KT474 (KYM001; PROTAC IRAK4 degrader-7)   中文名称: PROTAC IRAK4 降解剂-7

IRAK4

KT-474与CRBN和IRAK4形成三元复合物，导致IRAK4的泛素化和蛋白酶体降解。使用降解剂从myddosome中消除IRAK4有可能阻断所有下游信号传导，从而抑制TLR介导和IL-1R介导的细胞活化和细胞因子诱导。[2]
KYM-001导致IRAK4的强效E3连接酶依赖性降解。值得注意的是，与人PBMC中的IRAK4激酶抑制剂相比，KYM-001更有效地抑制TLR激活的Myddosome信号传导。在MYD88 L265P突变体ABC DLBCL系OCI-LY10中，IRAK4对>10000个其他检测到的蛋白质具有高度选择性降解。KYM-001对IRAK4的降解导致ABC DLBCL在48-72小时内的细胞周期抑制和凋亡，在MYD88突变体与MYD88-WT细胞系中具有优先活性。[3]

口服KYM-001在人MYD88突变体ABC DLBCL的几种小鼠异种移植物模型中以耐受的剂量和时间表显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性。在OCI-LY10模型中，肿瘤消退与IRAK4>80%的降解有关，建立了最大疗效所需的药效学效应。由于BCR信号和MYD88的改变经常在B细胞恶性肿瘤中同时发生，我们研究了IRAK4降解和BTK抑制联合活性的潜力。在具有CD79B和MYD88激活突变的OCI-LY10异种移植物模型中，用伊布替尼抑制BTK对KYM-001抗肿瘤活性具有加性作用。[3]

流动法检测PBMC中的IRAK4使用流动法评估PBMC中IRAK4的降解。冷冻的PBMC用10%FBS解冻成RPMI，90 每孔镀上μl溶液。KT-474是在10 μM起始剂量，随后进行五倍稀释和10点剂量曲线，并以0.1%的最终DMSO浓度添加。细胞和化合物在37 °C和5%二氧化碳过夜（20 h） 。孵育后，用BD Biosciences的Cytofix固定缓冲液固定细胞，并用PBS/2%FBS洗涤两次，将颗粒储存在−80 °C，直至进一步处理。在流动运行日，解冻细胞颗粒，并加入预透化染色混合物（CD3/CD14/CD56/CD19）。随后用60%甲醇将样品透化10 最小值为4 °C，然后用透化后染色混合物（CD16/IRAK4）孵育。在Attune NxT流式细胞仪上运行染色的样品。使用FlowJo分析数据，并使用GraphPad Prism使用四参数逻辑回归曲线自由拟合生成50%的抑制浓度（IC50）
IRAK4信号百分比在B细胞（CD3−/CD19+）、单核细胞（CD3−/CD19−CD14+）和淋巴细胞（通过侧散大小和CD14-确定）中确定。[2]

人体细胞因子释放测定法[2]
冷冻的PBMC用热灭活的10%FBS/1%青霉素-链霉素解冻成RPMI，并于同一天以190 μl介质。KT-474、PF-06550833和DMSO对照品为每个供体制备两份。所有细胞均使用帝肯自动液体处理机给药，然后在37℃下孵育 °C和5%二氧化碳16 h、 最终测试浓度为0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、100和500 nM。16岁以后 用化合物预处理的h，LPS（O55:B5）（Sigma-Aldrich，L2637）或R848（Invivogen，tlrl-R848）在100 ng ml−1或10 μg ml−1最终浓度。将细胞再孵育5 h在37 °C和5%二氧化碳。测定完成后，将平板以300g离心5 最少150 小心地取出μl上清液，放入新的96孔V形底板中，并在−80下储存 °C，直至进一步分析。使用中尺度发现（MSD）人类U-plex或V-plex测定来测量细胞因子水平。在细胞因子分析当天，将上清液样品解冻，用MSD测定稀释剂稀释，并加入MSD板中。根据标准制造商的方案进一步完成测定。将细胞因子数据标准化为刺激和非刺激对照。使用MSD Discovery Workbench软件测定上清液中细胞因子的浓度。GraphPad Prism用于使用四参数逻辑回归曲线自由拟合生成IC50。[2]

---

人B细胞磷酸化流测定法[2]
CD19+B细胞购自BioIVT或使用阴性选择试剂盒（STEMCELL Technologies，17954）在内部分离。来自n的冷冻B细胞 = 5个供体被解冻并以每孔450000个细胞的速度接种在190 μl介质在96孔U形底板中。KT-474、PF-06550833和DMSO对照品为每个供体制备两份。所有细胞均使用帝肯自动液体处理机给药，然后在37℃下孵育 °C和5%二氧化碳16 h、 最终测试浓度为0.12、0.489、1.95、7.81、31.2、125、500和2000 nM。16岁以后 化合物预处理的h，CpG-B（InvivoGen，tlrl-2006）以2.5添加 μM最终浓度60 培养后，将等体积的BD Cytofix固定缓冲液加入孔中。细胞用PBS+2%FBS洗涤，然后在冰上透化30 分钟，使用冷BD Perm缓冲液III（BD Biosciences，558050）。在用荧光标记的抗体（藻红蛋白（PE）磷酸-p65，克隆K10-895.12.50（BD Biosciences，558423））染色30分钟之前，再次洗涤细胞 然后在使用Attune NxT流式细胞仪采集之前洗涤细胞两次，每孔10000次。使用FlowJo分析数据，并使用GraphPad Prism使用四参数逻辑回归曲线自由拟合生成IC50。

通过将人ABC DLBCL细胞系植入免疫缺陷小鼠模型并评估肿瘤体积，开展了肿瘤异种移植研究。[3]

---

采用免疫测定或靶向串联质谱法定量分析了人外周血单核细胞（PBMC）、ABC DLBCL细胞系和异种移植瘤中的IRAK4。通过mRNA和磷酸化蛋白终点监测Myddosome信号通路。采用流式细胞术监测细胞活力和细胞周期。通过将人ABC DLBCL细胞系植入免疫缺陷小鼠模型并评估肿瘤体积，开展了肿瘤异种移植研究。[3]

[1]. Irak degraders and uses thereof. Patent WO2020113233A1.

[2]. IRAK4 degrader in hidradenitis suppurativa and atopic dermatitis: a phase 1 trial. Nat Med. 2023 Dec;29(12):3127-3136.

[3]. Abstract LB-272: KYM-001, a first-in-class oral IRAK4 protein degrader, induces tumor regression in xenograft models of MYD88-mutant ABC DLBCL alone and in combination with BTK inhibition. Cancer Res (2019) 79 (13_Supplement): LB-272.

由白细胞介素-1 (IL-1) 受体相关激酶4 (IRAK4) 介导的Toll样受体驱动和IL-1受体驱动的炎症参与化脓性汗腺炎 (HS) 和特应性皮炎 (AD) 的病理生理过程。IRAK4降解剂KT-474 (SAR444656) 在一项随机、双盲、安慰剂对照的I期临床试验中进行了研究，该试验的主要目标是安全性和耐受性。次要目标包括药代动力学、药效学以及在中重度HS患者和中重度AD患者中的临床活性。在105名健康志愿者 (HV) 中，KT-474单次给药后，每日给药，持续14天；随后，在一个包含21名患者的开放标签队列中，KT-474给药28天。在健康志愿者（HV）的血液中观察到IRAK4降解，单次给药600-1600 mg后平均降低≥93%，每日给药50-200 mg，连续14天后平均降低≥95%。在患者中，血液中IRAK4也观察到类似的降解，并且在IRAK4相对于健康志愿者过度表达的皮肤病变中，IRAK4水平恢复正常。在化脓性汗腺炎（HS）和特应性皮炎（AD）患者的血液和皮肤中，疾病相关炎症生物标志物均有所降低，并且与皮肤病变和症状的改善相关。未发生药物相关感染。据我们所知，这是首个已发表的采用异双功能降解剂的临床试验，这些结果为KT-474在HS和AD中的应用提供了初步的概念验证，需要在更大规模的试验中进一步证实。 ClinicalTrials.gov 注册号：NCT04772885。[1]

---

目的：本研究评估了选择性小分子 IRAK4 降解剂在体外人 ABC 型弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL) 细胞系和体内肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性，包括单独使用以及与 BTK 抑制剂联合使用。[2]
引言：ABC 型 DLBCL 约占 DLBCL 的 45%，与 GCB 型 DLBCL 相比，其 R-CHOP 化疗预后较差。30-40% 的 ABC 型 DLBCL 存在 MYD88 激活突变；L265P 是最常见的 MYD88 突变，可导致 Myddosome 的组成型组装和激活。IRAK4 激酶和支架功能对于 Myddosome 向 NFκB 和 MAPK 通路的完整信号传导至关重要。 Kymera Therapeutics公司采用化学敲低策略开发异双功能小分子IRAK4降解剂，例如KYM-001，用于治疗MYD88驱动的淋巴瘤。[2]
方法：采用免疫测定或靶向串联质谱法定量人外周血单核细胞（PBMC）、ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系和异种移植瘤中的IRAK4。通过mRNA和磷酸化蛋白终点监测Myddosome信号通路。采用流式细胞术监测细胞活力和细胞周期。通过将人ABC型DLBCL细胞系移植到免疫缺陷小鼠品系中并评估肿瘤体积来进行肿瘤异种移植研究。[2]
关键数据：KYM-001可有效降解IRAK4，且该降解依赖于E3连接酶。值得注意的是，与IRAK4激酶抑制剂相比，KYM-001能更有效地抑制人外周血单核细胞（PBMC）中TLR激活的Myddosome信号通路。在MYD88 L265P突变型ABC DLBCL细胞系OCI-LY10中，KYM-001对IRAK4的降解具有高度选择性，而对超过10,000种其他检测到的蛋白质则无明显影响。KYM-001介导的IRAK4降解可在48-72小时内抑制ABC DLBCL细胞的细胞周期并诱导细胞凋亡，且对MYD88突变型细胞系的活性高于MYD88野生型细胞系。在耐受剂量和给药方案下，口服KYM-001在多种人MYD88突变型ABC DLBCL小鼠异种移植模型中均显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性。在OCI-LY10模型中，肿瘤消退与IRAK4降解超过80%相关，这证实了达到最大疗效所需的药效学效应。由于BCR信号通路和MYD88的改变在B细胞恶性肿瘤中经常同时发生，我们研究了IRAK4降解和BTK抑制联合作用的潜力。在OCI-LY10异种移植模型中，该模型同时具有CD79B和MYD88的激活突变，使用伊布替尼抑制BTK可增强KYM-001的抗肿瘤活性。[2]
结论：KYM-001是一种首创的、高效、选择性强且口服有效的IRAK4降解剂，可导致ABC-DLBCL模型中的肿瘤消退。IRAK4的降解可消除IRAK4的激酶和支架蛋白功能，其疗效可能优于单独使用激酶抑制剂。这些数据表明，IRAK4降解剂是一种很有前途的治疗MYD88驱动淋巴瘤的新方法，可以单独使用，也可以与其他靶向方法（如BTK抑制剂）联合使用。[2]

C44H49F2N11O6

865.926775693893

865.383

C, 61.03; H, 5.70; F, 4.39; N, 17.79; O, 11.09

2432994-31-3

146599824

White to off-white solid powder

2.5

172Ų

2

13

11

63

1790

2

CN1C2=C(C=CC=C2N(C1=O)C3CCC(=O)NC3=O)C#CCOC4CCN(CC4)CC5CCC(CC5)N6C=C(C(=N6)C(F)F)NC(=O)C7=C8N=C(C=CN8N=C7)N9C[C@H]1C[C@@H]9CO1

NQGKNAVUMAHSQN-PKIOHZLWSA-N

InChI=1S/C44H49F2N11O6/c1-52-39-27(4-2-6-34(39)57(44(52)61)35-11-12-37(58)50-43(35)60)5-3-19-62-30-13-16-53(17-14-30)22-26-7-9-28(10-8-26)56-24-33(38(51-56)40(45)46)48-42(59)32-21-47-55-18-15-36(49-41(32)55)54-23-31-20-29(54)25-63-31/h2,4,6,15,18,21,24,26,28-31,35,40H,7-14,16-17,19-20,22-23,25H2,1H3,(H,48,59)(H,50,58,60)/t26?,28?,29-,31-,35?/m1/s1

5-((1R,4R)-2-oxa-5-azabicyclo[2.2.1]heptan-5-yl)-N-(3-(difluoromethyl)-1-(4-((4-((3-(1-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-3-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-benzo[d]imidazol-4-yl)prop-2-yn-1-yl)oxy)piperidin-1-yl)methyl)cyclohexyl)-1H-pyrazol-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-3-carboxamide

KT-474; KYM-001; KT474; PROTAC IRAK4 degrader-7; KT-474; KT474; N-[3-(Difluoromethyl)-1-[trans-4-[[4-[[3-[1-(2,6-dioxo-3-piperidinyl)-2,3-dihydro-3-methyl-2-oxo-1H-benzimidazol-4-yl]-2-propyn-1-yl]oxy]-1-piperidinyl]methyl]cyclohexyl]-1H-pyrazol-4-yl]-5-(1R,4R)-2-oxa-5-azabicyclo[2.2.1]hept-5-ylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine-3-carboxamide; N-[3-(Difluoromethyl)-1-[4-[[4-[3-[1-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-3-methyl-2-oxobenzimidazol-4-yl]prop-2-ynoxy]piperidin-1-yl]methyl]cyclohexyl]pyrazol-4-yl]-5-[(1R,4R)-2-oxa-5-azabicyclo[2.2.1]heptan-5-yl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-3-carboxamide; 2SXR65P7E3; SCHEMBL21998241; KYM001

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~115.48 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。