Itaconate-alkyne (ITalk)   中文名称: 衣康酸酯-炔

Bioorthogonal probe

在 Raw264.7 细胞裂解物中，衣康酸炔（ITalk；0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 mM；0–4 小时）表现出浓度和时间依赖性标记 [1]。在四个小时内，衣康酸炔 (100 μM) 显着提高了用 100 ng/mL LPS 刺激的 Raw264.7 细胞中 NRF-2 的蛋白水平，并显着减少了 LPS 刺激的 Raw264.7 中产生乳酸的细胞数量。细胞。当存在衣康酸炔时，LPS 刺激的 Raw264.7 细胞分泌的白细胞介素 1β (IL-1β) 显着减少 [1]。衣康酸炔（100 μM；12 小时）对 Raw264.7 细胞活力没有影响 [1]。在炎症巨噬细胞中，衣康酸炔与其靶标结合，包括腺苷酸激酶 2 (AK2)、凝溶胶蛋白 (GSN)、ATP 柠檬酸合酶 (ACLY) 和 DNA 损伤结合蛋白 1 (DDB1)[1]。

用衣康酸炔（ITalk）标记体外蛋白质。[1]
为了标记细胞裂解物中的蛋白质，将冷冻的Raw264.7细胞重新悬浮在含有不含EDTA的Pierce HaltTM蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS缓冲液中。通过在冰中超声处理裂解细胞，并在4℃下离心（20000 g，30分钟）收集细胞裂解物以去除碎片。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。将50µL细胞裂解物（2 mg/ml）与100μMitaconate-alkyne (ITalk) 在37℃下孵育1小时。所得裂解物用200µL甲醇、50µL氯仿和150µL Milli-Q水沉淀。沉淀的蛋白质在4℃下以8000 g离心5分钟，并用500µL冷甲醇洗涤两次。为了通过凝胶内荧光观察探针标记效率，将沉淀的蛋白质在室温下重新悬浮在含有0.4%SDS、1 mM CuSO4、100μM TBTA配体、100μM叠氮化罗丹明和1 mM TCEP的50µL PBS中1小时。反应后的样品在10%SDS-PAGE凝胶上解析，并通过ChemiDoc XRS+成像。然后用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，以证明其负载量相等。

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用衣康酸炔（ITalk）标记原位蛋白质。[1]
为了标记活细胞中的衣康酸靶点，Raw264.7细胞生长到80%融合。用100μM OI或衣康酸炔（ITalk）处理细胞12小时。用PBS洗涤细胞三次，以1000rpm离心3分钟。细胞颗粒储存在-80°C下。将细胞沉淀重新悬浮在含有不含EDTA的Pierce HaltTM蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS缓冲液中。通过在冰中超声处理裂解细胞，并在4℃下离心（20000 g，30分钟）收集细胞裂解物以去除碎片。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。为了通过凝胶内荧光观察探针标记效率，将50μL裂解物（2 mg/mL）与1 mM CuSO4、100μM TBTA配体、100μM叠氮罗丹明和1 mM TCEP在室温下混合1小时。反应后的样品在10%SDS-PAGE凝胶上分离，并通过ChemiDoc XRS+成像。然后用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，以证明其负载量相等
用于鉴定敏感衣康化靶点的时间分辨化学蛋白质组学。对于时间分辨化学蛋白质组学分析，Raw264.7细胞在15厘米培养皿中生长至80%融合。细胞分别用10ng/mL LPS和100μM＜strong＞衣康酸炔（ITalk）＜/strong＞处理1或10小时。细胞裂解、点击反应、链霉抗生物素蛋白富集和胰蛋白酶消化的程序如上所述进行。对于二甲基标记，1小时处理的样品标记为“轻”，而10小时处理的样本标记为“重”。数据分析如上所述进行。

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通过衣康酸-炔烃（ITalk）鉴定衣康酸位点。[1]
为了通过衣康酸-炔烃（ITalk）鉴定衣康酸位点，Raw264.7细胞在15cm培养皿中生长至80%融合。Raw264.7细胞用10 ng/mL LPS和100μMitaconate-alkyne (ITalk) 处理12小时。通过PBS洗涤收集细胞三次，以1000 rpm离心3分钟。细胞在1 mL冰冷的PBS缓冲液中裂解，该缓冲液含有不含EDTA的Pierce HaltTM蛋白酶抑制剂混合物，并进行超声处理。通过在4℃下离心（20000 g，30分钟）收集细胞裂解物以去除碎片。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。在室温下，将1 mL细胞裂解物（2 mg/mL）与1 mM CuSO4、100μM TBTA配体、100µM酸裂解叠氮基丁（DADPS生物素叠氮化物，目录号1330-5）和1 mM TCEP反应1小时。将所得点击标记的裂解物在4℃下以8000 g离心5分钟，并用1 mL冷甲醇洗涤两次。如上所述进行链霉抗生物素蛋白富集和珠上胰蛋白酶消化。通过将珠子与200μL 2%甲酸/水温育1小时并轻轻旋转，从珠子中释放改性肽。离心后，收集上清液。然后重复切割过程，合并上清液。此外，用含有1%甲酸的50%乙腈/水（400μL）洗涤珠粒，并将洗涤液与上清液混合形成裂解部分。样品在真空离心机中干燥，并在-30°C下储存，直至分析。

细胞活力测定。[1]
为了评估衣康酸炔（ITalk）的细胞毒性，将每孔10000个Raw264.7细胞接种在96孔培养皿中过夜。然后用100μM的itaconate-alkyne (ITalk) 或OI处理细胞24小时。用预热的PBS洗涤细胞，用含有MTS试剂的无血清培养基孵育2小时。测量490 nm处的吸光度，并报告测试条件下细胞存活率相对于阴性对照处理的百分比。为了评估衣康酯对坏死性下垂的影响，将每孔10000个HT-29细胞接种在96孔培养皿中过夜。用250μM OI处理细胞24小时，然后用20 ng/mL TNF-α、1μg/mL SMAC模拟物和50μg/mL zVAD FMK处理3小时。如上所述，通过MTS测定细胞存活率。为了通过CellToxTM绿色细胞毒性试验评估细胞存活率，每孔用100μL绿色试剂（2X）处理细胞，并在室温下孵育1小时。测量485nmEx/520nmEm的荧光以计算细胞存活率。

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细胞内衣康酸盐的定量。[1]
HEK293T细胞以每孔2 x 106的速度在6孔板上放置过夜，并分别用1mM的itaconate-alkyne (ITalk) 或OI处理4小时。在平板中用PBS轻轻洗涤细胞三次，并通过离心收集。通过离心，用PBS进一步洗涤细胞三次。在含有0.1%TritonX-100的冰冷PBS中通过超声处理裂解细胞托盘，在20000g下离心30分钟以去除细胞碎片，并通过BCA蛋白测定法测定蛋白质浓度。将蛋白质浓度标准化为2mg/ml的100µL后，加入900µL冷甲醇，在冰上提取小分子代谢物。将混合物在-20℃下孵育2小时，并在4℃下以20000 g离心1小时。收集上清液并通过LC-SRM进行分析。LC-SRM系统由AB SCIEX 5500三重四极杆质谱仪和岛津DGU-20A带安捷伦柱的液相色谱仪组成。缓冲梯度为100%-0缓冲液A（100%水，0.1%甲酸）和0%-100%缓冲液B（100%甲醇，0.1%甲酸。

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通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测量IL-1β的产生。[1]
Raw264.7细胞最初在6cm培养皿中放置过夜。细胞用10 ng/mL LPS和1 mM衣康酸盐或100μM衣康酸炔（ITalk）或100μM OI处理24小时。之后，收集条件培养基，使用IL-1 ELISA试剂盒检测细胞因子的产生。

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葡萄糖消耗和乳酸产生。[1]
Raw264.7细胞在96孔中培养过夜。细胞用10 ng/mL LPS和1 mM衣康酸盐或100μM衣康酸炔（ITalk）或100μM OI处理24小时。使用葡萄糖（GO）检测试剂盒测量培养基中的葡萄糖消耗量，而使用乳酸检测试剂盒测定培养基中乳酸的水平。

[1]. Chemoproteomic Profiling of Itaconation by Bioorthogonal Probes in Inflammatory Macrophages. J Am Chem Soc . 2020 Jun 24;142(25):10894-10898.

Itaconate is an anti-inflammatory metabolite involved in pathogen-macrophage interactions, but its mechanism of action has not been fully elucidated. Competitive cysteine profiling has been used to study the reactivity of Itaconate in cell lysates, but there is still a lack of methods for directly analyzing Itaconate targets in living macrophages. In this study, we developed a specific bioorthogonal probe, Itaconate-alkyne (ITalk), for quantitative and site-specific chemical proteomics analysis of Itaconate in inflamed macrophages. ITalk can reproduce the anti-inflammatory properties of Itaconate and can be used for biochemical assessment and proteomics analysis of its direct targets. Our study reveals the wide distribution of Itaconate substrates, providing a versatile tool and comprehensive resource for studying its function. [1] In summary, we developed a specific and cell-permeable bioorthogonal probe, ITalk, for direct chemical proteomics analysis of Itaconate targets in living cells. The probe exhibits anti-inflammatory activity comparable to that of Itaconate and can label the true targets of Itaconate. Using quantitative chemical proteomics, we identified 1,926 Itaconate protein targets in inflammatory macrophages, including 199 highly sensitive targets. In addition, site-specific analysis revealed 1,131 Itaconate-modified cysteine sites, including sites on key proteins involved in inflammatory responses and host defense. The comprehensive database we constructed provides a valuable resource for further research on the biological functions of Itaconate. For example, we found that Itaconate activates the RIPK3 signaling pathway by modifying the C360 site of RIPK3, and this novel link between metabolism and necrosis-apoptosis in immune signaling needs further investigation. From a chemical perspective, given that ITalk may still be hydrolyzed by esterases and its long tail may not fully mimic the role of Itaconate in cells, there is an urgent need to develop more stable Itaconate-modified probes that are closer to the native state. Nevertheless, since ITalk can be easily applied to analyze Itaconate targets in cell types other than macrophages, we envision that this unique chemical tool will reveal more functional relevance of Itaconate. [1]

C13H18O4

238.28

238.12

2454181-83-8

154573778

White to off-white solid powder

1.1±0.1 g/cm3

385.4±32.0 °C at 760 mmHg

141.5±18.6 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.485

3.21

63.6

1

4

10

17

322

0

NPWMZOZWVAFQMP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H18O4/c1-3-4-5-6-7-8-9-17-12(14)10-11(2)13(15)16/h1H,2,4-10H2,(H,15,16)

2-methylidene-4-oct-7-ynoxy-4-oxobutanoic acid

Itaconate-alkyne; 2454181-83-8; ITalk; 2-methylidene-4-oct-7-ynoxy-4-oxobutanoic acid; 2-methylene-butanedioic acid, 4-(7-octyn-1-yl) ester;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 250 mg/mL (1049.19 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。