G-quadruplexe ( Kd = 490 nM )
Pyridostatin is a small molecule that binds to G-quadruplex DNA structures. [1]

吡啶格洛汀 (RR82) (10 μM；48 小时) 可诱导细胞周期阻滞 [1]。吡啶格洛汀是一种微小的化学物质，它能选择性地与 DNA 中的 G-四链体结构结合，并与其形成复合物以稳定该结构。吡啶格洛汀可引起剂量依赖性的神经元死亡、神经突回缩和突触丢失。在培养的原代神经元中，吡啶格洛汀会导致 DNA 双链断裂。值得注意的是，吡啶格洛汀 (1–5 μM，过夜) 可下调 BRCA1 蛋白（该蛋白负责保护和修复神经元基因组）的转录 [3]。在 FRET 熔解实验中，吡啶格洛汀及其炔烃类似物（吡啶格洛汀-a）对一组已知的 G-四链体 DNA 基序表现出相似的熔解曲线。 [1]
- SRC基因G-四链体序列的圆二色谱光谱显示在265 nm（平行构象）和/或298 nm（反平行构象）处有特征性的摩尔椭圆率峰值，表明存在折叠的G-四链体结构。[1]
- SRC基因G-四链体序列的核磁共振波谱显示，在10.5至12.5 ppm之间存在亚氨基质子信号，这是堆叠G-四联体中Hoogsteen氢键的特征信号。加入1.1摩尔当量吡啶斯他汀后，观察到整体谱线展宽和亚氨基质子信号向高场位移，这与吡啶斯他汀通过堆叠相互作用与顶部G-四联体结合相一致。 [1]
- 通过铜催化的点击化学反应对吡啶斯他汀-a（炔烃类似物）进行细胞内化学标记，生成荧光标记的吡啶斯他汀（3），该标记物在细胞核内形成聚集灶，并呈现出与核仁染色一致的较大图案。[1]

吡啶斯他汀对 BRCA2 缺陷型异种移植瘤具有抗肿瘤活性[4]
已证实，能够结合并稳定 G4 结构域的化合物对小鼠体内建立的 BRCA1/2 缺陷型异种移植瘤（RHPS4 和 CX-5461）具有活性。然而，这些化合物尚未被证实能够使 BRCA 突变患者获益。此外，BRCA 突变型肿瘤难以治疗，因为它们会迅速对靶向治疗（例如 PARP 抑制剂；PARPi）产生耐药性。因此，亟需寻找新的 G4 配体，不仅能够清除 BRCA 缺陷型肿瘤，还能对抗耐药性疾病。我们之前发表的研究结果（Zimmer 等，2016）表明，G4 配体吡啶斯他汀在体外对 BRCA2 缺陷型细胞具有特异性毒性。本研究评估了吡啶斯他汀在体内清除BRCA2缺陷型异种移植瘤的潜力。为此，研究人员使用同源的BRCA2^+/+（BRCA2功能正常）和BRCA2^-/-（BRCA2缺陷）人结直肠腺癌DLD1细胞，在CB17-SCID小鼠中构建了异种移植瘤（图1A和B）。研究人员对吡啶斯他汀的体内应用条件进行了广泛优化，结果表明，连续5天静脉注射7.5 mg/kg/天，停药2天后再进行5天治疗，该给药方案耐受性良好，表现为无明显体重下降且无不良临床症状（附录表S1）。在这些条件下，研究人员发现吡啶斯他汀能有效且特异性地抑制由BRCA2缺陷型DLD1细胞建立的异种移植瘤的生长（图1B）。作为对照，研究人员使用了PARP抑制剂他拉唑帕尼，该药物因其能够根除小鼠体内BRCA1/2缺陷型肿瘤而为人所知（Shen等，2013），并且最近已获准用于治疗携带BRCA1/2种系突变的转移性乳腺癌患者（Litton等，2018）。吡啶斯他汀对 BRCA2 缺陷型肿瘤的抗肿瘤作用与他拉唑帕尼相似，两种药物均不抑制 BRCA2 功能正常型肿瘤的生长。

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此外，研究人员使用由同源 BRCA2 +/+ 和 BRCA2 −/− 结直肠癌 HCT116 细胞建立的第二个肿瘤模型研究了吡啶斯他汀的体内反应（Xu 等，2014）。吡啶斯他汀对 BRCA2 缺陷型 HCT116 细胞来源的肿瘤表现出选择性毒性（附录图 S1A 和 B；附录表 S2），与它在 DLD1 细胞来源的异种移植瘤中的作用类似。[4]
研究人员之前的研究表明，吡啶斯他汀治疗会导致 HR 修复受损的细胞（包括 BRCA2 缺陷型细胞）中 DNA 损伤的积累（Zimmer 等，2016）。与此一致的是，免疫组织化学 (IHC) 分析显示，BRCA2 缺陷型肿瘤（而非 BRCA2 功能正常的肿瘤）在暴露于吡啶斯他汀或他拉唑帕尼后，DNA 损伤标志物 γH2AX 的水平升高（附录图 S1C-F）。这些结果表明，吡啶斯他汀不仅能特异性地抑制细胞生长（Zimmer等人，2016），还能抑制缺乏BRCA2的肿瘤，并且其在体内的作用机制是通过造成DNA损伤。[4]

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细胞活力检测 [1]
细胞类型： 超过 60 种不同的癌细胞系
测试浓度： 10 μM
孵育时间： 48 小时
实验结果： 主要积累在超过 60 种不同癌细胞系的细胞周期 G2 期。

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用吡啶斯他汀（2 μM，24-72 小时）处理的 MRC5-SV40 成纤维细胞和各种癌细胞系均表现出增殖减少和细胞周期 G2 期积累。 [1]
- 对吡啶斯他汀（2 μM，24–72 h）处理的细胞进行蛋白质印迹分析显示，组蛋白 H2AX（Ser-139，γH2AX）、KAP1（Ser-824）、Chk1（Ser-345）、RPA（Ser-4/8）和 DNA-PKcs（Ser-2056）发生磷酸化，表明 DNA 损伤反应被激活。处理 72 h 后观察到 PARP-1 裂解，表明部分细胞发生凋亡。[1]
- 免疫荧光分析显示，吡啶斯他汀（20 μM，4 h）处理的细胞在 G1、S 和 G2 期均形成 γH2AX 聚集灶。用 DRB（转录抑制剂）预处理可阻止 G1 和 G2 期细胞中 γH2AX 聚集灶的形成；用蚜虫霉素（复制抑制剂）进一步预处理可减少聚集灶。 [1]
- 中性彗星试验证实，吡啶斯他汀（2 μM，24 h）处理的细胞中存在DNA双链断裂；与DNA-PKcs抑制剂NU7441联合处理可增强彗星尾矩。[1]
- 在MRC5-SV40细胞中，吡啶斯他汀（2 μM）处理8 h后，SRC mRNA水平降低>95%，24 h后SRC蛋白水平降低约60%。[1]
- 在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，吡啶斯他汀（2 μM）处理48 h后，划痕试验中伤口愈合能力显著降低，而阿霉素（100 nM）虽然生长抑制作用相似，但对细胞迁移没有影响。 [1]
- 对γH2AX进行染色质免疫沉淀(ChIP)，随后进行高通量测序(ChIP-Seq)，鉴定出吡啶斯他汀诱导的DNA损伤位点富集于含有具有G-四链体形成潜能序列簇的基因体中。[1]
- 在稳定表达GFP-hPif1α的U2OS细胞中，荧光显微镜显示，在药物添加前固定的细胞中，GFP-hPif1α与荧光标记的吡啶斯他汀共定位，表明二者靶向基因组结构存在重叠。[1]

CB17-SCID小鼠
7.5 mg/kg
静脉注射

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体内异种移植实验[4]
CB17-SCID小鼠（CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl，雄性或雌性）和FVB雌性小鼠购自Charles River Laboratories。小鼠饲养于高效空气微粒过滤器（HEPA）过滤的笼架中，并喂以高压灭菌的实验室啮齿动物饲料。[4]
为了构建源自DLD1和HCT116 BRCA2功能正常或缺陷细胞的异种移植模型，将5 × 10⁶个细胞/只注射到6周龄CB17-SCID雄性小鼠的后腿肌肉中。当肿瘤体积达到约 250 mm³ 时，将小鼠随机分组开始治疗。[4]
为了构建 PARP 抑制剂耐药小鼠肿瘤模型，将 4 × 10⁶ 个 KP3.33 (Brca1 +/+) 细胞或 KB1PM5 (Brca1 −/− Tp53bp1 −/−) 小鼠乳腺肿瘤细胞肌内注射到 6 周龄 FVB 雌性小鼠的后肢肌肉中。每个实验组包含 5 只小鼠。当肿瘤体积达到约 250 mm³ 时，将小鼠随机分组并开始治疗。[4]
为了构建 MDA-MB-436 细胞异种移植瘤，将 4 × 10⁶ 个细胞肌内注射到 6 周龄 CB17-SCID 雌性小鼠的后肢肌肉中。当肿瘤体积达到约 220 mm³ 时（细胞注射后 6 天），开始治疗。每个实验组包含五只小鼠。[4]

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Talazoparib（BMN 673，Selleckchem）溶于10%二甲基乙酰胺、6% HS溶液和84% PBS中，以0.33 mg/kg/天的剂量口服给药，连续给药五天，然后停药两天，再给药五天（Wang et al, 2016）。pyridostatin溶于生理盐水中，以7.5 mg/kg/天的剂量静脉注射给药，连续给药五天，然后停药两天，再给药五天。 NU-7441（Selleckchem）溶于5% DMSO、40% PEG300和5% Tween-80的混合溶液中，以10 mg/kg/天的剂量腹腔注射，连续给药5天，之后停药2天，再继续给药5天（Zhao等，2006）。紫杉醇溶于生理盐水中，于治疗的第1天和第8天以20 mg/kg/天的剂量静脉注射（Bizzaro等，2018）。与其他化合物联合用药时，紫杉醇于治疗的第5天和第12天静脉注射，吡啶斯他汀和NU-7441分别静脉注射和腹腔注射，连续给药4天，之后停药3天，再继续给药4天。 NU-7441 在给予吡啶斯他汀前 2 小时给药。在指定时间点，使用游标卡尺测量肿瘤的二维体积，并根据肿瘤体积估算肿瘤重量（1 mg = 1 mm³）。采用学生 t 检验（非配对，双尾）进行单组两两比较。当 P < 0.05 时，差异被认为具有统计学意义。小鼠的生存曲线采用 Kaplan-Meier 法绘制，并使用对数秩检验评估统计学意义。数据采用 GraphPad Prism 8.3 软件绘制。[4]

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PDTX 模型构建[4]
根据机构伦理审查委员会 (IRB) 批准的方案和相关知情同意书，或由剑桥郡国家研究伦理服务中心 (REC) 批准（REC 参考编号：08/H0308/178）（Bruna 等，2016），前瞻性地收集携带 gBRCA 基因突变的乳腺癌患者的新鲜肿瘤样本，用于小鼠移植。VHI0179 患者来源肿瘤异种移植模型 (PDTX) 由携带 BRCA1 种系截断且因 REV7 突变而对奥拉帕尼耐药的患者乳腺肿瘤构建而成。所有患者均签署了书面知情同意书，实验符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》和美国卫生与公众服务部《贝尔蒙特报告》中规定的原则。将冷冻肿瘤组织块（15–20 mm³）包被Matrigel基质胶，并通过在小鼠下背部一侧皮下切口植入一只6周龄CB17-SCID雌性小鼠体内。当肿瘤体积达到约400 mm³时，将肿瘤从处死的小鼠体内取出，切成约15–20 mm³的组织块，再次皮下植入14只CB17-SCID雌性小鼠体内。当肿瘤体积达到约200 mm³时，将小鼠随机分为载体组和治疗组，开始治疗。每个实验组包含7只小鼠。

吡啶斯他汀可诱导人癌细胞DNA损伤和细胞周期阻滞。[1]
- 长期治疗（72小时或更长时间）可导致部分细胞凋亡，PARP-1裂解即为佐证。[1]
- DNA-PKcs缺陷型MO59J细胞对吡啶斯他汀的敏感性高于DNA-PKcs功能正常的MO59K细胞。[1]

[1]. Small-molecule-induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 2012;8(3):301-310. Published 2012 Feb 5.

[2]. A single-molecule platform for investigation of interactions between G-quadruplexes and small-molecule ligands. Nat Chem. 2011;3(10):782-787. Published 2011 Aug 28.

[3]. The G-quadruplex DNA stabilizing drug pyridostatin promotes DNA damage and downregulates transcription of Brca1 in neurons. Aging (Albany NY). 2017;9(9):1957-1970.

吡啶斯他汀是一种高选择性的G-四链体结合小分子，旨在靶向多态性G-四链体结构，不受序列变异的影响。[1]
- 该化合物可诱导复制和转录依赖性的DNA损伤，导致细胞周期阻滞和含有G-四链体形成序列的基因转录下调。[1]
- ChIP-Seq分析表明，吡啶斯他汀靶向含有潜在G-四链体序列簇的基因体，包括原癌基因SRC。[1]
- 吡啶斯他汀降低了乳腺癌细胞中SRC蛋白水平和SRC依赖性细胞运动能力，验证了SRC作为靶点的有效性。[1]
- 该研究基于标记的吡啶斯他汀与固定细胞中G-四链体解旋酶hPif1的共定位，提供了未受干扰的人类细胞中存在预折叠G-四链体结构的证据。 [1]
- 利用铜催化的炔烃-叠氮环加成反应（点击化学）对细胞中的吡啶斯他汀进行荧光标记，从而实现对其定位的可视化。[1]

C35H34N10O7

706.70726

596.249

1085412-37-8

Pyridostatin hydrochloride;1781882-65-2; 1472611-44-1 (TFA salt)

25227847

Typically exists as solid at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

753.8±60.0 °C at 760 mmHg

409.7±32.9 °C

0.0±2.5 mmHg at 25°C

1.726

0.59

202.62

5

11

13

44

850

0

C1=CC=C2C(=C1)C(=CC(=N2)NC(=O)C3=CC(=CC(=N3)C(=O)NC4=NC5=CC=CC=C5C(=C4)OCCN)OCCN)OCCN

VGHSATQVJCTKEF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H32N8O5/c32-9-12-42-19-15-24(30(40)38-28-17-26(43-13-10-33)20-5-1-3-7-22(20)36-28)35-25(16-19)31(41)39-29-18-27(44-14-11-34)21-6-2-4-8-23(21)37-29/h1-8,15-18H,9-14,32-34H2,(H,36,38,40)(H,37,39,41)

4-(2-aminoethoxy)-2-N,6-N-bis[4-(2-aminoethoxy)quinolin-2-yl]pyridine-2,6-dicarboxamide

Pyridostatin; 1085412-37-8; Pyridostain; 4-(2-Aminoethoxy)-N2,N6-bis(4-(2-aminoethoxy)quinolin-2-yl)pyridine-2,6-dicarboxamide; RR-82; RR 82; 4-(2-aminoethoxy)-2-N,6-N-bis[4-(2-aminoethoxy)quinolin-2-yl]pyridine-2,6-dicarboxamide; RR82 hydrochloride;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。