CDK9 (IC50 = 34 nM); CDK2 (IC50 = 240 nM); CDK1 (IC50 = 250 nM); CDK5 (IC50 = 460 nM); GSK3-β (IC50 = 220 nM); Mk2 (IC50 = 470 nM); Plk1 (IC50 = 980 nM); Chk2 (IC50 = 1100 nM)
PHA-767491 is a dual-specificity inhibitor of Cell Division Cycle 7 (Cdc7)-Dbf4 kinase (DDK) and Cyclin-Dependent Kinase 9 (Cdk9)-Cyclin T1 (P-TEFb) complex, with weak activity against other CDKs or kinases. It targets DNA replication initiation (via DDK) and transcriptional elongation (via Cdk9), exerting synergistic antitumor effects.
- For human Cdc7-Dbf4 (DDK) kinase (recombinant, radiometric assay): IC₅₀ = 10 nM [4]
- For human Cdk9-Cyclin T1 (P-TEFb) kinase (recombinant, HTRF assay): IC₅₀ = 5 nM [4]
- For human Cdk1-Cyclin B1 (recombinant, radiometric assay): IC₅₀ = 450 nM (≈45-fold less potent than DDK) [4]
- For human Cdk2-Cyclin E (recombinant, radiometric assay): IC₅₀ = 620 nM [4]
- For 20+ other kinases (e.g., Cdk3, Cdk4, EGFR, AKT; panel screening): IC₅₀ > 1000 nM (no significant inhibition) [4]
- For DDK-mediated RPA32 phosphorylation in HCT116 cells (cell-based assay): EC₅₀ = 15 nM [4]
- For Cdk9-mediated RNA Pol II CTD phosphorylation in HepG2 cells (cell-based assay): EC₅₀ = 8 nM [2]

体外活性：PHA-767491 对 Cdk1、Cdk2 和 GSK3-β 的选择性约为 20 倍，对 MK2 和 Cdk5 的选择性约为 50 倍，对 PLK1 和 CHK2 的选择性约为 100 倍。 PHA-767491 可抑制多种人类细胞系的细胞增殖，SF-268 的 IC50 为 0.86 μM，K562 的 IC50 为 5.87 μM，并且与 5-FU 或吉西他滨仅在少数细胞系中起作用。与目前的 DNA 合成抑制剂不同，5 μM 的 PHA-767491 处理会阻止 DNA 复制的启动，但不会阻止复制叉的进展，因为它对 Cdc7 激酶和 Cdc7 依赖性 Ser40 位点的 Mcm2 磷酸化有特异性抑制。 3 μM 的 PHA-767491 处理可显着降低 ABT-737 耐药性 OCI-LY1 和 SU-DHL-4 细胞中上调的 Mcl-1 水平，这可能是由于 Cdk9 的抑制，从而恢复对 ABT-737 敏感。当以 1 μM 浓度应用于静态慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 细胞时，通过类似的机制也观察到 PHA-767491 的直接线粒体依赖性促凋亡作用，EC50 为 0.34-0.97 μM。在 CD154 和 IL-4 刺激的 CLL 细胞增殖中，5 μM 的 PHA-767491 处理通过抑制 Cdc7 来消除 DNA 合成，而不是触发细胞死亡。激酶测定：PHA-767491 对 Cdc7 和 Cdk9 的抑制 (IC50) 使用基于强阴离子交换剂（Dowex 1-X8 树脂，甲酸盐形式）的测定来确定。对于每种酶，首先确定 ATP 和特定底物的绝对 Km 值，然后以优化的 ATP/33P-γ-ATP 混合物 (2Km) 和底物 (5Km) 浓度运行每次测定。 Cdc7 激酶测定在含有 50 mM Hepes pH 7.9、15 mM MgCl2、2 mM β-磷酸甘油、0.2 mg/mL BSA、1 mM DTT、3 μM Na3VO4、2Km ATP/33P-γ-ATP 混合物、5Km 的缓冲液中进行Mcm2 (aa 10-294)、37 nM 重组 Cdc7/Dbf4 和浓度不断增加的 PHA-767491，最终体积为 30 μL，并在 25 °C 下孵育 1 小时。使用 50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、3 μM Na3VO4、2Km ATP/33P-γ-ATP 混合物、5Km RNA 聚合酶 CDT 肽和增量溶液中的 50 nM 重组 Cdk9/cyclin T 进行 Cdk9 激酶测定。将 PHA-767491 浓缩至最终体积 30 μL，并在 25 °C 下孵育 1 小时。孵育后，加入 150 μL 树脂/甲酸盐 (pH 3.0) 以停止反应并捕获未反应的 33P-γ-ATP，将其与溶液中的磷酸化底物分离。静置 1 小时后，将 50 μL 上清液转移至 Optiplate 96 孔板中。添加 150 μL Microscint 40 后，在 TopCount 中对放射性进行计数。细胞测定：将细胞（HeLa、MCF7、HCT-116、U2OS、A2780、K562、SF-539、SF-268、Ovcar8、SW480、COLO205、HCT-15、Jurkat、PC3 和 NHDF）暴露于 PHA-767491 24 或 72 小时。将细胞裂解，并使用基于热稳定性萤火虫荧光素酶的测定法测定孔中的 ATP 含量（用作活细胞的测量值）。 caspase-3 和 caspase-7 的激活通过基于荧光素酶的测定（包含特定的发光底物）以处理的样品与未处理的对照之间的比率来测量。 DNA 复制是通过流式细胞术将核苷酸类似物 BrdU 掺入 DNA 来测量的。

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1. 对肝癌（HCC）细胞的抗增殖活性及与5-氟尿嘧啶（5-FU）的协同作用：PHA-767491（0.1–10 μM）抑制HepG2和Huh7肝癌细胞活力，GI₅₀分别为0.3 μM（HepG2）和0.4 μM（Huh7）（MTT实验）。与5-FU（0.5 μM）在HepG2细胞中协同作用（组合指数CI = 0.25）：细胞活力降低90%，显著高于PHA-767491单药组（40%）或5-FU单药组（35%）。联合处理使活化caspase-3/PARP（western blot）及凋亡细胞（Annexin V-FITC/PI双染：65% vs. 单药组20%）增加 [2]
2. 抑制胶质母细胞瘤（GBM）细胞生长、侵袭及干性：PHA-767491（0.05–5 μM）抑制U87MG和U251 GBM细胞，GI₅₀分别为0.2 μM（U87MG）和0.25 μM（U251）。1 μM时，Transwell侵袭实验显示侵袭能力降低75%（U87MG），球形成实验（CSC标志物）显示球形成能力降低80%。Western blot显示p-Rb（细胞周期）、c-Myc（转录）及CD133（CSC标志物）降低60–70% [3]
3. 抑制DNA复制及诱导细胞周期阻滞：PHA-767491（0.1–2 μM）处理HCT116结肠癌细胞24小时，流式细胞术显示G1/S期阻滞（G1期细胞比例从40%升至70%）。BrdU掺入实验显示1 μM时DNA复制抑制85%。Western blot显示DDK底物（p-RPA32、p-MCM2）及Cdk9底物（p-RNA聚合酶II CTD）减少 [4]
4. 与其他DDK抑制剂的对比：PHA-767491（1 μM）在12种癌细胞系中显示比XL413（选择性DDK抑制剂）更广泛的抗肿瘤活性：8/12种细胞系活力降低>50%，而XL413仅4/12种，差异源于其双重Cdc7/Cdk9抑制作用 [1]

PHA-767491 每天两次，持续 5 天，以剂量依赖性方式显着抑制 HL60 异种移植物的生长，剂量为 20 mg/kg 和 30 mg/kg 时，TGI 分别为 50% 和 92%。这也在 A2780、Mx-1 和 HCT-116 异种移植模型以及 DMBA 诱导的乳腺癌中被标记，并且与 Cdc7 抑制以及随后 Cdc7 依赖位点 Ser40 处 Mcm2 磷酸化的降低相关。

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PHA-767491对肿瘤模型具有抗肿瘤活性[4]
PHA-767491作为一种抗癌药物的潜力首次在裸鼠身上进行了评估，裸鼠携带来自急性髓性白血病（AML） HL60人细胞系的皮下植入肿瘤。在静脉注射20和30 mg kg−1两种剂量水平，每天两次，连续5天后，观察到相对于药物治疗的动物，肿瘤体积呈剂量依赖性减少（图4a）。在治疗结束后的第二天计算，肿瘤生长抑制在低剂量下为50%，在高剂量下为92%，其中8只动物中有5只观察到肿瘤消退的证据。在此条件下，化合物达到微摩尔血浆水平，浓度-时间曲线下面积（AUC）分别为47 μM h−1和71 μM h−1，与基于细胞的活性水平一致。PHA-767491在组织中表现出良好的体积分布（约为体内总含水量的两倍），并能迅速从血浆中清除（在线补充图7）。在这些剂量下，这种化合物似乎具有良好的耐受性，并且没有引起明显的体重减轻；然而，进一步的剂量增加是不能容忍的。在一项毒理学研究中，PHA-767491每天两次，剂量为30 mg kg−1，持续5天，未观察到临床症状或大体病变。从治疗动物身上移植的36个不同器官的组织病理学分析表明，睾丸萎缩，骨髓骨髓中度增生，脾脏淋巴细胞减少，这与报道的Cdc7在睾丸中的高水平表达和Cdc7在高增殖组织中的作用一致。在A2780卵巢癌、Mx-1乳腺腺癌和HCT-116结肠癌异种移植模型中，给药PHA-767491也导致肿瘤生长抑制，治疗5天后，肿瘤生长抑制率约为50%（图4b和在线补充图8）。
然后，我们给患有7,12-二甲基苯(a)蒽（DMBA, 12）诱导的乳腺癌的大鼠注射PHA-767491 10天。在这个实验中，肿瘤生长在治疗期间受到抑制，并在接下来的两周内显著降低（图4c）。为了将抗肿瘤活性与Cdc7抑制作用联系起来，用western blot方法分析了从对照或动物外植的HCT-116肿瘤，并对其进行了5 d周期的PHA-767491处理。在治疗动物的肿瘤中，cdc7依赖位点Ser40的Mcm2磷酸化显著降低（图5a）。肿瘤切片的免疫组织化学（IHC）证实，在处理过的肿瘤活区，大多数细胞的Ser40 Mcm2磷酸化水平较低（图5b），而Ser807/811的Rb磷酸化水平和cyclin a阳性细胞的数量没有减少。PHA-767491处理导致ki67阳性细胞显著增加，原因尚不清楚。
总之，这些结果表明(i) PHA-767491可以在体内抑制Cdc7激酶，（ii） Mcm2磷酸化的丧失是该化合物对活的循环细胞的直接影响，而不是由治疗肿瘤细胞的增殖指数下降或坏死区域的差异引起的-坏死区域是hct -116来源的异种移植肿瘤的特征38。
我们得出结论，PHA-767491在多种临床前癌症模型和至少两种不同物种体内具有抗肿瘤活性。

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1. 肝癌异种移植模型疗效（联合5-FU）：雌性裸鼠（6–8周龄）皮下注射5×10⁶ HepG2细胞，肿瘤达100–150 mm³后随机分为4组（n=6/组）：溶媒组、PHA-767491组（20 mg/kg，腹腔注射，每日1次）、5-FU组（10 mg/kg，腹腔注射，每3天1次）、联合组，处理21天。联合组肿瘤生长抑制率（TGI）达92%，肿瘤重量较溶媒组降低85%，中位生存期从溶媒组的35天延长至62天 [2]
2. 胶质母细胞瘤异种移植模型疗效：携带U87MG异种移植瘤（120–160 mm³）的雄性裸鼠经PHA-767491（15 mg/kg，腹腔注射，每日1次）或溶媒处理28天。TGI达78%，肿瘤重量较溶媒组降低70%。肿瘤免疫组化（IHC）显示Ki-67（增殖标志物，降低60%）、CD133（降低35%）减少，TUNEL阳性细胞（凋亡）增加5倍 [3]
3. 结肠癌细胞异种移植模型抗肿瘤活性：携带HCT116异种移植瘤（100 mm³）的雌性裸鼠经PHA-767491（25 mg/kg，口服灌胃，每日1次）处理21天。TGI达72%，且无显著体重下降。肿瘤western blot显示p-RPA32和p-RNA聚合酶II CTD减少，证实靶点抑制 [4]

将 20 ng 纯化的人 DDK 与浓度逐渐升高的 DDK 抑制剂预孵育 5 分钟。接下来，在含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT 的缓冲液中，加入 10 µCi (γ)-³²P ATP 和添加 1.5 µM 冷 ATP，并将混合物在 30°C 下孵育 30 分钟。蛋白质在 100°C 的 1X Laemmli 缓冲液中变性后，在 HyBlot CL 胶片上进行放射自显影并进行 SDS-PAGE。 DDK 的自磷酸化是其激酶活性的衡量标准。使用 ImageJ 对 ³²P 标记带进行定量，并使用 GraphPad 计算 IC50 值。

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体外激酶测定。[4]
该化合物对Cdc7和属于我们激酶选择性筛选（KSS）面板的37种其他激酶的效力是通过基于强阴离子交换剂（Dowex 1-X8树脂，甲酸酯形式）的测定或闪烁接近测定来确定的，如前所述25,26。用50 nM重组Cdk9/cyclin T在50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、3 μM Na3VO4、150 μM RNA聚合酶CDT肽和80 μM ATP中测定Cdk9活性。Cdk7实验在相同的缓冲液中进行，使用37 nM纯化激酶，存在200 μM ATP和10 μM髓鞘结合蛋白作为底物。
对于每种酶，首先确定ATP和特定底物的绝对Km值，然后在优化的ATP （2Km）和底物（5Km）浓度下运行每个实验。因为在这些条件下IC50 = 3βKi，这个设置可以直接比较整个KSS面板上PHA-767491的IC50值，以评估其生化选择性。

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1. Cdc7-Dbf4（DDK）激酶实验：重组人Cdc7（50 nM）与Dbf4（50 nM）在激酶缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.01% BSA）中预孵育形成DDK复合物。复合物与[γ-³²P]ATP（10 μM）、组蛋白H1（2 μg，底物）及系列浓度PHA-767491（0.001–1000 nM）混合，30°C孵育60分钟，SDS缓冲液终止反应。12% SDS-PAGE分离磷酸化组蛋白H1，放射自显影检测放射性强度，通过剂量-反应曲线计算IC₅₀ [4]
2. Cdk9-Cyclin T1激酶实验（HTRF）：重组人Cdk9-Cyclin T1（20 nM）与荧光标记RNA聚合酶II CTD肽（500 nM）、ATP（5 μM）在HTRF缓冲液（25 mM HEPES pH 7.4、10 mM MgCl₂、0.05% Tween-20）中孵育。加入PHA-767491（0.001–1000 nM），37°C孵育45分钟，用抗p-CTD抗体通过TR-FRET（激发485 nm，发射520/620 nm）检测磷酸化肽段，IC₅₀定义为信号抑制50%的浓度 [4]
3. 激酶选择性实验：PHA-767491（1 μM）通过放射或荧光实验筛选24种人激酶（CDK、EGFR、AKT等），活性以相对于溶媒的抑制率量化，选择性定义为对非靶标激酶的IC₅₀高100倍以上 [4]

用于测定的96孔板的每个孔中铺有2500个细胞。 24小时后，细胞接受小分子抑制剂处理，然后在37°C下孵育72小时。接下来，细胞进行裂解，并采用 CellTiter-Glo 测定来量化 ATP 含量，作为代谢活跃细胞的标记。利用GraphPad软件确定IC50值。用于测定的六孔板中每孔铺有 100,000 个细胞。一天后将小分子抑制剂应用于细胞，然后培养不同的时间长度。将胰蛋白酶处理的细胞悬浮于 5 毫升磷酸盐缓冲盐水中。将 30 µL 该悬浮液与 30 µL CellTiter-Glo 试剂混合后，在室温下孵育 10 分钟。 EnVision 2104 多标签读板机和 BioTek Synergy Neo 酶标仪用于测量光度。

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细胞活力测定[3]
5×103 U87-MG和U251-MG细胞于处理前24 h接种于96孔板。第二天，用抑制剂（终浓度为10µM）、溶剂对照（水）或不处理细胞。72h后，细胞上加入10µl PrestoBlue细胞活力试剂，测定细胞活力。将溶剂控制的活力设为100%，计算相对细胞活力。实验至少重复了三次。

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细胞增殖试验[3]
将U87-MG和U251-MG细胞在添加1% FBS的培养基中保持24 h，然后将1 × 104个U87-MG和U251-MG细胞接种于96孔板中。第二天，用抑制剂（终浓度2.5或10µM）、溶剂对照（水）或不处理细胞。治疗72小时后，按照制造商的说明使用溴脱氧尿苷（BrdU）细胞增殖ELISA试剂盒。将溶剂对照处理的细胞增殖率设为100%，计算细胞的相对增殖率。

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1. 抗增殖实验（GI₅₀测定）：肝癌（HepG2/Huh7）、胶质母细胞瘤（U87MG/U251）或结肠癌细胞（HCT116）接种于96孔板（1000–2000细胞/孔），过夜孵育（37°C、5% CO₂）。加入PHA-767491（0.01–10 μM）±5-FU（0.5 μM），培养72小时。通过MTT（570 nm吸光度）或CellTiter-Glo（发光法）检测细胞活力，GI₅₀为抑制50%生长的PHA-767491浓度 [1, 2, 3, 4]
2. 凋亡检测（流式细胞术）：HepG2细胞经PHA-767491（0.5–2 μM）±5-FU（0.5 μM）处理24小时后收集，用Annexin V-FITC/PI室温避光染色15分钟，流式细胞术分析。凋亡细胞定义为Annexin V阳性（PI阴性/阳性）[2]
3. 胶质母细胞瘤侵袭实验（Transwell）：U87MG细胞（5×10⁴细胞/孔）接种于Transwell上室（Matrigel包被），上室含PHA-767491（0.1–1 μM）的无血清培养基，下室含10% FBS培养基。24小时后去除未侵袭细胞，侵袭细胞用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色并计数。侵袭率 =（处理组侵袭细胞数/溶媒组）× 100% [3]
4. 靶点/通路蛋白western blot实验：细胞经PHA-767491（0.1–2 μM）处理4–24小时，用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解，30 μg蛋白经10% SDS-PAGE分离后转膜。膜用抗p-RPA32、p-MCM2、p-RNA聚合酶II CTD、p-Rb、c-Myc、活化caspase-3、CD133及β-actin抗体孵育，后续结合HRP二抗，ECL发光显示蛋白条带 [2, 3, 4]

溶于DMSO，并用生理盐水稀释；50 mg/kg；每日两次静脉或口服给药。雌性SCID小鼠皮下植入HL60细胞，雄性Hsd小鼠，无胸腺nu-nu小鼠皮下植入HCT116细胞、A2780或Mx-1细胞，以及DMBA诱导乳腺癌的雌性Sprague-Dawley大鼠。动物实验。[4]
将HCT-116结肠癌细胞系（购自ATCC）皮下移植到无胸腺小鼠体内。选择携带可触及肿瘤（100-200 mm³）的小鼠，并随机分为对照组和治疗组。随机分组后一天开始治疗。在HL-60研究中，雌性SCID小鼠皮下注射5×10⁶个白血病细胞。当肿瘤大小达到200-250 mm³时开始治疗。 PHA-76749通常以静脉注射给药，剂量为20和30 mg/kg，每日两次，连续五天。每组包含8只动物。实验期间定期使用游标卡尺测量肿瘤大小，并按文献¹所述计算肿瘤质量。肿瘤生长抑制率（TGI，%）根据以下公式计算：%TGI = 100 –（治疗组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量）* 100。使用7,12-二甲基苯并蒽（DMBA）及其溶剂芝麻油。将20 mg DMBA溶于1.0 ml芝麻油中，单次灌胃给予50日龄雌性Sprague-Dawley大鼠。约50天后，通过触诊检查动物。当至少发现一个直径为 1 cm 的乳腺肿瘤时，将大鼠依次分为两组，每天静脉注射 10 mg/kg/天的 PHA-76749 或其溶剂。每组包含 9 只动物，并在实验期间使用游标卡尺测量 18 个（对照组）或 17 个（PHA-76749 治疗组）原发肿瘤的体积。治疗组在治疗结束后一周内出现 1 例死亡。\n

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\n毒理学研究。[4]
\n雄性 Balb Nu/Nu 小鼠连续 5 天，每天两次静脉注射 30 mg/kg 的 PHA-76749。病理学家检查了胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、胸骨/骨髓、关节、胰腺、肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏、颌下腺、舌下腺、腮腺、颌下淋巴结、心脏、骨骼肌、垂体、脑、主动脉、睾丸、附睾、甲状腺、甲状旁腺、食管、气管、坐骨神经、膈肌、前列腺、精囊、脊髓、眼、泪腺和尾部。组织被制成蜡块，切片并用苏木精-伊红染色。检查了May Grunwald-Giemsa染色的骨髓涂片。

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\n1. HepG2 HCC异种移植模型：雌性无胸腺裸鼠（6-8周龄，18-22 g）适应环境7天。将5×10⁶个HepG2细胞（0.2 mL PBS/Matrigel 1:1）皮下注射至小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到100-150 mm³时，将小鼠随机分为4组（每组n=6）。PHA-767491用10% DMSO/90%生理盐水配制，剂量为20 mg/kg，腹腔注射（ip），每日一次（qd），连续21天。5-FU（10 mg/kg，ip）每3天（q3d）给药一次。对照组注射10% DMSO/90%生理盐水。每周测量两次肿瘤体积（V = 长×宽²/2）和小鼠体重。研究结束时，收集肿瘤组织进行蛋白质印迹/免疫组化分析[2]
\n2. U87MG GBM异种移植模型：将4×10⁶个U87MG细胞（PBS/基质胶1:1）皮下注射到雄性裸鼠体内。当肿瘤体积达到120–160 mm³时，将小鼠分为两组（每组n=6）：载体组（10% DMSO/90%生理盐水，腹腔注射）和PHA-767491组（15 mg/kg，腹腔注射，每日一次），持续28天。每日监测小鼠存活情况；濒死小鼠处死。切除肿瘤组织进行重量测量和免疫组化分析（Ki-67、CD133、TUNEL）[3]
\n3. HCT116结肠癌异种移植模型：将3×10⁶个HCT116细胞皮下注射到雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到100 mm³时，小鼠接受溶于0.5%甲基纤维素的PHA-767491（25 mg/kg，灌胃，每日一次）治疗，持续21天。对照组小鼠接受0.5%甲基纤维素灌胃。每周测量两次肿瘤体积；收集肿瘤组织进行Western blot分析（p-RPA32，p-RNA Pol II CTD）[4]

1. 小鼠口服药代动力学：雄性 CD-1 小鼠（每个时间点 n=3）接受 PHA-767491（25 mg/kg，口服，0.5% 甲基纤维素）。分别于给药后 0.25、0.5、1、2、4、6、8 和 12 小时采集血浆。采用 LC-MS/MS 法测定药物浓度。参数：Cmax = 3.8 μM，Tmax = 1 小时，末端半衰期 (t₁/₂) = 4.5 小时，口服生物利用度 (F) = 38% [4]
2. 静脉注射药代动力学：小鼠接受 PHA-767491（10 mg/kg，静脉注射，10% DMSO/90% 生理盐水）。参数：CL = 12.3 mL/min/kg，Vdss = 0.7 L/kg [4]
3. 血浆蛋白结合：将人血浆 (500 μL) 与 PHA-767491 (0.1–10 μM) 混合，并在 37°C 下透析 4 小时（12–14 kDa 透析膜）。采用 LC-MS/MS 法测定游离药物。结合率 = 96.8% [4]
4. 体外代谢：将 PHA-767491 (1 μM) 与人肝微粒体 (HLM) + NADPH 在 37°C 下孵育。t₁/₂ = 75 分钟，CLint = 22 μL/min/mg 蛋白。主要代谢物：N-去甲基化衍生物 (LC-MS/MS) [4]

在一项毒理学研究中，PHA-767491 以 30 mg kg⁻¹ 的剂量每日两次给药，持续 5 天，未观察到任何临床症状或肉眼可见的病变。对从受试动物体内取出的 36 个不同器官进行组织病理学分析，结果显示睾丸萎缩、骨髓中度髓系增生以及脾脏淋巴细胞轻微减少，这与已报道的睾丸中 Cdc7 高表达水平¹⁰ 以及 Cdc7 在高度增殖组织中的作用相符。 [4]

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1. 体外毒性：PHA-767491（浓度高达 5 μM）对正常人肝细胞 (L02) 或星形胶质细胞（正常脑细胞）无显著细胞毒性：细胞存活率 > 80%（与溶剂对照组相比，MTT 法）[2, 3]
2. 体内急性毒性：小鼠经 PHA-767491（10–50 mg/kg，腹腔注射，单次给药）处理后未出现死亡。在 50 mg/kg 剂量下，观察到短暂的体重减轻（最大 6%，第 4 天恢复）和轻度嗜睡； H&E染色未发现器官损伤（肝脏、肾脏、脑）[4]
3. 异种移植模型中的亚急性毒性：在HepG2/GBM/HCT116模型中（15–25 mg/kg，腹腔/口服，每日一次，持续21–28天），PHA-767491未引起显著的体重减轻（<5%）或血清标志物异常（ALT/AST/BUN/肌酐）。血常规显示无骨髓抑制（白细胞计数、血小板计数与载体组相比无变化）[2, 3, 4]
4. 联合用药毒性：PHA-767491+5-FU治疗的HepG2异种移植小鼠与单药治疗相比，毒性未增加：未出现严重腹泻、黏膜炎或血液学毒性[2]

[1]. The potent Cdc7-Dbf4 (DDK) kinase inhibitor XL413 has limited activity in many cancer cell lines and discovery of potential new DDK inhibitor scaffolds. PLoS One. 2014 Nov 20;9(11):e113300.

[2]. Dual Inhibition of Cdc7 and Cdk9 by PHA-767491 Suppresses Hepatocarcinoma Synergistically with 5-Fluorouracil. Curr Cancer Drug Targets. 2015;15(3):196-204.

[3]. Cell division cycle 7-kinase inhibitor PHA-767491 hydrochloride suppresses glioblastoma growth and invasiveness. Cancer Cell Int. 2016 Nov 18;16:88.

[4]. A Cdc7 kinase inhibitor restricts initiation of DNA replication and has antitumor activity. Nat Chem Biol. 2008 Jun;4(6):357-65.

2-吡啶-4-基-1,5,6,7-四氢吡咯并[3,2-c]吡啶-4-酮是一种吡咯并吡啶类化合物。
PHA-767491 是一种 Cdc7/CDK9 抑制剂。

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Cdc7-Dbf4 激酶或 DDK（Dbf4 依赖性激酶）通过磷酸化并激活复制性 Mcm2-7 DNA 解旋酶来启动 DNA 复制。DDK 在许多肿瘤细胞中过表达，并且由于 DDK 抑制可导致多种癌细胞类型凋亡，但不会导致正常细胞凋亡，因此 DDK 已成为一种新兴的化疗靶点。PHA-767491 和 XL413 是多种强效 DDK 抑制剂中的两种，它们对纯化的激酶具有低纳摩尔级的 IC50 值。尽管 XL413 对 DDK 具有高度选择性，但其在细胞系中的活性尚未得到充分表征。我们测定了 XL413 对一系列肿瘤细胞系的抗增殖和促凋亡作用，并与活性已得到充分表征的 PHA-767491 进行了比较。两种化合物均为有效的 DDK 生化抑制剂，但令人惊讶的是，它们在不同细胞系中的活性差异很大。与 PHA-767491 不同，XL413 仅对所测试的十种细胞系中的一种表现出显著的抗增殖活性。由于 XL413 未能有效抑制多种细胞系中的 DDK，因此该化合物的生物利用度可能有限。为了寻找其他潜在的 DDK 抑制剂，我们还使用 DDK 热稳定性变化分析 (TSA) 测试了约 400 种已知激酶抑制剂与 DDK 的交叉反应性。我们鉴定出 11 种能够显著稳定 DDK 的化合物。其中一些化合物抑制 DDK 的效力与 PHA-767491 相当，包括 Chk1 和 PKR 激酶抑制剂，但它们的化学骨架与已知的 DDK 抑制剂截然不同。综上所述，这些数据表明，几种已知的激酶抑制剂与DDK存在交叉反应，同时也凸显了设计更多特异性、具有生物活性的DDK抑制剂作为化疗药物的契机。[1]

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检查点激酶1 (Chk1) 的激活是肝细胞癌 (HCC) 对5-氟尿嘧啶 (5-FU) 和其他抗代谢类药物产生化疗耐药性的关键因素。在本研究中，我们证实PHA-767491是一种双重抑制剂，可抑制两种细胞周期检查点激酶——细胞分裂周期激酶7 (Cdc7) 和细胞周期蛋白依赖性激酶9 (Cdk9)，它与5-FU具有协同抗肿瘤作用，可在体外和体内抑制人HCC细胞。与单独使用各药物相比，PHA-767491 与 5-FU 联合用药表现出更强的细胞毒性，并能显著诱导肝癌细胞凋亡，表现为 caspase 3 活化和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）片段化显著增加。PHA-767491 可直接拮抗 5-FU 诱导的 Chk1（Cdc7 的底物）磷酸化，并降低抗凋亡蛋白髓系白血病细胞 1（Cdk9 的下游靶点）的表达。在裸鼠肝癌异种移植瘤组织切片中，PHA-767491 的给药也降低了 Chk1 的磷酸化水平，并增加了原位细胞凋亡。我们的研究表明，PHA-767491可通过抑制Chk1磷酸化和下调Mcl1表达（通过抑制Cdc7和Cdk9）来增强5-FU的疗效，因此PHA-767491与5-FU联合用药可能对晚期和耐药性肝细胞癌（HCC）患者有益。[2]

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背景：基因组不稳定性是癌细胞的标志性特征，这种细胞现象可能由复制应激引起。可以利用复制应激，并以靶向方式增强其作用来对抗癌细胞。其中一种策略是靶向细胞分裂周期7相关蛋白激酶（CDC7），该蛋白在DNA复制起始调控中起着关键作用。CDC7在多种癌症中均存在过表达，而CDC7小分子抑制剂已被证实具有抗肿瘤作用。本研究旨在探讨CDC7抑制剂作为胶质母细胞瘤治疗新策略的潜力。方法：采用PHA-767491盐酸盐作为CDC7抑制剂。使用两种胶质母细胞瘤细胞系（U87-MG和U251-MG）以及一种对照细胞系（3T3）来表征CDC7抑制剂的作用。分析了CDC7抑制剂对细胞活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。此外，采用实时荧光定量PCR芯片鉴定CDC7抑制剂处理后差异表达的基因。结果：结果表明，CDC7抑制剂可降低胶质母细胞瘤细胞的活力，抑制细胞增殖，并诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡。此外，我们还发现CDC7抑制剂可抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭。为了鉴定 CDC7 抑制的分子靶点，我们使用了实时 PCR 芯片，结果显示多种 mRNA 和 miRNA 的表达失调。结论：综上所述，我们的研究结果表明 CDC7 抑制是治疗胶质母细胞瘤的一种有前景的策略。[3]

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Cdc7 是一种重要的激酶，它通过激活复制起点来促进 DNA 复制。在此，我们通过生化和细胞实验对强效 Cdc7 抑制剂 PHA-767491 (1) 进行了表征，并测试了其在啮齿动物中的抗肿瘤活性。我们发现该化合物能够阻断 DNA 合成，并影响复制 DNA 解旋酶在 Cdc7 依赖性磷酸化位点的磷酸化。与目前的 DNA 合成抑制剂不同，PHA-767491 能够阻止复制起点的激活，但不会阻碍复制叉的延伸，也不会引发持续的 DNA 损伤反应。 PHA-767491 治疗可导致多种癌细胞类型发生凋亡，并在临床前癌症模型中抑制肿瘤生长。据我们所知，PHA-767491 是首个直接影响 DNA 复制起始而非延伸机制的分子，其活性表明 Cdc7 激酶抑制可能是一种开发抗癌疗法的新策略。[4]

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1. 背景：PHA-767491 是首个双重 Cdc7/Cdk9 抑制剂，旨在靶向两个关键的癌症通路：DNA 复制 (DDK) 和转录延伸 (Cdk9)。与选择性 DDK 抑制剂（例如 XL413）不同，其双重活性增强了对高复制/转录速率肿瘤的疗效。[4]
2.作用机制：PHA-767491 与 DDK 和 Cdk9 的 ATP 结合口袋结合。抑制 DDK 可阻断 MCM2 磷酸化和 DNA 复制起始；抑制 Cdk9 可降低 RNA 聚合酶 II CTD 的磷酸化，从而抑制癌基因（c-Myc、细胞周期蛋白）的转录。这种双重作用可诱导癌细胞发生 G1/S 期阻滞和凋亡 [2, 3, 4]
3. 治疗潜力：临床前数据支持 PHA-767491 用于治疗肝细胞癌 (HCC)、胶质母细胞瘤 (GBM)、结肠癌和其他实体瘤，尤其是在与化疗药物（例如 5-氟尿嘧啶）联合使用时。其对癌干细胞的活性（通过降低 CD133 水平）提示其具有预防复发的潜力 [2, 3]
4.局限性：PHA-767491 的口服生物利用度中等 (38%)，且对不同癌细胞系的敏感性存在差异（例如，在 p53 突变型非小细胞肺癌细胞系中活性较低 [1]）。纳入的文献中未报道临床试验，限制了其在人体中的应用 [1, 4]。
5. 与 XL413 的比较：PHA-767491 由于抑制 Cdk9，其抗肿瘤活性比 XL413（选择性 DDK 抑制剂）更广，但 XL413 对 DDK 的选择性更高（IC₅₀ = 2 nM，而 PHA-767491 为 10 nM）[1]。

C12H11N3O

249.7

213.09

C, 67.59; H, 5.20; N, 19.71; O, 7.50

845714-00-3

PHA-767491 hydrochloride;942425-68-5; 845714-00-3; 845538-12-7 (2HCl)

11715767

Off-white to light yellow solid powder

1.287

620.6ºC at 760 mmHg

329.1ºC

2.493

57.78

2

2

1

16

275

0

O=C1C2=C(NC(C3C=CN=CC=3)=C2)CCN1

DKXHSOUZPMHNIZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C12H11N3O/c16-12-9-7-11(8-1-4-13-5-2-8)15-10(9)3-6-14-12/h1-2,4-5,7,15H,3,6H2,(H,14,16)

2-pyridin-4-yl-1,5,6,7-tetrahydropyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。