PHA 767491 dihydrochloride

CDK9 (IC50 = 34 nM); CDK2 (IC50 = 240 nM); CDK1 (IC50 = 250 nM); CDK5 (IC50 = 460 nM); GSK3-β (IC50 = 220 nM); Mk2 (IC50 = 470 nM); Plk1 (IC50 = 980 nM); Chk2 (IC50 = 1100 nM)

PHA-767491在HCC1954细胞中的IC50为0.64µM，在Colo-205细胞中的IC50为1.3µM，对两种细胞系的增殖均有抑制作用。PHA-767491的IC50值为18.6 nM，是一种有效的体外DDK抑制剂。在HCC1954细胞中，PHA-767491（2µM）在24小时内完全消除Mcm2磷酸化。当与5-FU联合使用时，PHA-767491表现出更大的细胞毒性，并显著诱导细胞凋亡，这可以通过肝癌细胞中显著增加的caspase 3激活和聚（adp -核糖）聚合酶的断裂来证明。通过直接对抗5-FU诱导的Chk1磷酸化，PHA-767491还抑制抗凋亡蛋白髓系白血病细胞系[2]的表达。PHA-767491（0-10µM）具有时间和剂量依赖性，可降低胶质母细胞瘤细胞的活力，对U87-MG和U251-MG细胞的IC50约为2.5µM。除了抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭外，PHA-767491盐酸盐还可引起胶质母细胞瘤细胞的凋亡。

PHA-767491 每天两次，持续 5 天，以剂量依赖性方式显着抑制 HL60 异种移植物的生长，剂量为 20 mg/kg 和 30 mg/kg 时，TGI 分别为 50% 和 92%。这也在 A2780、Mx-1 和 HCT-116 异种移植模型以及 DMBA 诱导的乳腺癌中被标记，并且与 Cdc7 抑制以及随后 Cdc7 依赖位点 Ser40 处 Mcm2 磷酸化的降低相关。

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PHA-767491对肿瘤模型具有抗肿瘤活性[4]
PHA-767491作为一种抗癌药物的潜力首次在裸鼠身上进行了评估，裸鼠携带来自急性髓性白血病（AML） HL60人细胞系的皮下植入肿瘤。在静脉注射20和30 mg kg−1两种剂量水平，每天两次，连续5天后，观察到相对于药物治疗的动物，肿瘤体积呈剂量依赖性减少（图4a）。在治疗结束后的第二天计算，肿瘤生长抑制在低剂量下为50%，在高剂量下为92%，其中8只动物中有5只观察到肿瘤消退的证据。在此条件下，化合物达到微摩尔血浆水平，浓度-时间曲线下面积（AUC）分别为47 μM h−1和71 μM h−1，与基于细胞的活性水平一致。PHA-767491在组织中表现出良好的体积分布（约为体内总含水量的两倍），并能迅速从血浆中清除（在线补充图7）。在这些剂量下，这种化合物似乎具有良好的耐受性，并且没有引起明显的体重减轻；然而，进一步的剂量增加是不能容忍的。在一项毒理学研究中，PHA-767491每天两次，剂量为30 mg kg−1，持续5天，未观察到临床症状或大体病变。从治疗动物身上移植的36个不同器官的组织病理学分析表明，睾丸萎缩，骨髓骨髓中度增生，脾脏淋巴细胞减少，这与报道的Cdc7在睾丸中的高水平表达和Cdc7在高增殖组织中的作用一致。在A2780卵巢癌、Mx-1乳腺腺癌和HCT-116结肠癌异种移植模型中，给药PHA-767491也导致肿瘤生长抑制，治疗5天后，肿瘤生长抑制率约为50%（图4b和在线补充图8）。
然后，我们给患有7,12-二甲基苯(a)蒽（DMBA, 12）诱导的乳腺癌的大鼠注射PHA-767491 10天。在这个实验中，肿瘤生长在治疗期间受到抑制，并在接下来的两周内显著降低（图4c）。为了将抗肿瘤活性与Cdc7抑制作用联系起来，用western blot方法分析了从对照或动物外植的HCT-116肿瘤，并对其进行了5 d周期的PHA-767491处理。在治疗动物的肿瘤中，cdc7依赖位点Ser40的Mcm2磷酸化显著降低（图5a）。肿瘤切片的免疫组织化学（IHC）证实，在处理过的肿瘤活区，大多数细胞的Ser40 Mcm2磷酸化水平较低（图5b），而Ser807/811的Rb磷酸化水平和cyclin a阳性细胞的数量没有减少。PHA-767491处理导致ki67阳性细胞显著增加，原因尚不清楚。
总之，这些结果表明(i) PHA-767491可以在体内抑制Cdc7激酶，（ii） Mcm2磷酸化的丧失是该化合物对活的循环细胞的直接影响，而不是由治疗肿瘤细胞的增殖指数下降或坏死区域的差异引起的-坏死区域是hct -116来源的异种移植肿瘤的特征38。
我们得出结论，PHA-767491在多种临床前癌症模型和至少两种不同物种体内具有抗肿瘤活性。

将 20 ng 纯化的人 DDK 与浓度逐渐升高的 DDK 抑制剂预孵育 5 分钟。接下来，在含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT 的缓冲液中，加入 10 µCi (γ)-³²P ATP 和添加 1.5 µM 冷 ATP，并将混合物在 30°C 下孵育 30 分钟。蛋白质在 100°C 的 1X Laemmli 缓冲液中变性后，在 HyBlot CL 胶片上进行放射自显影并进行 SDS-PAGE。 DDK 的自磷酸化是其激酶活性的衡量标准。使用 ImageJ 对 ³²P 标记带进行定量，并使用 GraphPad 计算 IC50 值。

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体外激酶测定。[4]
该化合物对Cdc7和属于我们激酶选择性筛选（KSS）面板的37种其他激酶的效力是通过基于强阴离子交换剂（Dowex 1-X8树脂，甲酸酯形式）的测定或闪烁接近测定来确定的，如前所述25,26。用50 nM重组Cdk9/cyclin T在50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、3 μM Na3VO4、150 μM RNA聚合酶CDT肽和80 μM ATP中测定Cdk9活性。Cdk7实验在相同的缓冲液中进行，使用37 nM纯化激酶，存在200 μM ATP和10 μM髓鞘结合蛋白作为底物。
对于每种酶，首先确定ATP和特定底物的绝对Km值，然后在优化的ATP （2Km）和底物（5Km）浓度下运行每个实验。因为在这些条件下IC50 = 3βKi，这个设置可以直接比较整个KSS面板上PHA-767491的IC50值，以评估其生化选择性。

用于测定的96孔板的每个孔中铺有2500个细胞。 24小时后，细胞接受小分子抑制剂处理，然后在37°C下孵育72小时。接下来，细胞进行裂解，并采用 CellTiter-Glo 测定来量化 ATP 含量，作为代谢活跃细胞的标记。利用GraphPad软件确定IC50值。用于测定的六孔板中每孔铺有 100,000 个细胞。一天后将小分子抑制剂应用于细胞，然后培养不同的时间长度。将胰蛋白酶处理的细胞悬浮于 5 毫升磷酸盐缓冲盐水中。将 30 µL 该悬浮液与 30 µL CellTiter-Glo 试剂混合后，在室温下孵育 10 分钟。 EnVision 2104 多标签读板机和 BioTek Synergy Neo 酶标仪用于测量光度。

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细胞活力测定[3]
5×103 U87-MG和U251-MG细胞于处理前24 h接种于96孔板。第二天，用抑制剂（终浓度为10µM）、溶剂对照（水）或不处理细胞。72h后，细胞上加入10µl PrestoBlue细胞活力试剂，测定细胞活力。将溶剂控制的活力设为100%，计算相对细胞活力。实验至少重复了三次。

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细胞增殖试验[3]
将U87-MG和U251-MG细胞在添加1% FBS的培养基中保持24 h，然后将1 × 104个U87-MG和U251-MG细胞接种于96孔板中。第二天，用抑制剂（终浓度2.5或10µM）、溶剂对照（水）或不处理细胞。治疗72小时后，按照制造商的说明使用溴脱氧尿苷（BrdU）细胞增殖ELISA试剂盒。将溶剂对照处理的细胞增殖率设为100%，计算细胞的相对增殖率。

动物实验。[4]
将HCT-116结肠癌细胞系（购自ATCC）皮下移植到无胸腺小鼠体内。选择携带可触及肿瘤（100–200 mm3）的小鼠，并随机分为对照组和治疗组。随机分组后一天开始治疗。在HL-60研究中，雌性SCID小鼠皮下注射5×10⁶个白血病细胞。当肿瘤体积达到200-250 mm³时开始治疗。PHA-76749通常以20和30 mg/kg的剂量，每天两次，连续五天，通过静脉注射给药。每组包含8只动物。实验期间定期使用游标卡尺测量肿瘤大小，并按照文献¹所述方法计算肿瘤质量。肿瘤生长抑制率（TGI，%）根据以下公式计算：%TGI = 100 –（治疗组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量）* 100。本研究使用了7,12-二甲基苯并蒽（DMBA）及其溶剂芝麻油。 50日龄雌性Sprague-Dawley大鼠经胃管灌注单次剂量的20 mg DMBA（溶于1.0 ml芝麻油中）。约50天后，通过触诊检查动物。当发现至少一个直径为1 cm的乳腺肿瘤时，将大鼠依次分为两组，分别每日静脉注射10 mg/kg/天的PHA-76749或其溶剂。每组包含9只动物，并在实验期间使用游标卡尺测量18个（对照组）或17个（PHA-76749治疗组）原发肿瘤的体积。治疗组在治疗结束后一周内出现1例死亡。毒理学研究。 [4]
雄性Balb Nu/Nu小鼠连续5天，每天两次静脉注射30 mg/kg的PHA-76749。病理学家检查了胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、胸骨/骨髓、关节、胰腺、肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏、颌下腺、舌下腺、腮腺、颌下淋巴结、心脏、骨骼肌、垂体、脑、主动脉、睾丸、附睾、甲状腺、甲状旁腺、食管、气管、坐骨神经、膈肌、前列腺、精囊、脊髓、眼、泪腺和尾部组织。组织经石蜡包埋、切片后，用苏木精-伊红染色。对可能进行过格伦瓦尔德-吉姆萨染色的骨髓涂片检查。

溶于DMSO，并用生理盐水稀释；50 mg/kg;每日两次静脉或口服给药

皮下植入HL60细胞的雌性SCID小鼠、皮下植入HCT116细胞、A2780或Mx-1细胞的雄性Hsd小鼠、无胸腺nu-nu小鼠以及DMBA诱导乳腺癌的雌性Sprague-Dawley大鼠。

在一项毒理学研究中，PHA-767491 以 30 mg kg−1 的剂量每日两次给药，持续 5 天，未观察到任何临床症状或肉眼可见的病变。对从受试动物体内取出的 36 个不同器官进行组织病理学分析表明，睾丸出现萎缩迹象，骨髓中出现中度髓系增生，脾脏中出现轻微的淋巴细胞减少，这与报道的睾丸中 Cdc7 高表达水平10 以及 Cdc7 在高度增殖组织中的作用相一致。[4]

[1]. The potent Cdc7-Dbf4 (DDK) kinase inhibitor XL413 has limited activity in many cancer cell lines and discovery of potential new DDK inhibitor scaffolds. PLoS One. 2014 Nov 20;9(11):e113300.

[2]. Dual Inhibition of Cdc7 and Cdk9 by PHA-767491 Suppresses Hepatocarcinoma Synergistically with 5-Fluorouracil. Curr Cancer Drug Targets. 2015;15(3):196-204.

[3]. Cell division cycle 7-kinase inhibitor PHA-767491 hydrochloride suppresses glioblastoma growth and invasiveness. Cancer Cell Int. 2016 Nov 18;16:88.

[4]. A Cdc7 kinase inhibitor restricts initiation of DNA replication and has antitumor activity. Nat Chem Biol. 2008 Jun;4(6):357-65.

2-吡啶-4-基-1,5,6,7-四氢吡咯并[3,2-c]吡啶-4-酮是一种吡咯并吡啶类化合物。
PHA-767491 是一种 Cdc7/CDK9 抑制剂。

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Cdc7-Dbf4 激酶或 DDK（Dbf4 依赖性激酶）通过磷酸化并激活复制性 Mcm2-7 DNA 解旋酶来启动 DNA 复制。DDK 在许多肿瘤细胞中过表达，并且由于 DDK 抑制可导致多种癌细胞类型凋亡，但不会导致正常细胞凋亡，因此 DDK 已成为一种新兴的化疗靶点。PHA-767491 和 XL413 是多种强效 DDK 抑制剂中的两种，它们对纯化的激酶具有低纳摩尔级的 IC50 值。尽管 XL413 对 DDK 具有高度选择性，但其在细胞系中的活性尚未得到充分表征。我们测定了 XL413 对一系列肿瘤细胞系的抗增殖和促凋亡作用，并与活性已得到充分表征的 PHA-767491 进行了比较。两种化合物均为有效的 DDK 生化抑制剂，但令人惊讶的是，它们在不同细胞系中的活性差异很大。与 PHA-767491 不同，XL413 仅对所测试的十种细胞系中的一种表现出显著的抗增殖活性。由于 XL413 未能有效抑制多种细胞系中的 DDK，因此该化合物的生物利用度可能有限。为了寻找其他潜在的 DDK 抑制剂，我们还使用 DDK 热稳定性变化分析 (TSA) 测试了约 400 种已知激酶抑制剂与 DDK 的交叉反应性。我们鉴定出 11 种能够显著稳定 DDK 的化合物。其中一些化合物抑制 DDK 的效力与 PHA-767491 相当，包括 Chk1 和 PKR 激酶抑制剂，但它们的化学骨架与已知的 DDK 抑制剂截然不同。综上所述，这些数据表明，几种已知的激酶抑制剂与DDK存在交叉反应，同时也凸显了设计更多特异性、具有生物活性的DDK抑制剂作为化疗药物的契机。[1]

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检查点激酶1 (Chk1) 的激活是肝细胞癌 (HCC) 对5-氟尿嘧啶 (5-FU) 和其他抗代谢类药物产生化疗耐药性的关键因素。在本研究中，我们证实PHA-767491是一种双重抑制剂，可抑制两种细胞周期检查点激酶——细胞分裂周期激酶7 (Cdc7) 和细胞周期蛋白依赖性激酶9 (Cdk9)，它与5-FU具有协同抗肿瘤作用，可在体外和体内抑制人HCC细胞。与单独使用各药物相比，PHA-767491 与 5-FU 联合用药表现出更强的细胞毒性，并能显著诱导肝癌细胞凋亡，表现为 caspase 3 活化和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）片段化显著增加。PHA-767491 可直接拮抗 5-FU 诱导的 Chk1（Cdc7 的底物）磷酸化，并降低抗凋亡蛋白髓系白血病细胞 1（Cdk9 的下游靶点）的表达。在裸鼠肝癌异种移植瘤组织切片中，PHA-767491 的给药也降低了 Chk1 的磷酸化水平，并增加了原位细胞凋亡。我们的研究表明，PHA-767491可通过抑制Chk1磷酸化和下调Mcl1表达（通过抑制Cdc7和Cdk9）来增强5-FU的疗效，因此PHA-767491与5-FU联合用药可能对晚期和耐药性肝细胞癌（HCC）患者有益。[2]

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背景：基因组不稳定性是癌细胞的标志性特征，这种细胞现象可能由复制应激引起。可以利用复制应激，并以靶向方式增强其作用来对抗癌细胞。其中一种策略是靶向细胞分裂周期7相关蛋白激酶（CDC7），该蛋白在DNA复制起始调控中起着关键作用。CDC7在多种癌症中均存在过表达，而CDC7小分子抑制剂已被证实具有抗肿瘤作用。本研究旨在探讨CDC7抑制剂作为胶质母细胞瘤治疗新策略的潜力。方法：采用PHA-767491盐酸盐作为CDC7抑制剂。使用两种胶质母细胞瘤细胞系（U87-MG和U251-MG）以及一种对照细胞系（3T3）来表征CDC7抑制剂的作用。分析了CDC7抑制剂对细胞活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。此外，采用实时荧光定量PCR芯片鉴定CDC7抑制剂处理后差异表达的基因。结果：结果表明，CDC7抑制剂可降低胶质母细胞瘤细胞的活力，抑制细胞增殖，并诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡。此外，我们还发现CDC7抑制剂可抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭。为了鉴定 CDC7 抑制的分子靶点，我们使用了实时 PCR 芯片，结果显示多种 mRNA 和 miRNA 的表达失调。结论：综上所述，我们的研究结果表明 CDC7 抑制是治疗胶质母细胞瘤的一种有前景的策略。[3]

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Cdc7 是一种重要的激酶，它通过激活复制起点来促进 DNA 复制。在此，我们通过生化和细胞实验对强效 Cdc7 抑制剂 PHA-767491 (1) 进行了表征，并测试了其在啮齿动物中的抗肿瘤活性。我们发现该化合物能够阻断 DNA 合成，并影响复制 DNA 解旋酶在 Cdc7 依赖性磷酸化位点的磷酸化。与目前的 DNA 合成抑制剂不同，PHA-767491 能够阻止复制起点的激活，但不会阻碍复制叉的延伸，也不会引发持续的 DNA 损伤反应。 PHA-767491 治疗可导致多种癌细胞类型发生凋亡，并在临床前癌症模型中抑制肿瘤生长。据我们所知，PHA-767491 是第一个直接影响 DNA 复制起始而非延伸机制的分子，其活性表明 Cdc7 激酶抑制可能是一种开发抗癌疗法的新策略。[4]

C12H12CLN3O

249.696181297302

249.067

845538-12-7

11715766

Typically exists as solid at room temperature

2.175

61.27

3

2

1

17

275

0

Cl.O=C1C2C=C(C3C=CN=CC=3)NC=2CCN1

IMVNFURYBZMFDZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C12H11N3O.ClH/c16-12-9-7-11(8-1-4-13-5-2-8)15-10(9)3-6-14-12;/h1-2,4-5,7,15H,3,6H2,(H,14,16);1H

2-pyridin-4-yl-1,5,6,7-tetrahydropyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one;hydrochloride

PHA-767491 diHCl; 845714-00-3; PHA 767491; 2-pyridin-4-yl-1,5,6,7-tetrahydropyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one; 1,5,6,7-Tetrahydro-2-(4-pyridinyl)-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。