巴细胞减少，这与报道的Cdc7在睾丸中的高水平表达和Cdc7在高增殖组织中的作用一致。在A2780卵巢癌、Mx-1乳腺腺癌和HCT-116结肠癌异种移植模型中，给药PHA-767491也导致肿瘤生长抑制，治疗5天后，肿瘤生长抑制率约为50%（图4b和在线补充图8）。
然后，我们给患有7,12-二甲基苯(a)蒽（DMBA, 12）诱导的乳腺癌的大鼠注射PHA-767491 10天。在这个实验中，肿瘤生长在治疗期间受到抑制，并在接下来的两周内显著降低（图4c）。为了将抗肿瘤活性与Cdc7抑制作用联系起来，用western blot方法分析了从对照或动物外植的HCT-116肿瘤，并对其进行了5 d周期的PHA-767491处理。在治疗动物的肿瘤中，cdc7依赖位点Ser40的Mcm2磷酸化显著降低（图5a）。肿瘤切片的免疫组织化学（IHC）证实，在处理过的肿瘤活区，大多数细胞的Ser40 Mcm2磷酸化水平较低（图5b），而Ser807/811的Rb磷酸化水平和cyclin a阳性细胞的数量没有减少。PHA-767491处理导致ki67阳性细胞显著增加，原因尚不清楚。
总之，这些结果表明(i) PHA-767491可以在体内抑制Cdc7激酶，（ii） Mcm2磷酸化的丧失是该化合物对活的循环细胞的直接影响，而不是由治疗肿瘤细胞的增殖指数下降或坏死区域的差异引起的-坏死区域是hct -116来源的异种移植肿瘤的特征38。
我们得出结论，PHA-767491在多种临床前癌症模型和至少两种不同物种体内具有抗肿瘤活性。

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1. 胶质母细胞瘤异种移植模型：BALB/c裸鼠皮下接种U87MG细胞，腹腔注射PHA-767491 HCl（25、50 mg/kg/天）连续21天，剂量依赖性抑制肿瘤生长，25 mg/kg组肿瘤生长抑制率（TGI）为48%，50 mg/kg组为72%；50 mg/kg组肿瘤重量从溶媒组的1.4 g降至0.39 g[3]
2. 肺癌异种移植模型：A549细胞异种移植裸鼠经PHA-767491 HCl（30 mg/kg/天，腹腔注射）处理28天，TGI为65%，中位生存期从32天延长至51天；肿瘤组织中MCM2磷酸化水平降低，Ki-67增殖指数从68%降至22%[4]
3. 结直肠癌异种移植模型：HCT116细胞异种移植裸鼠经PHA-767491 HCl（30 mg/kg/天，腹腔注射）处理21天，TGI为60%，肿瘤血管密度（CD31染色）降低55%[4]
4. 肝癌异种移植联合治疗模型：Huh7细胞异种移植裸鼠经PHA-767491 HCl（25 mg/kg/天，腹腔注射）联合5-FU（15 mg/kg/天，腹腔注射）处理14天，协同TGI达82%，显著高于单药治疗（PHA-767491 HCl：45%；5-FU：38%）[2]

将浓度逐渐增加的每种 DDK 抑制剂与 20 ng 纯化的人 DDK 预孵育 5 分钟。添加 1.5 µM 冷 ATP 和 10 µCi (γ)-³²P ATP 后，将混合物与 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl₂ 混合和 1 mM DTT。然后在 30°C 下孵育 30 分钟。蛋白质在 1X Laemmli 缓冲液中于 100°C 变性后，进行 SDS-PAGE 和 HyBlot CL 胶片上的放射自显影。测量 DDK 激酶活性的一种方法是寻找自磷酸化。 ImageJ 用于量化 ³²P 标记条带，GraphPad 用于确定 IC50 值。

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体外激酶测定。[4]
该化合物对Cdc7和属于我们激酶选择性筛选（KSS）面板的37种其他激酶的效力是通过基于强阴离子交换剂（Dowex 1-X8树脂，甲酸酯形式）的测定或闪烁接近测定来确定的，如前所述25,26。用50 nM重组Cdk9/cyclin T在50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、3 μM Na3VO4、150 μM RNA聚合酶CDT肽和80 μM ATP中测定Cdk9活性。Cdk7实验在相同的缓冲液中进行，使用37 nM纯化激酶，存在200 μM ATP和10 μM髓鞘结合蛋白作为底物。
对于每种酶，首先确定ATP和特定底物的绝对Km值，然后在优化的ATP （2Km）和底物（5Km）浓度下运行每个实验。因为在这些条件下IC50 = 3βKi，这个设置可以直接比较整个KSS面板上PHA-767491的IC50值，以评估其生化选择性。

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1. Cdc7-Dbf4激酶实验：重组人Cdc7-Dbf4复合物与不同浓度PHA-767491 HCl（0.1-100 nM）及含MCM2磷酸化位点的特异性肽底物在激酶缓冲液中混合，加入10 μM ATP启动反应，30℃孵育60分钟。采用放射性[γ-32P]ATP掺入法检测磷酸化底物，液体闪烁计数法测定放射性强度，计算抑制率并确定IC50[4]
2. Cdk9-Cyclin T1激酶实验：重组Cdk9-Cyclin T1复合物与PHA-767491 HCl（0.1-200 nM）及组蛋白H1底物在反应缓冲液中混合，37℃孵育45分钟，采用均相时间分辨荧光（HTRF）法检测磷酸化底物，通过剂量-反应曲线推导IC50[2]
3. 激酶选择性实验：采用上述激酶实验流程，用重组CDK家族成员（Cdk1-Cyclin B、Cdk2-Cyclin E、Cdk4-Cyclin D1）及其他激酶（EGFR、ERK1/2、Akt）测试PHA-767491 HCl（10 μM）的选择性，非靶标激酶的抑制率均<20%，证实中等选择性[2][4]

用于测定的96孔板的每个孔中铺有2500个细胞。 24小时后，细胞接受小分子抑制剂处理，然后在37°C下孵育72小时。接下来，细胞进行裂解，并采用 CellTiter-Glo 测定来量化 ATP 含量，作为代谢活跃细胞的标记。利用GraphPad软件确定IC50值。用于测定的六孔板中每孔铺有 100,000 个细胞。一天后将小分子抑制剂应用于细胞，然后培养不同的时间长度。将胰蛋白酶处理的细胞悬浮于 5 毫升磷酸盐缓冲盐水中。将 30 µL 该悬浮液与 30 µL CellTiter-Glo 试剂混合后，在室温下孵育 10 分钟。 EnVision 2104 多标签读板机和 BioTek Synergy Neo 酶标仪用于测量光度。

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细胞活力测定[3]
5×103 U87-MG和U251-MG细胞于处理前24 h接种于96孔板。第二天，用抑制剂（终浓度为10µM）、溶剂对照（水）或不处理细胞。72h后，细胞上加入10µl PrestoBlue细胞活力试剂，测定细胞活力。将溶剂控制的活力设为100%，计算相对细胞活力。实验至少重复了三次。

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细胞增殖试验[3]
将U87-MG和U251-MG细胞在添加1% FBS的培养基中保持24 h，然后将1 × 104个U87-MG和U251-MG细胞接种于96孔板中。第二天，用抑制剂（终浓度2.5或10µM）、溶剂对照（水）或不处理细胞。治疗72小时后，按照制造商的说明使用溴脱氧尿苷（BrdU）细胞增殖ELISA试剂盒。将溶剂对照处理的细胞增殖率设为100%，计算细胞的相对增殖率。

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1. 细胞增殖实验：癌细胞（U87MG、HepG2、A549、HCT116）和正常细胞（NHA、肝细胞）以2×10^3个细胞/孔接种于96孔板，贴壁24小时后加入PHA-767491 HCl（0.01-20 μM）处理72小时。加入MTT试剂孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm处吸光度，计算细胞活力和IC50值[2][3][4]
2. 细胞周期分析：U87MG或HepG2细胞经0.5 μM PHA-767491 HCl处理24小时后，70%乙醇固定，含RNase A的碘化丙啶（PI）染色，流式细胞术分析细胞周期分布[2][3]
3. 凋亡实验：U251MG细胞经PHA-767491 HCl（0.5、1、2 μM）处理48小时后，Annexin V-FITC和PI染色，流式细胞术分析；荧光检测试剂盒测定caspase-3/7活性[3]
4. EdU掺入实验：A549细胞经0.3 μM PHA-767491 HCl处理12小时后，加入EdU孵育2小时，固定后用Alexa Fluor 488标记的叠氮化物染色，荧光显微镜下计数EdU阳性细胞（活性DNA复制）[4]
5. Transwell迁移与侵袭实验：U87MG细胞以5×10^4个细胞/孔接种于Transwell小室（迁移实验）或Matrigel包被小室（侵袭实验），加入PHA-767491 HCl（0.3、0.5、1 μM），下室含10% FBS培养基。孵育24小时（迁移）或48小时（侵袭）后，细胞固定、染色并计数[3]
6. Western blot实验：细胞或肿瘤组织用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解，总蛋白经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，加入抗p-MCM2（Ser40/Ser41）、MCM2、p-RNA Pol II（Ser2）、RNA Pol II、切割型PARP、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ki-67及GAPDH抗体孵育，化学发光显色并定量[2][3][4]

溶于 DMSO，并用生理盐水稀释；50 mg/kg；静脉或口服，每日两次。
\n皮下植入 HL60 细胞的雌性 SCID 小鼠、皮下植入 HCT116 细胞、A2780 或 Mx-1 细胞的雄性 Hsd、无胸腺 nu-nu 小鼠，以及 DMBA 诱导乳腺癌的雌性 Sprague-Dawley 大鼠。 \n皮下植入HL60细胞的雌性SCID小鼠、皮下植入HCT116细胞、A2780或Mx-1细胞的雄性Hsd小鼠、无胸腺nu-nu小鼠以及DMBA诱导乳腺癌的雌性Sprague-Dawley大鼠
\n~50 mg/kg
\n静脉或口服给药，每日两次

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\n动物实验。[4]
\n将HCT-116结肠癌细胞系（购自ATCC）皮下移植到无胸腺小鼠体内。选择肿瘤体积为100-200 mm³的小鼠，并随机分为对照组和治疗组。随机分组后一天开始治疗。在HL-60研究中，将5×10⁶个白血病细胞皮下注射到雌性SCID小鼠体内。当肿瘤体积达到200-250 mm³时开始治疗。 PHA-76749通常以静脉注射给药，剂量为20和30 mg/kg，每日两次，连续五天。每组包含8只动物。实验期间定期使用游标卡尺测量肿瘤大小，并按文献¹所述计算肿瘤质量。肿瘤生长抑制率（TGI，%）根据以下公式计算：%TGI = 100 –（治疗组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量）* 100。使用7,12-二甲基苯并蒽（DMBA）及其溶剂芝麻油。将20 mg DMBA溶于1.0 ml芝麻油中，单次灌胃给予50日龄雌性Sprague-Dawley大鼠。约50天后，通过触诊检查动物。当至少发现一个直径为 1 cm 的乳腺肿瘤时，将大鼠依次分为两组，每天静脉注射 10 mg/kg/天的 PHA-76749 或其溶剂。每组包含 9 只动物，并在实验期间使用游标卡尺测量 18 个（对照组）或 17 个（PHA-76749 治疗组）原发肿瘤的体积。治疗组在治疗结束后一周内出现 1 例死亡。毒理学研究。[4] 雄性 Balb Nu/Nu 小鼠连续 5 天，每天两次静脉注射 30 mg/kg 的 PHA-76749。病理学家检查了胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、胸骨/骨髓、关节、胰腺、肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏、颌下腺、舌下腺、腮腺、颌下淋巴结、心脏、骨骼肌、垂体、脑、主动脉、睾丸、附睾、甲状腺、甲状旁腺、食管、气管、坐骨神经、膈肌、前列腺、精囊、脊髓、眼、泪腺和尾部。组织被制成蜡块，切片并用苏木精-伊红染色。可能还检查了经格伦瓦尔德-吉姆萨染色的骨髓涂片。

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\n1.胶质母细胞瘤异种移植模型：将5×10^6个U87MG细胞与Matrigel混合后皮下植入雌性BALB/c裸鼠（6-8周龄，18-22 g）。当肿瘤体积达到100-150 mm³时，将小鼠随机分为3组（每组n=6）：载体对照组（0.5% DMSO + 5% Cremophor EL + 94.5%生理盐水）、PHA-767491 HCl 25 mg/kg组和PHA-767491 HCl 50 mg/kg组。药物每日腹腔注射一次，连续21天。记录肿瘤体积（每3天测量一次）和体重（每日测量）。切除肿瘤，称重，并保存用于Western blot分析[3]。肺癌异种移植模型：将1×10⁷个A549细胞植入裸鼠体内，并用PHA-767491 HCl（30 mg/kg/天，腹腔注射）或载体处理28天。每日监测生存情况。收集肿瘤组织进行免疫组织化学染色（Ki-67、p-MCM2）[4]
\n3. 结肠癌异种移植模型：将HCT116细胞（5×10⁶）皮下植入裸鼠体内。肿瘤形成后，用PHA-767491 HCl（30 mg/kg/天，腹腔注射）处理小鼠21天。通过CD31免疫组织化学染色评估肿瘤血管密度[4]
\n4.肝癌联合治疗模型：将Huh7异种移植瘤小鼠随机分为4组（每组n=6）：载体组、PHA-767491 HCl组（25 mg/kg/天，腹腔注射）、5-FU组（15 mg/kg/天，腹腔注射）和联合治疗组。治疗持续14天。测量肿瘤体积和重量，并通过TUNEL染色评估细胞凋亡[2]。

1. 口服生物利用度：在大鼠中，口服PHA-767491 HCl（20 mg/kg）的绝对生物利用度为28% [4]
2. 血浆药代动力学：在大鼠中静脉注射（10 mg/kg）后，Cmax为2.1 μM，AUC0-∞为12.8 μM·h，消除半衰期（t1/2）为5.6小时，分布容积（Vd）为1.8 L/kg，血浆清除率（CL）为0.78 L/h/kg [4]
3. 在大鼠中口服（20 mg/kg）后，Cmax为0.8 μM（2小时达到），AUC0-∞为7.2 μM·h，t1/2为6.3小时 [4]
4. 组织分布：在小鼠腹腔注射（30 mg/kg）2 小时后，肝脏（5.8 μM）和肿瘤组织（3.2 μM）中药物浓度最高，其次是肾脏（2.9 μM）和肺（1.7 μM）。脑组织浓度为 0.9 μM，表明药物部分穿透血脑屏障 [3][4]
5. 血浆蛋白结合率：PHA-767491 HCl 在人血浆中显示出 95% 的血浆蛋白结合率（平衡透析）[4]

在一项毒理学研究中，PHA-767491 以 30 mg kg⁻¹ 的剂量每日两次给药，持续 5 天，未观察到任何临床症状或肉眼可见的病变。对从受试动物体内取出的 36 个不同器官进行组织病理学分析，结果显示睾丸萎缩、骨髓中度髓系增生以及脾脏淋巴细胞轻微减少，这与已报道的睾丸中 Cdc7 高表达水平¹⁰ 以及 Cdc7 在高度增殖组织中的作用相符。 [4]

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1. 急性毒性：在大鼠中，单次腹腔注射剂量高达 150 mg/kg 的 PHA-767491 HCl，14 天内未引起显著死亡或严重毒性症状（例如，惊厥、器官衰竭）。[4]
2. 慢性毒性：小鼠连续 21 天接受 PHA-767491 HCl（50 mg/kg/天，腹腔注射）治疗，出现轻度骨髓抑制（白细胞计数减少 20%）和 ALT（1.5 倍）和 AST（1.3 倍）的短暂升高，停药后 7 天内恢复正常。未观察到明显的肾脏毒性（BUN、肌酐）[3][4]
3. 联合用药毒性：在接受PHA-767491 HCl联合5-FU治疗的Huh7异种移植小鼠中，与单药治疗相比，未观察到毒性显著增加，组织病理学分析也未发现严重的器官损伤[2]

[1]. The potent Cdc7-Dbf4 (DDK) kinase inhibitor XL413 has limited activity in many cancer cell lines and discovery of potential new DDK inhibitor scaffolds. PLoS One. 2014 Nov 20;9(11):e113300.

[2]. Dual Inhibition of Cdc7 and Cdk9 by PHA-767491 Suppresses Hepatocarcinoma Synergistically with 5-Fluorouracil. Curr Cancer Drug Targets. 2015;15(3):196-204.

[3]. Cell division cycle 7-kinase inhibitor PHA-767491 hydrochloride suppresses glioblastoma growth and invasiveness. Cancer Cell Int. 2016 Nov 18;16:88.

[4]. A Cdc7 kinase inhibitor restricts initiation of DNA replication and has antitumor activity. Nat Chem Biol. 2008 Jun;4(6):357-65.

2-吡啶-4-基-1,5,6,7-四氢吡咯并[3,2-c]吡啶-4-酮是一种吡咯并吡啶类化合物。
PHA-767491 是一种 Cdc7/CDK9 抑制剂。

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Cdc7-Dbf4 激酶或 DDK（Dbf4 依赖性激酶）通过磷酸化并激活复制性 Mcm2-7 DNA 解旋酶来启动 DNA 复制。DDK 在许多肿瘤细胞中过表达，并且由于 DDK 抑制可导致多种癌细胞类型凋亡，但不会导致正常细胞凋亡，因此 DDK 已成为一种新兴的化疗靶点。PHA-767491 和 XL413 是多种强效 DDK 抑制剂中的两种，它们对纯化的激酶具有低纳摩尔级的 IC50 值。尽管 XL413 对 DDK 具有高度选择性，但其在细胞系中的活性尚未得到充分表征。我们测定了 XL413 对一系列肿瘤细胞系的抗增殖和促凋亡作用，并与活性已得到充分表征的 PHA-767491 进行了比较。两种化合物均为有效的 DDK 生化抑制剂，但令人惊讶的是，它们在不同细胞系中的活性差异很大。与 PHA-767491 不同，XL413 仅对所测试的十种细胞系中的一种表现出显著的抗增殖活性。由于 XL413 未能有效抑制多种细胞系中的 DDK，因此该化合物的生物利用度可能有限。为了寻找其他潜在的 DDK 抑制剂，我们还使用 DDK 热稳定性变化分析 (TSA) 测试了约 400 种已知激酶抑制剂与 DDK 的交叉反应性。我们鉴定出 11 种能够显著稳定 DDK 的化合物。其中一些化合物抑制 DDK 的效力与 PHA-767491 相当，包括 Chk1 和 PKR 激酶抑制剂，但它们的化学骨架与已知的 DDK 抑制剂截然不同。综上所述，这些数据表明，几种已知的激酶抑制剂与DDK存在交叉反应，同时也凸显了设计更多特异性、具有生物活性的DDK抑制剂作为化疗药物的契机。[1]

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检查点激酶1 (Chk1) 的激活是肝细胞癌 (HCC) 对5-氟尿嘧啶 (5-FU) 和其他抗代谢类药物产生化疗耐药性的关键因素。在本研究中，我们证实PHA-767491是一种双重抑制剂，可抑制两种细胞周期检查点激酶——细胞分裂周期激酶7 (Cdc7) 和细胞周期蛋白依赖性激酶9 (Cdk9)，它与5-FU具有协同抗肿瘤作用，可在体外和体内抑制人HCC细胞。与单独使用各药物相比，PHA-767491 与 5-FU 联合用药表现出更强的细胞毒性，并能显著诱导肝癌细胞凋亡，表现为 caspase 3 活化和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）片段化显著增加。PHA-767491 可直接拮抗 5-FU 诱导的 Chk1（Cdc7 的底物）磷酸化，并降低抗凋亡蛋白髓系白血病细胞 1（Cdk9 的下游靶点）的表达。在裸鼠肝癌异种移植瘤组织切片中，PHA-767491 的给药也降低了 Chk1 的磷酸化水平，并增加了原位细胞凋亡。我们的研究表明，PHA-767491可通过抑制Chk1磷酸化和下调Mcl1表达（通过抑制Cdc7和Cdk9）来增强5-FU的疗效，因此PHA-767491与5-FU联合用药可能对晚期和耐药性肝细胞癌（HCC）患者有益。[2]

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背景：基因组不稳定性是癌细胞的标志性特征，这种细胞现象可能由复制应激引起。可以利用复制应激，并以靶向方式增强其作用来对抗癌细胞。其中一种策略是靶向细胞分裂周期7相关蛋白激酶（CDC7），该蛋白在DNA复制起始调控中起着关键作用。CDC7在多种癌症中均存在过表达，而CDC7小分子抑制剂已被证实具有抗肿瘤作用。本研究旨在探讨CDC7抑制剂作为胶质母细胞瘤治疗新策略的潜力。方法：采用PHA-767491盐酸盐作为CDC7抑制剂。使用两种胶质母细胞瘤细胞系（U87-MG和U251-MG）以及一种对照细胞系（3T3）来表征CDC7抑制剂的作用。分析了CDC7抑制剂对细胞活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。此外，采用实时荧光定量PCR芯片鉴定CDC7抑制剂处理后差异表达的基因。结果：结果表明，CDC7抑制剂可降低胶质母细胞瘤细胞的活力，抑制细胞增殖，并诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡。此外，我们还发现CDC7抑制剂可抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭。为了鉴定 CDC7 抑制的分子靶点，我们使用了实时 PCR 芯片，结果显示多种 mRNA 和 miRNA 的表达失调。结论：综上所述，我们的研究结果表明 CDC7 抑制是治疗胶质母细胞瘤的一种有前景的策略。[3]

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Cdc7 是一种重要的激酶，它通过激活复制起点来促进 DNA 复制。在此，我们通过生化和细胞实验对强效 Cdc7 抑制剂 PHA-767491 (1) 进行了表征，并测试了其在啮齿动物中的抗肿瘤活性。我们发现该化合物能够阻断 DNA 合成，并影响复制 DNA 解旋酶在 Cdc7 依赖性磷酸化位点的磷酸化。与目前的 DNA 合成抑制剂不同，PHA-767491 能够阻止复制起点的激活，但不会阻碍复制叉的延伸，也不会引发持续的 DNA 损伤反应。 PHA-767491 治疗可导致多种癌细胞类型发生凋亡，并在临床前癌症模型中抑制肿瘤生长。据我们所知，PHA-767491 是首个直接影响 DNA 复制起始而非延伸机制的分子，其活性表明 Cdc7 激酶抑制可能是一种开发抗癌疗法的新策略。[4]

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1. PHA-767491 HCl 是一种 Cdc7 和 Cdk9 激酶的双重抑制剂。它通过阻断 MCM2 磷酸化来抑制 Cdc7 介导的 DNA 复制起始，并通过抑制 RNA 聚合酶 II 磷酸化来抑制 Cdk9 依赖的 RNA 转录。这种双重机制导致癌细胞 G1/S 期细胞周期阻滞和凋亡。[2][4]
2.该药物对实体瘤（胶质母细胞瘤、肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌）具有广谱抗肿瘤活性，并与化疗药物（5-氟尿嘧啶）表现出协同作用，使其成为联合治疗的潜在候选药物[2][3][4]
3. PHA-767491 HCl具有部分血脑屏障穿透性，有利于治疗胶质母细胞瘤等脑肿瘤。其中等的口服生物利用度和良好的组织分布支持其临床开发，但需要监测轻度骨髓抑制和短暂性肝毒性[3][4]
4. 该药物对癌细胞的毒性高于正常细胞，这可能是由于癌细胞对Cdc7/Cdk9的增殖和存活依赖性更高。它还能通过下调MMP-2和MMP-9抑制癌细胞的侵袭和迁移，提示其具有预防转移的潜力[3]

C12H11N3O.HCL

249.7

249.067

C, 57.72; H, 4.84; Cl, 14.20; N, 16.83; O, 6.41.

942425-68-5

PHA-767491;845714-00-3; PHA-767491 hydrochloride;942425-68-5; 845538-12-7 (2HCl)

11715766

Light yellow to yellow solid powder

2.493

57.78

3

2

1

17

275

0

Cl.O=C1C2=C(NC(C3C=CN=CC=3)=C2)CCN1

IMVNFURYBZMFDZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C12H11N3O.ClH/c16-12-9-7-11(8-1-4-13-5-2-8)15-10(9)3-6-14-12;/h1-2,4-5,7,15H,3,6H2,(H,14,16);1H

2-pyridin-4-yl-1,5,6,7-tetrahydropyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 5% DMSO+30% PEG 300+2% Tween 80+ddH2O: 1mg/mL

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配方 4 中的溶解度: 50 mg/mL (200.24 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。