G-quadruplexe (Kd = 490 nM)
The primary molecular target of pyridostatin hydrochloride is G-quadruplex (G4) DNA structures, which are four-stranded nucleic acid secondary structures formed in guanine-rich regions of the genome. G-quadruplexes are involved in regulating transcription and replication, and they are particularly prevalent in the promoter regions of proto-oncogenes such as c-kit, K-ras, and Bcl-2. Pyridostatin binds to G-quadruplex DNA with a Kd of 490 nM and stabilizes the G-quadruplex structure. By stabilizing G-quadruplexes, the compound prevents the unwinding of these structures, leading to replication- and transcription-dependent DNA damage and growth arrest in cancer cells. Pyridostatin also reduces Src protein abundance and Src-dependent motility in human breast cancer cells.

盐酸吡啶斯他汀（RR82）（10 μM；48 小时）可诱导细胞周期阻滞[1]。
盐酸吡啶斯他汀是一种小分子，可选择性地与 G-四链体 DNA 结合，形成稳定 G-四链体结构的复合物。盐酸吡啶斯他汀可引起神经突回缩、突触丢失和剂量依赖性的神经元死亡。盐酸吡啶斯他汀可诱导培养的原代神经元中 DNA 双链断裂的形成。保护和修复神经元基因组的 BRCA1 蛋白在转录水平上被盐酸吡啶加洛斯他汀（1–5 μM，过夜）显著下调[3]。
体外研究表明，盐酸吡啶斯他汀是一种选择性 G-四链体 DNA 稳定剂，其 Kd 值为 490 nM。该化合物靶向一系列原癌基因，包括c-kit、K-ras和Bcl-2，这些基因的启动子区域含有G-四链体形成序列。吡啶斯他汀可抑制MRC-5-SV40细胞和多种癌细胞系的增殖，并通过激活DNA损伤检查点诱导细胞周期阻滞。该化合物通过诱导复制和转录依赖性DNA损伤促进人类癌细胞的生长停滞。研究表明，吡啶斯他汀可降低人乳腺癌细胞中Src蛋白的丰度和Src依赖性细胞迁移能力。此外，该化合物还会导致神经突回缩、突触丢失以及神经元细胞剂量依赖性的神经元死亡。这些体外活性使吡啶斯他汀成为研究G-四链体生物学和癌症治疗的宝贵工具。

吡啶斯他汀对 BRCA2 缺陷型异种移植瘤具有抗肿瘤活性[4]
已证实，能够结合并稳定 G4 结构域的化合物对小鼠体内建立的 BRCA1/2 缺陷型异种移植瘤（RHPS4 和 CX-5461）具有活性。然而，这些化合物尚未被证实能够使 BRCA 突变患者获益。此外，BRCA 突变型肿瘤难以治疗，因为它们会迅速对靶向治疗（例如 PARP 抑制剂；PARPi）产生耐药性。因此，亟需寻找新的 G4 配体，不仅能够清除 BRCA 缺陷型肿瘤，还能对抗耐药性疾病。我们之前发表的研究结果（Zimmer 等，2016）表明，G4 配体吡啶斯他汀在体外对 BRCA2 缺陷型细胞具有特异性毒性。本研究评估了吡啶斯他汀在体内清除BRCA2缺陷型异种移植瘤的潜力。为此，研究人员使用同源的BRCA2^+/+（BRCA2功能正常）和BRCA2^-/-（BRCA2缺陷）人结直肠腺癌DLD1细胞，在CB17-SCID小鼠中构建了异种移植瘤（图1A和B）。研究人员对吡啶斯他汀的体内应用条件进行了广泛优化，结果表明，连续5天静脉注射7.5 mg/kg/天，停药2天后再进行5天治疗，该给药方案耐受性良好，表现为无明显体重下降且无不良临床症状（附录表S1）。在这些条件下，研究人员发现吡啶斯他汀能有效且特异性地抑制由BRCA2缺陷型DLD1细胞建立的异种移植瘤的生长（图1B）。作为对照，研究人员使用了PARP抑制剂他拉唑帕尼，该药物因其能够根除小鼠体内BRCA1/2缺陷型肿瘤而为人所知（Shen等，2013），并且最近已获准用于治疗携带BRCA1/2种系突变的转移性乳腺癌患者（Litton等，2018）。吡啶斯他汀对 BRCA2 缺陷型肿瘤的抗肿瘤作用与他拉唑帕尼相似，两种药物均不抑制 BRCA2 功能正常型肿瘤的生长。

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此外，研究人员使用由同源 BRCA2 +/+ 和 BRCA2 −/− 结直肠癌 HCT116 细胞建立的第二个肿瘤模型研究了吡啶斯他汀的体内反应（Xu 等，2014）。吡啶斯他汀对 BRCA2 缺陷型 HCT116 细胞来源的肿瘤表现出选择性毒性（附录图 S1A 和 B；附录表 S2），与它在 DLD1 细胞来源的异种移植瘤中的作用类似。[4]
研究人员之前的研究表明，吡啶斯他汀治疗会导致 HR 修复受损的细胞（包括 BRCA2 缺陷型细胞）中 DNA 损伤的积累（Zimmer 等，2016）。与此一致的是，免疫组织化学 (IHC) 分析显示，BRCA2 缺陷型肿瘤（而非 BRCA2 功能正常的肿瘤）在暴露于吡啶斯他汀或他拉唑帕尼后，DNA 损伤标志物 γH2AX 的水平升高（附录图 S1C-F）。这些结果表明，吡啶斯他汀不仅能特异性地抑制细胞生长（Zimmer等人，2016），还能抑制缺乏BRCA2的肿瘤，并且其体内作用机制是通过造成DNA损伤。[4]
由于吡啶斯他汀盐酸盐主要用作研究试剂，因此对其体内研究有限。然而，其诱导癌细胞DNA损伤和生长停滞的能力提示其在动物模型中具有潜在的抗肿瘤活性。在异种移植模型中，可以通过靶向原癌基因启动子中的G-四链体来评估吡啶斯他汀抑制肿瘤生长的能力。该化合物对神经元细胞的影响也提示其可能具有神经毒性，这在任何治疗开发中都需要加以考虑。体内实验方案通常包括腹腔注射或静脉注射吡啶斯他汀，剂量根据初步毒性研究确定。终点指标包括肿瘤生长抑制、DNA损伤标志物评估和组织病理学检查。然而，详细的体内实验方案和疗效数据在公共领域并没有得到广泛报道。

对于G-四链体结合实验，吡啶斯他汀与G-四链体DNA的亲和力可通过荧光光谱法、表面等离子共振（SPR）或等温滴定量热法（ITC）进行测定。将荧光标记或未标记的G-四链体形成寡核苷酸（例如，来自c-kit、K-ras或Bcl-2启动子的寡核苷酸）与不同浓度的吡啶斯他汀（0.001-100 µM）在测定缓冲液（例如，10 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mM KCl）中于25°C孵育。监测荧光变化（如果使用标记的寡核苷酸）或结合引起的SPR或ITC信号变化。解离常数（Kd）由结合等温线计算得出。在选择性测定中，吡啶斯他汀与双链DNA和其他核酸结构进行反应，以评估其对G-四链体的特异性。在DNA损伤测定中，用吡啶斯他汀（1-100 µM）处理癌细胞，并通过免疫荧光或Western blot检测DNA损伤标志物（γ-H2AX、53BP1）。

细胞系：超过 60 种不同的癌细胞系
浓度：10 μM
孵育时间：48 小时
结果：在超过 60 种不同的癌细胞系中，主要积累于细胞周期的 G2 期。
在细胞研究中，将癌细胞（例如乳腺癌、肺癌或其他癌细胞系）培养于含 10% FBS 和抗生素的适宜培养基（RPMI-1640 或 DMEM）中。将细胞接种于 6 孔板或 96 孔板中。将盐酸吡啶斯他汀溶解于 DMSO 中，并用培养基稀释至最终浓度（通常为 0.1-100 µM）。处理细胞 24-72 小时。使用 MTT 或 CellTiter-Glo 法评估细胞活力。使用碘化丙啶染色和流式细胞术进行细胞周期分析。细胞凋亡通过Annexin V/PI染色或caspase-3/7活性检测进行评估。DNA损伤通过γ-H2AX染色和彗星试验进行评估。基因表达变化（例如c-kit、K-ras、Bcl-2）通过qRT-PCR和Western blot进行评估。Src活性检测中，Src磷酸化水平和蛋白水平通过Western blot进行评估。

CB17-SCID小鼠
7.5 mg/kg
静脉注射

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体内异种移植实验[4]
CB17-SCID小鼠（CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl，雄性或雌性）和FVB雌性小鼠购自Charles River Laboratories。小鼠饲养于高效空气微粒过滤器（HEPA）过滤的笼架中，并喂以高压灭菌的实验室啮齿动物饲料。[4]
为了构建源自DLD1和HCT116 BRCA2功能正常或缺陷细胞的异种移植模型，将5 × 10⁶个细胞/只注射到6周龄CB17-SCID雄性小鼠的后腿肌肉中。当肿瘤体积达到约 250 mm³ 时，将小鼠随机分组开始治疗。[4]
为了构建 PARP 抑制剂耐药小鼠肿瘤模型，将 4 × 10⁶ 个 KP3.33 (Brca1 +/+) 细胞或 KB1PM5 (Brca1 −/− Tp53bp1 −/−) 小鼠乳腺肿瘤细胞肌内注射到 6 周龄 FVB 雌性小鼠的后肢肌肉中。每个实验组包含 5 只小鼠。当肿瘤体积达到约 250 mm³ 时，将小鼠随机分组并开始治疗。[4]
为了构建 MDA-MB-436 细胞异种移植瘤，将 4 × 10⁶ 个细胞肌内注射到 6 周龄 CB17-SCID 雌性小鼠的后肢肌肉中。当肿瘤体积达到约 220 mm³ 时（细胞注射后 6 天），开始治疗。每个实验组包含五只小鼠。[4]
他拉唑帕尼（BMN 673，Selleckchem）溶于10%二甲基乙酰胺、6%溶菌醇HS和84% PBS的混合溶液中，以0.33 mg/kg/天的剂量连续口服五天，然后停药两天，再继续治疗五天（Wang et al, 2016）。吡啶斯他汀溶于生理盐水中，以7.5 mg/kg/天的剂量连续静脉注射五天，然后停药两天，再继续治疗五天。 NU-7441（Selleckchem）溶于5% DMSO、40% PEG300和5% Tween-80的混合溶液中，以10 mg/kg/天的剂量腹腔注射，连续给药5天，之后停药2天，再继续给药5天（Zhao等，2006）。紫杉醇溶于生理盐水中，于治疗的第1天和第8天以20 mg/kg/天的剂量静脉注射（Bizzaro等，2018）。与其他化合物联合用药时，紫杉醇于治疗的第5天和第12天静脉注射，吡啶斯他汀和NU-7441分别静脉注射和腹腔注射，连续给药4天，之后停药3天，再继续给药4天。 NU-7441 在给予吡啶斯他汀前 2 小时给药。在指定时间点，使用游标卡尺测量肿瘤的二维体积，并根据肿瘤体积估算肿瘤重量（1 mg = 1 mm³）。采用学生 t 检验（非配对，双尾）进行单组两两比较。当 P < 0.05 时，差异被认为具有统计学意义。小鼠的生存曲线采用 Kaplan-Meier 法绘制，并使用对数秩检验评估统计学意义。数据采用 GraphPad Prism 8.3 软件绘制。[4]

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PDTX 模型构建[4]
前瞻性地收集了携带 gBRCA 基因的乳腺癌患者的新鲜肿瘤样本，用于在机构伦理审查委员会 (IRB) 批准的方案和相关知情同意书下，或由剑桥郡国家研究伦理服务中心 (REC) 批准（REC 参考编号：08/H0308/178）（Bruna 等，2016）移植到小鼠体内。VHI0179 患者来源肿瘤异种移植模型 (PDTX) 由携带 BRCA1 种系截断且因 REV7 突变而对奥拉帕尼耐药的患者乳腺肿瘤构建而成。所有患者均签署了书面知情同意书，实验符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》和美国卫生与公众服务部《贝尔蒙特报告》中规定的原则。将冷冻肿瘤碎片（15–20 mm³）包被Matrigel基质胶，并通过在小鼠下背部一侧皮下小切口植入一只6周龄CB17-SCID雌性小鼠体内。当肿瘤体积达到约400 mm³时，将肿瘤从处死的小鼠体内取出，切成约15–20 mm³的碎片，再次皮下植入14只CB17-SCID雌性小鼠体内。当肿瘤体积达到约200 mm³时，将小鼠随机分为载体组和治疗组，开始治疗。每个实验组包含7只小鼠。
对于体内疗效研究，使用6-8周龄的雌性免疫缺陷小鼠（例如裸鼠或SCID小鼠）。将癌细胞皮下植入小鼠侧腹部。当肿瘤体积达到约100-200 mm³时，将动物随机分为治疗组（每组n = 6-10）。盐酸吡啶斯他汀配制成赋形剂（例如，10% DMSO、40% PEG400、50% PBS 或 0.5% 甲基纤维素），以 1-50 mg/kg 的剂量腹腔注射或静脉注射，通常每日一次或隔日一次给药，疗程为 2-3 周。每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积。监测体重以评估毒性反应。研究结束时，切除肿瘤并进行组织病理学检查、DNA 损伤评估（γ-H2AX 免疫组化）和靶基因表达分析。可采集血样进行药代动力学分析。

由于盐酸吡啶斯他汀是一种研究用化合物，因此其药代动力学数据有限。作为一种小分子G-四链体稳定剂，该化合物预计具有中等的口服生物利用度和组织分布。其代谢可能涉及肝脏CYP450酶，并通过胆汁和肾脏排泄清除。然而，目前尚未有专门的药代动力学研究报道。该化合物主要用于体外研究，不适用于体内药代动力学表征。

盐酸吡啶斯他汀的毒理学数据有限。在细胞实验中，该化合物对细胞活力表现出浓度依赖性影响，高浓度下可观察到细胞毒性。吡啶斯他汀可导致神经突回缩、突触丢失以及神经元细胞剂量依赖性死亡，表明其具有潜在的神经毒性。目前尚未有公开的急性毒性、器官特异性毒性或致突变性数据报道。与所有研究化合物一样，处理盐酸吡啶斯他汀时应采取适当的安全预防措施，包括使用个人防护装备并在通风良好的区域工作。

[1]. Small-molecule-induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 2012;8(3):301-310.

[2]. A single-molecule platform for investigation of interactions between G-quadruplexes and small-molecule ligands. Nat Chem. 2011;3(10):782-787.

[3]. The G-quadruplex DNA stabilizing drug pyridostatin promotes DNA damage and downregulates transcription of Brca1 in neurons. Aging (Albany NY). 2017;9(9):1957-1970.

[4]. Anti-tumoural activity of the G-quadruplex ligand pyridostatin against BRCA1/2-deficient tumours. EMBO Mol Med . 2022 Mar 7;14(3):e14501.

能够稳定端粒DNA G-四链体形成的配体具有作为癌症治疗药物的潜力，因为端粒酶（一种在许多癌细胞中过度表达的酶）无法延长G-四链体结构。因此，了解小分子与这些结构结合的动力学、热力学和力学性质至关重要，但传统的整体分析方法无法同时测量这些性质。本文中，我们利用激光镊子研究了此类相互作用。通过动力学加速，我们观察到吡啶斯他汀促进了端粒G-四链体的折叠。吡啶斯他汀结合的G-四链体机械稳定性增强，使我们能够测定其解离常数K_d为490 ± 80 nM。通过类Hess过程获得的结合自由能变化证实，吡啶斯他汀的K(d)值与上述结果一致，而较弱配体RR110的K(d)值为42 ± 3 µM。我们预期该单分子平台将提供配体结合生物大分子的生物学重要力学、动力学和热力学性质的详细信息。[1]

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富含几内亚碱的DNA序列可在体外形成非沃森-克里克碱基结构，这种结构在人类基因组中普遍存在。然而，这种结构是否正常存在于哺乳动物细胞中一直是几十年来研究的热点。本文表明，G-四链体相互作用药物吡啶斯他汀通过诱导复制和转录依赖性DNA损伤来促进人类癌细胞的生长停滞。染色质免疫沉淀测序分析DNA损伤标记物γH2AX揭示了吡啶斯他汀诱导的损伤位点在基因组中的分布，并表明吡啶斯他汀靶向含有G-四链体序列簇的基因。因此，吡啶斯他汀调控这些基因的表达，包括原癌基因SRC。我们观察到吡啶斯他汀降低了人乳腺癌细胞中SRC蛋白的丰度和SRC依赖的细胞运动能力，证实SRC是该药物的靶点。我们采用了一种无偏倚的方法来确定该药物的基因组作用位点，从而建立了一个发现功能性DNA-药物相互作用的框架。[2] 能够建立潜伏感染的病毒已经进化出独特的机制来逃避宿主的免疫识别。这些病毒的维持蛋白会调节其合成水平，以维持持续感染，但又低于宿主的免疫检测阈值。控制这种病毒潜伏期精细调控的机制尚不清楚。本研究发现，编码γ疱疹病毒维持蛋白的mRNA在其开放阅读框（ORF）内含有成簇的特殊结构元件——G-四链体，这些结构元件负责顺式调控病毒mRNA的翻译。通过研究Epstein-Barr病毒编码的核抗原1（EBNA1）mRNA，我们发现使用反义寡核苷酸破坏G-四链体可增加EBNA1 mRNA的翻译。相反，用G-四链体稳定剂吡啶斯他嗪预处理可降低EBNA1的合成，这凸显了G-四链体在病毒转录本中作为独特的翻译和免疫逃逸调控信号的重要性。此外，这些发现提示了靶向病毒开放阅读框（ORF）RNA结构的新型治疗策略。 [3]

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BRCA1 或 BRCA2 (BRCA1/2) 功能受损会导致复制叉停滞积累，进而造成复制相关的 DNA 损伤和基因组不稳定，这是 BRCA1/2 突变肿瘤的特征。针对 BRCA1/2 突变肿瘤的靶向治疗正是利用了这种脆弱性，通过引入额外的 DNA 损伤来发挥作用。由于 BRCA1 或 BRCA2 缺陷会导致同源重组 (HR) 修复受损，这种损伤对肿瘤细胞具有特异性致死性，但对健康组织无害。近年来，能够结合并稳定 G-四链体 (G4) 的配体作为一类能够选择性清除 BRCA1 或 BRCA2 缺陷细胞和肿瘤的化合物而崭露头角。吡啶斯他汀是一种能够结合 G4 的小分子，在体外对 BRCA1/2 缺陷细胞表现出特异性毒性。然而，其体内活性尚未得到评估。本文证明吡啶斯他汀对BRCA1/2缺陷型肿瘤具有高度特异性活性，包括已获得PARP抑制剂（PARPi）耐药性的患者来源异种移植瘤。机制研究表明，吡啶斯他汀干扰DNA复制，导致DNA双链断裂（DSB），而这些DSB在BRCA1/2缺陷的情况下可通过经典的非同源末端连接（C-NHEJ）途径进行修复。与此一致的是，DNA-PKcs（C-NHEJ激酶活性的核心组分）的化学抑制剂与吡啶斯他汀具有协同作用，可清除BRCA1/2缺陷型细胞和肿瘤。此外，我们还证明，当BRCA1或BRCA2被敲除时，吡啶斯他汀可触发cGAS/STING依赖的先天免疫反应。紫杉醇是一种常用的抗癌化疗药物，它能增强吡啶斯他汀的体内毒性。总之，我们的研究结果表明，吡啶斯他汀是一种适合进一步开发治疗的化合物，可单独使用或与紫杉醇和DNA-PKcs抑制剂联合使用，以造福携带BRCA1/2突变的癌症患者。[4]
盐酸吡啶斯他汀（RR82盐酸盐）是一种合成的小分子G-四链体（G4）DNA稳定剂，其解离常数（Kd）为490 nM。它能选择性地结合G-四链体DNA，并靶向包括c-kit、K-ras和Bcl-2在内的原癌基因。该化合物通过诱导复制和转录依赖性DNA损伤来促进癌细胞的生长停滞。吡啶斯他汀可降低乳腺癌细胞中Src蛋白的丰度和Src依赖性细胞运动能力，并导致神经突回缩和神经元死亡。它是研究G-四链体生物学和癌症治疗的宝贵工具。该化合物仅供研究使用。

C31H37CL5N8O5

778.9411

778.13

1781882-65-2

Pyridostatin;1085412-37-8;Pyridostatin TFA;1472611-44-1

78243739

White to off-white solid

203

10

11

13

49

850

0

C1=CC=C2C(=C1)C(=CC(=N2)NC(=O)C3=CC(=CC(=N3)C(=O)NC4=NC5=CC=CC=C5C(=C4)OCCN)OCCN)OCCN.Cl.Cl.Cl.Cl.Cl

SRIZPFGTXSQRFM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H32N8O5.5ClH/c32-9-12-42-19-15-24(30(40)38-28-17-26(43-13-10-33)20-5-1-3-7-22(20)36-28)35-25(16-19)31(41)39-29-18-27(44-14-11-34)21-6-2-4-8-23(21)37-29;;;;;/h1-8,15-18H,9-14,32-34H2,(H,36,38,40)(H,37,39,41);5*1H

4-(2-aminoethoxy)-2-N,6-N-bis[4-(2-aminoethoxy)quinolin-2-yl]pyridine-2,6-dicarboxamide;pentahydrochloride

RR82 hydrochloride; Pyridostatin hydrochloride; 1781882-65-2; Pyridostatin (hydrochloride); RR82 hydrochloride; 4-(2-aminoethoxy)-2-N,6-N-bis[4-(2-aminoethoxy)quinolin-2-yl]pyridine-2,6-dicarboxamide;pentahydrochloride; Pyridostatin pentahydrochloride; RR-82 hydrochloride; 4-(2-aminoethoxy)-N2,N6-bis[4-(2-aminoethoxy)quinolin-2-yl]pyridine-2,6-dicarboxamide pentahydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O: ~50 mg/mL (~64.2 mM)

配方 1 中的溶解度: 100 mg/mL (128.38 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。