| 规格 | 价格 | |
|---|---|---|
| 1mg | ||
| 5mg | ||
| 10mg | ||
| 50mg | ||
| Other Sizes |
| 靶点 |
Bioorthogonal probe
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| 体外研究 (In Vitro) |
在 Raw264.7 细胞裂解物中,衣康酸炔(ITalk;0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 mM;0–4 小时)表现出浓度和时间依赖性标记 [1]。在四个小时内,衣康酸炔 (100 μM) 显着提高了用 100 ng/mL LPS 刺激的 Raw264.7 细胞中 NRF-2 的蛋白水平,并显着减少了 LPS 刺激的 Raw264.7 中产生乳酸的细胞数量。细胞。当存在衣康酸炔时,LPS 刺激的 Raw264.7 细胞分泌的白细胞介素 1β (IL-1β) 显着减少 [1]。衣康酸炔(100 μM;12 小时)对 Raw264.7 细胞活力没有影响 [1]。在炎症巨噬细胞中,衣康酸炔与其靶标结合,包括腺苷酸激酶 2 (AK2)、凝溶胶蛋白 (GSN)、ATP 柠檬酸合酶 (ACLY) 和 DNA 损伤结合蛋白 1 (DDB1)[1]。
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| 酶活实验 |
用衣康酸炔(ITalk)标记体外蛋白质。[1]
为了标记细胞裂解物中的蛋白质,将冷冻的Raw264.7细胞重新悬浮在含有不含EDTA的Pierce HaltTM蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS缓冲液中。通过在冰中超声处理裂解细胞,并在4℃下离心(20000 g,30分钟)收集细胞裂解物以去除碎片。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。将50µL细胞裂解物(2 mg/ml)与100μMitaconate-alkyne (ITalk) 在37℃下孵育1小时。所得裂解物用200µL甲醇、50µL氯仿和150µL Milli-Q水沉淀。沉淀的蛋白质在4℃下以8000 g离心5分钟,并用500µL冷甲醇洗涤两次。为了通过凝胶内荧光观察探针标记效率,将沉淀的蛋白质在室温下重新悬浮在含有0.4%SDS、1 mM CuSO4、100μM TBTA配体、100μM叠氮化罗丹明和1 mM TCEP的50µL PBS中1小时。反应后的样品在10%SDS-PAGE凝胶上解析,并通过ChemiDoc XRS+成像。然后用考马斯亮蓝对凝胶进行染色,以证明其负载量相等。 用衣康酸炔(ITalk)标记原位蛋白质。[1] 为了标记活细胞中的衣康酸靶点,Raw264.7细胞生长到80%融合。用100μM OI或衣康酸炔(ITalk)处理细胞12小时。用PBS洗涤细胞三次,以1000rpm离心3分钟。细胞颗粒储存在-80°C下。将细胞沉淀重新悬浮在含有不含EDTA的Pierce HaltTM蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS缓冲液中。通过在冰中超声处理裂解细胞,并在4℃下离心(20000 g,30分钟)收集细胞裂解物以去除碎片。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。为了通过凝胶内荧光观察探针标记效率,将50μL裂解物(2 mg/mL)与1 mM CuSO4、100μM TBTA配体、100μM叠氮罗丹明和1 mM TCEP在室温下混合1小时。反应后的样品在10%SDS-PAGE凝胶上分离,并通过ChemiDoc XRS+成像。然后用考马斯亮蓝对凝胶进行染色,以证明其负载量相等 用于鉴定敏感衣康化靶点的时间分辨化学蛋白质组学。对于时间分辨化学蛋白质组学分析,Raw264.7细胞在15厘米培养皿中生长至80%融合。细胞分别用10ng/mL LPS和100μM<strong>衣康酸炔(ITalk)</strong>处理1或10小时。细胞裂解、点击反应、链霉抗生物素蛋白富集和胰蛋白酶消化的程序如上所述进行。对于二甲基标记,1小时处理的样品标记为“轻”,而10小时处理的样本标记为“重”。数据分析如上所述进行。 通过衣康酸-炔烃(ITalk)鉴定衣康酸位点。[1] 为了通过衣康酸-炔烃(ITalk)鉴定衣康酸位点,Raw264.7细胞在15cm培养皿中生长至80%融合。Raw264.7细胞用10 ng/mL LPS和100μMitaconate-alkyne (ITalk) 处理12小时。通过PBS洗涤收集细胞三次,以1000 rpm离心3分钟。细胞在1 mL冰冷的PBS缓冲液中裂解,该缓冲液含有不含EDTA的Pierce HaltTM蛋白酶抑制剂混合物,并进行超声处理。通过在4℃下离心(20000 g,30分钟)收集细胞裂解物以去除碎片。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。在室温下,将1 mL细胞裂解物(2 mg/mL)与1 mM CuSO4、100μM TBTA配体、100µM酸裂解叠氮基丁(DADPS生物素叠氮化物,目录号1330-5)和1 mM TCEP反应1小时。将所得点击标记的裂解物在4℃下以8000 g离心5分钟,并用1 mL冷甲醇洗涤两次。如上所述进行链霉抗生物素蛋白富集和珠上胰蛋白酶消化。通过将珠子与200μL 2%甲酸/水温育1小时并轻轻旋转,从珠子中释放改性肽。离心后,收集上清液。然后重复切割过程,合并上清液。此外,用含有1%甲酸的50%乙腈/水(400μL)洗涤珠粒,并将洗涤液与上清液混合形成裂解部分。样品在真空离心机中干燥,并在-30°C下储存,直至分析。 |
| 细胞实验 |
细胞活力测定。[1]
为了评估衣康酸炔(ITalk)的细胞毒性,将每孔10000个Raw264.7细胞接种在96孔培养皿中过夜。然后用100μM的itaconate-alkyne (ITalk) 或OI处理细胞24小时。用预热的PBS洗涤细胞,用含有MTS试剂的无血清培养基孵育2小时。测量490 nm处的吸光度,并报告测试条件下细胞存活率相对于阴性对照处理的百分比。为了评估衣康酯对坏死性下垂的影响,将每孔10000个HT-29细胞接种在96孔培养皿中过夜。用250μM OI处理细胞24小时,然后用20 ng/mL TNF-α、1μg/mL SMAC模拟物和50μg/mL zVAD FMK处理3小时。如上所述,通过MTS测定细胞存活率。为了通过CellToxTM绿色细胞毒性试验评估细胞存活率,每孔用100μL绿色试剂(2X)处理细胞,并在室温下孵育1小时。测量485nmEx/520nmEm的荧光以计算细胞存活率。 细胞内衣康酸盐的定量。[1] HEK293T细胞以每孔2 x 106的速度在6孔板上放置过夜,并分别用1mM的itaconate-alkyne (ITalk) 或OI处理4小时。在平板中用PBS轻轻洗涤细胞三次,并通过离心收集。通过离心,用PBS进一步洗涤细胞三次。在含有0.1%TritonX-100的冰冷PBS中通过超声处理裂解细胞托盘,在20000g下离心30分钟以去除细胞碎片,并通过BCA蛋白测定法测定蛋白质浓度。将蛋白质浓度标准化为2mg/ml的100µL后,加入900µL冷甲醇,在冰上提取小分子代谢物。将混合物在-20℃下孵育2小时,并在4℃下以20000 g离心1小时。收集上清液并通过LC-SRM进行分析。LC-SRM系统由AB SCIEX 5500三重四极杆质谱仪和岛津DGU-20A带安捷伦柱的液相色谱仪组成。缓冲梯度为100%-0缓冲液A(100%水,0.1%甲酸)和0%-100%缓冲液B(100%甲醇,0.1%甲酸。 通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测量IL-1β的产生。[1] Raw264.7细胞最初在6cm培养皿中放置过夜。细胞用10 ng/mL LPS和1 mM衣康酸盐或100μM衣康酸炔(ITalk)或100μM OI处理24小时。之后,收集条件培养基,使用IL-1 ELISA试剂盒检测细胞因子的产生。 葡萄糖消耗和乳酸产生。[1] Raw264.7细胞在96孔中培养过夜。细胞用10 ng/mL LPS和1 mM衣康酸盐或100μM衣康酸炔(ITalk)或100μM OI处理24小时。使用葡萄糖(GO)检测试剂盒测量培养基中的葡萄糖消耗量,而使用乳酸检测试剂盒测定培养基中乳酸的水平。 |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
衣康酸是一种参与病原体-巨噬细胞相互作用的抗炎代谢物,但其作用机制尚未完全阐明。竞争性半胱氨酸谱分析已被用于研究衣康酸在细胞裂解液中的反应活性,但目前仍缺乏直接分析活体巨噬细胞中衣康酸靶点的方法。本研究开发了一种特异性生物正交探针——衣康酸-炔烃(ITalk),用于对炎症巨噬细胞中的衣康酸进行定量和位点特异性的化学蛋白质组学分析。ITalk能够重现衣康酸的抗炎特性,并可用于对其直接靶点进行生化评估和蛋白质组学分析。我们的研究揭示了衣康酸底物的广泛分布,为研究其功能提供了一种多功能工具和全面的资源。[1] 总之,我们开发了一种特异性且细胞渗透性强的生物正交探针——ITalk,用于直接在活细胞中对衣康酸靶点进行化学蛋白质组学分析。该探针展现出与衣康酸相当的抗炎作用,并能标记衣康酸的真实靶标。利用定量化学蛋白质组学,我们在炎症巨噬细胞中鉴定出1926个衣康酸的蛋白质靶标,其中包括199个高敏感性靶标。此外,位点特异性分析揭示了1131个衣康酸修饰的半胱氨酸位点,其中包括参与炎症反应和宿主防御的关键蛋白上的位点。我们构建的综合数据库为进一步研究衣康酸的生物学功能提供了宝贵的资源。例如,我们发现衣康酸通过修饰RIPK3的C360位点激活RIPK3信号通路,这种代谢与坏死性凋亡在免疫信号传导中的新联系有待进一步研究。从化学角度来看,考虑到ITalk仍可能被酯酶水解,且其长尾可能无法完全模拟衣康酸在细胞中的作用,因此迫切需要开发更稳定、更接近天然状态的衣康酸修饰探针。尽管如此,由于 ITalk 很容易应用于分析巨噬细胞以外的细胞类型中的衣康酸靶点,我们设想,这种独特的化学工具将揭示衣康酸的更多功能相关性。[1]
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| 分子式 |
C13H18O4
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|---|---|
| 分子量 |
238.28
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| 精确质量 |
238.12
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| CAS号 |
2454181-83-8
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| PubChem CID |
154573778
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| 外观&性状 |
White to off-white solid powder
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| 密度 |
1.1±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
385.4±32.0 °C at 760 mmHg
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| 闪点 |
141.5±18.6 °C
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| 蒸汽压 |
0.0±1.9 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.485
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| LogP |
3.21
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| tPSA |
63.6
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| 氢键供体(HBD)数目 |
1
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| 氢键受体(HBA)数目 |
4
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| 可旋转键数目(RBC) |
10
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| 重原子数目 |
17
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| 分子复杂度/Complexity |
322
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
C=C(CC(=O)OCCCCCCC#C)C(=O)O
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| InChi Key |
NPWMZOZWVAFQMP-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C13H18O4/c1-3-4-5-6-7-8-9-17-12(14)10-11(2)13(15)16/h1H,2,4-10H2,(H,15,16)
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| 化学名 |
2-methylidene-4-oct-7-ynoxy-4-oxobutanoic acid
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| 别名 |
Itaconate-alkyne; 2454181-83-8; ITalk; 2-methylidene-4-oct-7-ynoxy-4-oxobutanoic acid; 2-methylene-butanedioic acid, 4-(7-octyn-1-yl) ester;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO: 250 mg/mL (1049.19 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加,逐一添加), 澄清溶液。
例如,若需制备1 mL的工作液,可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中,混匀;然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80,混匀;加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备:将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中,得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加,逐一添加), 澄清溶液。 例如,若需制备1 mL的工作液,可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中,混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备(4°C,1 周):将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中,得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加,逐一添加), 澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如:用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液,按从左到右的顺序依次添加助溶剂,澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明,并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中,混合均匀/澄清;向上述体系中加入50 μL Tween-80,混合均匀/澄清;然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL; 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出,可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果,工作液请现配现用! 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液,请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 4.1967 mL | 20.9837 mL | 41.9674 mL | |
| 5 mM | 0.8393 mL | 4.1967 mL | 8.3935 mL | |
| 10 mM | 0.4197 mL | 2.0984 mL | 4.1967 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液):对于大多数产品,InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如:5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度),个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息,或者很难将产品溶解在溶液中,请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算(摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等);
4、母液配好之后,将其分装到常规用量,并储存在-20°C或-80°C,尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度: mg/mL;
DMSO母液配制方法: mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度,请首先与我们联系。
体内配方配制方法:取 μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL ddH2O,混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后,再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶;
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。