CDK9 (IC50 = 34 nM); CDK2 (IC50 = 240 nM); CDK1 (IC50 = 250 nM); CDK5 (IC50 = 460 nM); GSK3-β (IC50 = 220 nM); Mk2 (IC50 = 470 nM); Plk1 (IC50 = 980 nM); Chk2 (IC50 = 1100 nM)

体外活性：PHA-767491 对 Cdk1、Cdk2 和 GSK3-β 的选择性约为 20 倍，对 MK2 和 Cdk5 的选择性约为 50 倍，对 PLK1 和 CHK2 的选择性约为 100 倍。 PHA-767491 可抑制多种人类细胞系的细胞增殖，SF-268 的 IC50 为 0.86 μM，K562 的 IC50 为 5.87 μM，并且与 5-FU 或吉西他滨仅在少数细胞系中起作用。与目前的 DNA 合成抑制剂不同，5 μM 的 PHA-767491 处理会阻止 DNA 复制的启动，但不会阻止复制叉的进展，因为它对 Cdc7 激酶和 Cdc7 依赖性 Ser40 位点的 Mcm2 磷酸化有特异性抑制。 3 μM 的 PHA-767491 处理可显着降低 ABT-737 耐药性 OCI-LY1 和 SU-DHL-4 细胞中上调的 Mcl-1 水平，这可能是由于 Cdk9 的抑制，从而恢复对 ABT-737 敏感。当以 1 μM 浓度应用于静态慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 细胞时，通过类似的机制也观察到 PHA-767491 的直接线粒体依赖性促凋亡作用，EC50 为 0.34-0.97 μM。在 CD154 和 IL-4 刺激的 CLL 细胞增殖中，5 μM 的 PHA-767491 处理通过抑制 Cdc7 来消除 DNA 合成，而不是触发细胞死亡。激酶测定：PHA-767491 对 Cdc7 和 Cdk9 的抑制 (IC50) 使用基于强阴离子交换剂（Dowex 1-X8 树脂，甲酸盐形式）的测定来确定。对于每种酶，首先确定 ATP 和特定底物的绝对 Km 值，然后以优化的 ATP/33P-γ-ATP 混合物 (2Km) 和底物 (5Km) 浓度运行每次测定。 Cdc7 激酶测定在含有 50 mM Hepes pH 7.9、15 mM MgCl2、2 mM β-磷酸甘油、0.2 mg/mL BSA、1 mM DTT、3 μM Na3VO4、2Km ATP/33P-γ-ATP 混合物、5Km 的缓冲液中进行Mcm2 (aa 10-294)、37 nM 重组 Cdc7/Dbf4 和浓度不断增加的 PHA-767491，最终体积为 30 μL，并在 25 °C 下孵育 1 小时。使用 50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、3 μM Na3VO4、2Km ATP/33P-γ-ATP 混合物、5Km RNA 聚合酶 CDT 肽和增量溶液中的 50 nM 重组 Cdk9/cyclin T 进行 Cdk9 激酶测定。将 PHA-767491 浓缩至最终体积 30 μL，并在 25 °C 下孵育 1 小时。孵育后，加入 150 μL 树脂/甲酸盐 (pH 3.0) 以停止反应并捕获未反应的 33P-γ-ATP，将其与溶液中的磷酸化底物分离。静置 1 小时后，将 50 μL 上清液转移至 Optiplate 96 孔板中。添加 150 μL Microscint 40 后，在 TopCount 中对放射性进行计数。细胞测定：将细胞（HeLa、MCF7、HCT-116、U2OS、A2780、K562、SF-539、SF-268、Ovcar8、SW480、COLO205、HCT-15、Jurkat、PC3 和 NHDF）暴露于 PHA-767491 24 或 72 小时。将细胞裂解，并使用基于热稳定性萤火虫荧光素酶的测定法测定孔中的 ATP 含量（用作活细胞的测量值）。 caspase-3 和 caspase-7 的激活通过基于荧光素酶的测定（包含特定的发光底物）以处理的样品与未处理的对照之间的比率来测量。 DNA 复制是通过流式细胞术将核苷酸类似物 BrdU 掺入 DNA 来测量的。

PHA-767491 每天两次，持续 5 天，以剂量依赖性方式显着抑制 HL60 异种移植物的生长，剂量为 20 mg/kg 和 30 mg/kg 时，TGI 分别为 50% 和 92%。这也在 A2780、Mx-1 和 HCT-116 异种移植模型以及 DMBA 诱导的乳腺癌中被标记，并且与 Cdc7 抑制以及随后 Cdc7 依赖位点 Ser40 处 Mcm2 磷酸化的降低相关。

将 20 ng 纯化的人 DDK 与浓度逐渐升高的 DDK 抑制剂预孵育 5 分钟。接下来，在含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT 的缓冲液中，加入 10 µCi (γ)-³²P ATP 和添加 1.5 µM 冷 ATP，并将混合物在 30°C 下孵育 30 分钟。蛋白质在 100°C 的 1X Laemmli 缓冲液中变性后，在 HyBlot CL 胶片上进行放射自显影并进行 SDS-PAGE。 DDK 的自磷酸化是其激酶活性的衡量标准。使用 ImageJ 对 ³²P 标记带进行定量，并使用 GraphPad 计算 IC50 值。

用于测定的96孔板的每个孔中铺有2500个细胞。 24小时后，细胞接受小分子抑制剂处理，然后在37°C下孵育72小时。接下来，细胞进行裂解，并采用 CellTiter-Glo 测定来量化 ATP 含量，作为代谢活跃细胞的标记。利用GraphPad软件确定IC50值。用于测定的六孔板中每孔铺有 100,000 个细胞。一天后将小分子抑制剂应用于细胞，然后培养不同的时间长度。将胰蛋白酶处理的细胞悬浮于 5 毫升磷酸盐缓冲盐水中。将 30 µL 该悬浮液与 30 µL CellTiter-Glo 试剂混合后，在室温下孵育 10 分钟。 EnVision 2104 多标签读板机和 BioTek Synergy Neo 酶标仪用于测量光度。

[1]. The potent Cdc7-Dbf4 (DDK) kinase inhibitor XL413 has limited activity in many cancer cell lines and discovery of potential new DDK inhibitor scaffolds. PLoS One. 2014 Nov 20;9(11):e113300.

[2]. Dual Inhibition of Cdc7 and Cdk9 by PHA-767491 Suppresses Hepatocarcinoma Synergistically with 5-Fluorouracil. Curr Cancer Drug Targets. 2015;15(3):196-204.

[3]. Cell division cycle 7-kinase inhibitor PHA-767491 hydrochloride suppresses glioblastoma growth and invasiveness. Cancer Cell Int. 2016 Nov 18;16:88.

[4]. A Cdc7 kinase inhibitor restricts initiation of DNA replication and has antitumor activity. Nat Chem Biol. 2008 Jun;4(6):357-65.

C12H11N3O

249.7

213.09

C, 67.59; H, 5.20; N, 19.71; O, 7.50

845714-00-3

PHA-767491 hydrochloride;942425-68-5

Solid powder

C1CNC(=O)C2=C1NC(=C2)C3=CC=NC=C3

DKXHSOUZPMHNIZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C12H11N3O/c16-12-9-7-11(8-1-4-13-5-2-8)15-10(9)3-6-14-12/h1-2,4-5,7,15H,3,6H2,(H,14,16)

2-pyridin-4-yl-1,5,6,7-tetrahydropyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

1%DMSO+30% polyethylene glycol+1%Tween 80: 30mg/mL

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。