DNA-PK (IC50 = 2 nM); p110α (IC50 = 5.8 nM); p110γ (IC50 = 76 nM); p110δ (IC50 = 510 nM); p110β (IC50 = 1.3 μM); hsVPS34 (IC50 = 2.6 μM); PI3KC2β (IC50 = 1 μM); PI3KC2α (IC50 = 10 μM); mTORC1 (IC50 = 1 μM); mTORC2 (IC50 = 10 μM); ATM (IC50 = 2.3 μM); ATR (IC50 = 21 μM); PI4KIIIβ (IC50 = 50 μM)
Class I PI3-K isoform p110α: The IC₅₀ value against p110α is less than 5 μM. When tested in vitro in the presence of 10 μM ATP, it can inhibit purified p110α, and the inhibition effect is reflected in the reduction of PI3-K activity associated with IRS-1 immunoprecipitates [1]
- NRF2: It can reduce the protein level and activity of NRF2, and regulate the expression of NRF2 target genes through proteasome-mediated degradation of NRF2 [3]

PIK-75 还抑制 p110δ、PI3KC2β、mTORC1、ATM、hsVPS34、PI3KC2α、mTORC2、ATR 和 PI4KIIIβ，IC50 为 510 nM、~1 μM、~1 μM、2.3 μM、2.6 μM、~10 μM、~10 μM、分别为 21 μM、~50 μM[1]。 PIK-75 单独抑制 Thr 308 的磷酸化，L6 肌管中的 IC50 为 1.2 M，3T3-L1 脂肪细胞中的 IC50 为 1.3 M[1]。 PIK-75（1–1000 nM；5 分钟）的 IC50 值为 78 nM，以剂量依赖性方式抑制 CHO-IR 细胞中胰岛素诱导的 PKB Ser473 和 Thr308 磷酸化。通过诱导胰腺癌细胞凋亡，PIK-75（0.1-1000 nM；48 小时）可阻止其生长和存活[3]。此外，当 PIK-75 (0.1–1000 nM) 存在时，胰腺癌 MIA PaCa-2 和 AsPC-1 细胞形成的集落较少[3]。

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1. PI3-K活性及胰岛素信号抑制作用：在3T3-L1脂肪细胞和L6肌管细胞中，PIK-75（0.05 μM）可抑制胰岛素刺激的与IRS-1免疫沉淀相关的PI3-K活性，还能降低这些细胞中胰岛素诱导的下游分子（如Akt的Thr 308位点、ERK1/2的p202/204位点、GSK3α/β的p21/9位点、rpS6的p235/236位点、4E-BP1的p37/46位点）的磷酸化水平。此外，它会减少胰岛素刺激的肌醇脂质水平，并抑制胰岛素诱导的³H-2-脱氧葡萄糖向脂肪细胞内的转运[1]
2. 对不同细胞系胰岛素信号的影响：在CHO-IR细胞、3T3-L1成纤维细胞和3T3-L1脂肪细胞中，PIK-75（100 nM）以剂量依赖的方式抑制胰岛素诱导的PKB（Ser ⁴⁷³和Thr ³⁰⁸位点）磷酸化。在HepG2肝癌细胞中，单独使用PIK-75抑制p110α不足以阻断胰岛素向PKB的信号传递，但与p110β或p110δ抑制剂联合使用时，可显著减弱胰岛素信号。在J774.2巨噬细胞中，PIK-75（50 nM）对胰岛素向PKB信号传递的抑制程度与p110β或p110δ抑制剂相近[2]
3. 对NRF2的抑制及对胰腺癌细胞的作用：在人胰腺癌细胞系（AsPC-1和MIA PaCa-2）中，PIK-75（0.1 μM）可降低NRF2的转录活性，表现为NRF2报告基因ARE-Luc的荧光素酶活性下降；还能降低NRF2靶基因（如HO-1、MRP5）的mRNA水平。蛋白质印迹分析显示，PIK-75以剂量依赖的方式降低NRF2蛋白水平。此外，PIK-75通过诱导凋亡性细胞死亡抑制胰腺癌细胞的增殖和存活：MTT实验表明，经不同浓度PIK-75处理48小时后，MIA PaCa-2和AsPC-1细胞的存活率下降；结晶紫染色显示细胞存活分数降低；蛋白质印迹可检测到凋亡标志物的激活。与吉西他滨联用时，PIK-75能增强吉西他滨的细胞毒性，降低吉西他滨诱导的NRF2水平和MRP5表达，增强吉西他滨诱导的凋亡性细胞死亡（表现为caspase-3/7活性升高及凋亡标志物表达增加），并降低胰腺癌细胞的存活率[3]

PIK-75 (2 mg/kg) 增强吉西他滨 (20 mg/kg) 的体内抗癌活性。单独使用吉西他滨 (20 mg/kg) 或 PIK-75 (2 mg/kg) 均能显着减缓肿瘤生长。 PIK-75 和吉西他滨的组合显然具有积极作用，因为它显着减缓体内肿瘤的生长，同时对小鼠的体重没有负面影响[3]。

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PIK-75增强吉西他滨的体内抗癌活性[3]
体内小鼠异种移植物模型进一步证明了PIK-75/吉西他滨组合的效果。携带MIA PaCa-2肿瘤的小鼠服用吉西他滨（20mg/kg）、PIK-75（2mg/kg）或两种药物的组合。由于PIK-75是一种可逆抑制剂，因此每周给药5次PIK-75以确保保持足够的抑制作用。吉西他滨每周给药两次。如图7A所示，吉西他滨或PIK-75对肿瘤生长的抑制程度相似。PIK-75/吉西他滨的有益作用是显而易见的，因为这种组合显著降低了体内肿瘤的生长，而不影响小鼠的体重（图7B）。

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1. 对小鼠胰岛素耐受性的影响：PIK-75可在体内阻断胰岛素治疗的急性效应。在胰岛素耐受性实验中，与胰岛素+药物载体组相比，胰岛素+PIK-75处理组小鼠的血糖水平发生变化，表明PIK-75抑制了胰岛素对糖代谢的作用[1]
2. 异种移植模型中的抗肿瘤作用：在MIA PaCa-2胰腺癌小鼠异种移植模型中，PIK-75与吉西他滨联合处理可增强吉西他滨的抗肿瘤效果。对肿瘤大小的测量显示，联合处理组的肿瘤生长速度显著慢于吉西他滨单独处理组或PIK-75单独处理组。对小鼠体重的监测发现，联合处理组与对照组相比无明显异常变化，提示其耐受性较好[3]

将 PI3K 抑制剂 PIK-75 以 10 mM 的浓度溶解在二甲亚砜中，并保存在 -20°C 下直至使用。 PI3K 酶活性在 50 μL 20 mM HEPES（pH 7.5）和含有 180 μM 磷脂酰肌醇的 5 mM MgCl2 中测定，反应通过添加 100 μM ATP（含有 2.5 μCi 的 [γ-32P]ATP）开始。室温孵育 30 分钟后，添加 50 μL 1 M HCl 终止酶反应。然后用 100 μL 氯仿/甲醇 [1:1 (v/v)] 和 250 μL 2 M KCl 提取磷脂，然后进行液体闪烁计数。将抑制剂稀释在 20% (v/v) 二甲基亚砜中，生成浓度与抑制酶活性的曲线，然后使用 Windows 版 Prism 5.00 版进行分析，计算 IC50。对于动力学分析，使用测量 ATP 消耗的发光测定法。 PI3K 酶活性在 50 μL 20 mM HEPES（pH 7.5）和 5 mM MgCl2 以及不同浓度的 PI 和 ATP 中测定。室温孵育 60 分钟后，加入 50 μL Kinase-Glo 终止反应，然后再孵育 15 分钟。然后使用 Fluostar 读板器读取发光。使用 Prism 分析结果。

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1. PI3-K活性测定实验：将纯化的I类PI3-K与不同浓度的PIK-75在10 μM ATP存在的条件下共同孵育，随后对反应混合物进行处理，检测PI3-K的活性。通过检测磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）或其他下游产物的生成量来确定酶活性，将PIK-75处理组与二甲基亚砜（DMSO）对照组的活性进行比较，计算PIK-75对PI3-K活性的抑制率，以此评估PIK-75对纯化的p110α、p110β等I类PI3-K亚型的抑制作用[1]
2. NRF2转录活性测定实验：将AsPC-1或MIA PaCa-2细胞转染NRF2报告基因ARE-Luc以及（若需要）pCDNA3或FLAG-NRF2。转染后，用PIK-75（0.1 μM或其他浓度）处理细胞一定时间（20小时或8小时）。之后裂解细胞，使用荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性，通过与未加PIK-75处理的对照组比较相对荧光素酶活性，评估PIK-75对NRF2转录活性的影响[3]
3. NRF2 DNA结合活性测定实验：提取转染pCDNA3或FLAG-NRF2并经不同浓度PIK-75处理24小时的AsPC-1细胞的核提取物，使用特定的检测试剂盒（如电泳迁移率变动分析试剂盒）检测核提取物中NRF2的DNA结合活性。分析NRF2与特定DNA序列（ARE）的结合情况，通过与对照组比较相对结合活性，确定PIK-75对NRF2 DNA结合活性的影响[3]

在使用或不使用抑制剂的 TGFβ 刺激 48 小时后，使用 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑 (MTT) 测定评估线粒体活性。将收获的洗涤细胞重悬于DMEM-10% FCS中并等分（500 μL）到24孔簇板中，然后一式两份连续稀释（1:2）。稀释细胞后，立即向每个孔中添加 100 μL 适当浓度的 MTT（溶解在 PBS 中，并在使用前通过 0.2 μm 过滤器过滤，以除去任何蓝色甲臜产物），然后在 37 °C 下孵育 3.5 小时。通过向每个孔中添加 500 μL 10% 十二烷基硫酸钠 (SDS) 的 0.01 M HCl 溶液，在 37 °C 下将所得蓝色甲臜产物溶解过夜（16 小时）。将每个重复孔中的样品 (150 μL) 转移至 96 孔微孔板，并通过自动分光光度法对照试剂空白（无细胞）测定光密度。在 570 nm 的测试波长和 690 nm 的参考波长下测量吸光度。对于每个原代细胞培养物，对每次处理的三到六个孔的结果进行平均，并且数据表示为 570 到 690 nm 的吸光度。细胞：A2780、A2780/cp70、2780AD、HCT116、HT29、WIL、CALU-3、MCF7、PC3 和 HS852 细胞。

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1. 胰岛素信号相关蛋白质印迹分析：将3T3-L1脂肪细胞、L6肌管细胞、CHO-IR细胞、3T3-L1成纤维细胞、HepG2细胞或J774.2细胞过夜饥饿处理。之后，用PIK-75（不同浓度，如0.05 μM、50 nM、100 nM）或DMSO处理细胞5分钟，再用胰岛素（1 nM、100 nM）刺激10分钟。裂解细胞，将裂解液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后将蛋白质转移到膜上，用针对磷酸化蛋白（如p-Akt Thr 308、p-PKB Ser ⁴⁷³、p-PKB Thr ³⁰⁸）及相应总蛋白的一抗孵育膜。洗涤后，用二抗孵育膜，通过化学发光试剂盒检测条带，对条带强度进行定量分析，以研究PIK-75对胰岛素信号的影响[1][2]
2. 脂肪细胞葡萄糖转运实验：将3T3-L1脂肪细胞饥饿处理后，用PIK-75或其他试剂处理。随后加入胰岛素刺激葡萄糖转运，再向细胞中加入³H-2-脱氧葡萄糖，孵育一定时间后，洗涤细胞以去除未结合的³H-2-脱氧葡萄糖。使用闪烁计数器测量细胞内的放射性，确定转运到细胞内的葡萄糖量，从而评估PIK-75对胰岛素刺激的葡萄糖转运的影响[1]
3. 细胞存活率实验（MTT实验）：将MIA PaCa-2和AsPC-1胰腺癌细胞接种到96孔板中，贴壁后，用不同浓度的PIK-75单独或与吉西他滨联合处理细胞48小时。之后向每孔加入MTT溶液，孵育一定时间，溶解形成的甲臜结晶，用酶标仪在特定波长下测量吸光度。根据吸光度值计算细胞存活率，分析PIK-75对细胞存活率的影响[3]
4. siRNA转染及相关实验：使用转染试剂将NRF2 siRNA或对照siRNA转染到AsPC-1细胞中。转染后，用吉西他滨处理细胞48小时，通过台盼蓝染色法或MTT实验确定细胞存活率。此外，对转染细胞的裂解液进行蛋白质印迹分析，检测NRF2蛋白水平；提取总RNA制备cDNA，通过RT-PCR或qRT-PCR检测NRF2及其靶基因的mRNA水平[3]
5. Caspase-3/7活性实验：用PIK-75、吉西他滨或二者联合处理MIA PaCa-2细胞12小时，裂解细胞后，使用caspase活性检测试剂盒测量裂解液中caspase-3/7的活性。检测荧光强度，计算相对caspase-3/7活性，以评估PIK-75对吉西他滨诱导的凋亡性细胞死亡的影响[3]

溶于DMSO，然后用PBS稀释；≤1 μM；腹腔注射
将RAMTLn3细胞注射到雌性重症联合免疫缺陷/NCr小鼠头部右侧第四乳腺脂肪垫中。

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肿瘤异种移植研究[3]
将MIA PaCa-2细胞（约1.7×10⁶个细胞/只小鼠）与Matrigel混合后，皮下注射到6周龄雄性无胸腺裸鼠（Foxn1nu）侧腹。吉西他滨（50 mg/ml）溶于PBS，PIK-75（20 mg/ml）溶于DMSO。注射液由10% Cremophor® EL和3%聚乙二醇400溶于无菌水中配制而成。在给药前，吉西他滨用PBS和DMSO进一步稀释，PIK-75用注射液进一步稀释，并用0.2 μm滤膜过滤除菌。将这些稀释液按1:1比例混合，并腹腔注射到小鼠体内。吉西他滨（20 mg/kg）或吉西他滨（20 mg/kg）/PIK-75（2 mg/kg）组合每周给药两次，溶剂对照组和PIK-75（2 mg/kg）每周给药五次。每周测量小鼠体重和肿瘤大小三次。肿瘤体积计算公式为：宽度（mm）×长度（mm）×高度（mm）/2。

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1. 小鼠胰岛素耐量试验：将小鼠分为不同组，包括胰岛素+药物载体组、胰岛素+PIK-75组、药物+胰岛素载体组和胰岛素载体+药物载体组。在注射胰岛素前，先给小鼠注射PIK-75（具体给药途径文献中未提及）。然后注射胰岛素，并在注射后不同时间点测量血糖水平，以评估PIK-75对胰岛素耐量的影响[1]
2. 小鼠胰腺癌异种移植模型：将MIA PaCa-2胰腺癌细胞皮下接种到小鼠体内，建立异种移植瘤模型。当肿瘤达到一定大小后，将小鼠随机分为若干组，包括对照组、PIK-75单药治疗组、吉西他滨单药治疗组和PIK-75联合吉西他滨治疗组。PIK-75和吉西他滨均按照特定方案给药（具体给药频率和途径在文献中未详细说明）。每周测量三次肿瘤大小和小鼠体重。根据测量的肿瘤尺寸计算肿瘤体积，以评估PIK-75联合吉西他滨的抗肿瘤效果[3]

[1]. A pharmacological map of the PI3-K family defines a role for p110alpha in insulin signaling. Cell. 2006 May 19;125(4):733-47.

[2]. Evidence for functional redundancy of class IA PI3K isoforms in insulin signalling. Biochem J. 2007 Jun 15;404(3):449-58.

[3]. Inhibition of NRF2 by PIK-75 augments sensitivity of pancreatic cancer cells to gemcitabine. Int J Oncol. 2014 Mar;44(3):959-69.

N-[(6-溴-3-咪唑并[1,2-a]吡啶基)亚甲基氨基]-N,2-二甲基-5-硝基苯磺酰胺是一种磺酰胺类化合物。
PIK-75 是一种优先抑制 p110α/γ PI3K 的抑制剂。

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磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3-K) 是一类重要的新兴药物靶点，但 PI3-K 亚型的独特作用仍不甚明了。本文描述了一种药理学研究 PI3-K 家族的方法。我们合成了一系列化学结构多样的 PI3-K 抑制剂，并通过生化方法对其靶点选择性进行了枚举，揭示了不同靶点和化学类型之间存在的隐蔽同源性。三种抑制剂与 p110γ 结合的晶体结构揭示了一个构象灵活的区域，该区域可被选择性化合物独特地利用。随后，我们利用该化学阵列确定了胰岛素信号传导所需的PI3-K亚型。我们发现，在培养细胞中，p110α是主要的胰岛素反应性PI3-K，而p110β并非必需，但它设定了p110α活性的表型阈值。靶向p110α的化合物可以阻断体内胰岛素治疗的急性效应，而p110β抑制剂则没有作用。这些结果表明，使用涵盖整个蛋白质家族的抑制剂矩阵进行系统性的靶点验证是可行的。[1] 近期的基因敲入和药理学研究表明，在IA类PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）中，p110α亚型（PIK3CA）在胰岛素信号传导中起主要作用。我们使用IA类PI3K亚型选择性抑制剂，进一步解析了各个p110亚型在胰岛素信号传导中的作用。这些抑制剂包括p110α特异性抑制剂（PIK-75）、p110α选择性抑制剂（PI-103）、p110β特异性抑制剂（TGX-221）和p110δ特异性抑制剂（IC87114）。虽然我们发现p110α是多种细胞系中胰岛素刺激PKB（蛋白激酶B）磷酸化所必需的，但在HepG2肝癌细胞中并非如此。单独抑制p110β或p110δ不足以阻断这些细胞中胰岛素向PKB的信号传导，但当与p110α抑制剂联合使用时，它们能够显著减弱胰岛素信号传导。令人惊讶的是，在J774.2巨噬细胞中，p110α、p110β或p110δ抑制剂对胰岛素向PKB的信号传导的抑制程度相似。这些结果表明p110β和p110δ可能参与胰岛素信号传导，并首次证实p110亚型之间存在功能冗余。此外，我们的结果表明，功能冗余程度与靶细胞中各亚型的相对表达水平相关。[2]

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我们描述了PIK-75联合吉西他滨治疗胰腺癌的潜在益处（基于临床前小鼠模型）。我们采用多种检测方法，包括报告基因检测、定量PCR、DNA结合实验和蛋白质印迹分析，对PIK-75对NRF2水平和活性的影响进行了表征。此外，我们还在人胰腺癌细胞系和异种移植模型中评估了PIK-75与吉西他滨的联合作用。PIK-75通过蛋白酶体介导的NRF2降解降低人胰腺癌细胞系中NRF2的蛋白水平和活性，从而调节其靶基因的表达。 PIK-75 还降低了吉西他滨诱导的 NRF2 水平及其下游靶点 MRP5 的表达。PIK-75 与吉西他滨联合治疗可增强吉西他滨在体外和体内的抗肿瘤作用。我们目前的研究为评估 NRF2 靶向药物与吉西他滨联合治疗胰腺癌提供了强有力的机制依据。[3]

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1. 在 PI3-K 家族研究中的作用：PIK-75 是用于药理学研究 PI3-K 家族的一系列化学结构多样的 PI3-K 抑制剂之一。它有助于明确 PI3-K 亚型的独特作用，特别是 p110α 在胰岛素信号传导中的作用。PIK-75 和其他亚型选择性抑制剂的使用，展示了一种利用涵盖整个蛋白质家族的抑制剂矩阵进行系统靶点验证的方法。[1]
2. PI3-K亚型的功能冗余：在胰岛素信号通路的研究中，PIK-75被用于探索IA类PI3K亚型的功能冗余。结果表明，功能冗余程度与各亚型在靶细胞中的相对表达水平相关。例如，在HepG2细胞和J774.2细胞中，PIK-75单独存在时无法完全阻断胰岛素信号通路，表明其他亚型（p110β、p110δ）可以补偿p110α的功能[2]。
3. 增强吉西他滨敏感性的机制：PIK-75通过抑制NRF2增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。它诱导蛋白酶体介导的NRF2降解，从而降低NRF2蛋白水平和活性，下调NRF2靶基因（如MRP5）的表达，最终增强吉西他滨的抗肿瘤作用。这为评估NRF2靶向药物联合吉西他滨治疗胰腺癌的机制提供了依据[3]

C16H14BRN5O4S

452.28

450.994

C, 42.49; H, 3.12; Br, 17.67; N, 15.48; O, 14.15; S, 7.09

372196-67-3

PIK-75 hydrochloride;372196-77-5

10275789

Light brown to brown solid powder

1.7±0.1 g/cm3

1.701

3.84

121.24

0

7

4

27

679

0

BrC1=CN2C(/C=N/N(C)S(C3C=C([N+]([O-])=O)C=CC=3C)(=O)=O)=CN=C2C=C1

QTHCAAFKVUWAFI-DJKKODMXSA-N

InChI=1S/C16H14BrN5O4S/c1-11-3-5-13(22(23)24)7-15(11)27(25,26)20(2)19-9-14-8-18-16-6-4-12(17)10-21(14)16/h3-10H,1-2H3/b19-9+

N-[(E)-(6-bromoimidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)methylideneamino]-N,2-dimethyl-5-nitrobenzenesulfonamide

PIK 75; PIK75; PIK-75; 372196-67-3; 945619-31-8; UNII-9058I8S63D; (E)-N'-((6-bromoimidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)methylene)-N,2-dimethyl-5-nitrobenzenesulfonohydrazide; 9058I8S63D; PIK-75

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

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