G-quadruplexe ( Kd = 490 nM )

吡格菌素 (RR82)（10 μM；48 小时）可诱导细胞周期停滞 [1]。一种名为吡啶球蛋白的微小化学物质选择性地与 DNA 中的 G-四链体结构结合，与其形成复合物以稳定 DNA。哌啶他汀会引起剂量依赖性神经元死亡、神经突回缩和突触丧失。在培养的原代神经元中，吡格菌素会导致 DNA 双链断裂。值得注意的是，BRCA1 蛋白（保护和修复神经元基因组）会被吡啶球蛋白（1-5 μM，过夜）转录下调 [3]。

Pyridostatin对BRCA2缺陷异种移植物具有抗肿瘤活性[4]
结合和稳定G4s的化合物已被证明对小鼠建立的BRCA1/2缺失异种移植物肿瘤有活性(RHPS4和CX‐5461)。然而，这些尚未被证明对BRCA突变患者有益。此外，BRCA突变的肿瘤很难治疗，因为它们对靶向治疗(例如PARP抑制剂;PARPi)。因此，必须找到新的G4配体，不仅可以消除BRCA缺陷肿瘤，还可以抵抗耐药疾病。我们之前发表的结果(Zimmer et al, 2016)表明，G4配体pyridostatin对体外BRCA2缺陷细胞具有特异性毒性。在这项研究中，研究人员评估了pyridostatin在体内消除BRCA2缺陷异种移植物肿瘤中的潜力。为了解决这个问题，我们使用等基因BRCA2 +/+ (BRCA2‐精通)和BRCA2−/−(BRCA2‐缺乏)人结直肠癌DLD1细胞在CB17‐SCID小鼠中产生异种移植物(图1A和B)。研究人员广泛优化了pyridostatin在体内使用的条件，并确定了7.5 mg/kg/天的剂量计划静脉注射连续5天，然后休息2天，第二个5天的治疗耐受性良好。没有明显的体重减轻，没有不良的临床症状(附录表S1)。在这些条件下，研究人员发现pyridostatin有效且特异性地抑制BRCA2‐缺陷DLD1细胞建立的异种移植物肿瘤的生长(图1B)。作为对照，研究人员使用了PARPi talazoparib，该药物以其根除小鼠BRCA1/2缺失肿瘤的能力而闻名(Shen et al .， 2013)，最近被许可用于携带BRCA1/2种系突变的转移性乳腺癌患者(Litton et al .， 2018)。pyridostatin对BRCA2 -缺陷肿瘤的抗肿瘤作用与talazoparib相似，两种药物都不会损害BRCA2 -精通肿瘤的生长。

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此外，研究人员使用第二种肿瘤模型研究了pyridostatin在体内的反应，该模型是由等基因BRCA2 +/+和BRCA2 - / -结直肠癌HCT116细胞建立的(Xu et al .， 2014)。Pyridostatin显示出对BRCA2缺失HCT116细胞源性肿瘤的选择性毒性(附录图S1A和B;附录表S2)，其作用与DLD1细胞来源的异种移植物相似[4]
研究人员之前的研究表明，pyridostatin治疗会导致HR修复受损的细胞(包括BRCA2缺陷细胞)中DNA损伤的积累(Zimmer等，2016)。一致地，免疫组织化学(IHC)分析显示，BRCA2‐缺乏，但不是BRCA2‐完全，肿瘤在暴露于pyridostatin或talazoparib时显示出DNA损伤标记γH2AX水平增加(附录图S1C-F)。这些结果表明，pyridostatin不仅可以特异性抑制细胞的生长(Zimmer等，2016)，还可以特异性抑制缺乏BRCA2的肿瘤，并通过造成DNA损伤在体内起作用[4]。

细胞活力测定 [1]
细胞类型：超过 60 种不同的癌细胞系
测试浓度： 10 μM
孵育时间： 48小时
实验结果：主要在60多种不同癌细胞系的细胞周期G2期积累。

CB17-SCID 小鼠
\n7.5 mg/kg
\ni.v.

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\n\n体内异种移植实验[4]
\nCB17-SCID 小鼠（CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl，雄性或雌性）和 FVB 雌性小鼠购自 Charles River Laboratories。小鼠饲养于高效空气微粒过滤器 (HEPA) 过滤的笼架中，并喂以高压灭菌的实验室啮齿动物饲料。[4]
\n\n为了构建源自 DLD1 和 HCT116 BRCA2 功能正常或缺陷细胞的异种移植模型，将 5 × 10⁶ 个细胞/只注射到 6 周龄 CB17-SCID 雄性小鼠的后腿肌肉中。当肿瘤体积达到约 250 mm³ 时，将小鼠随机分组开始治疗。[4]
\n\n为了构建 PARP 抑制剂耐药小鼠肿瘤模型，将 4 × 10⁶ 个 KP3.33 (Brca1 +/+) 细胞或 KB1PM5 (Brca1 −/− Tp53bp1 −/−) 小鼠乳腺肿瘤细胞肌内注射到 6 周龄 FVB 雌性小鼠的后肢肌肉中。每个实验组包含 5 只小鼠。当肿瘤体积达到约 250 mm³ 时，将小鼠随机分组并开始治疗。[4]
\n\n为了构建 MDA-MB-436 细胞来源的异种移植瘤，将 4 × 10⁶ 个细胞肌内注射到 6 周龄 CB17-SCID 雌性小鼠的后肢肌肉中。当肿瘤体积达到约 220 mm³ 时（细胞注射后 6 天），开始治疗。每个实验组包含五只小鼠。[4]

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\n\nTalazoparib（BMN 673，Selleckchem）溶于10%二甲基乙酰胺、6% HS溶液和84% PBS中，以0.33 mg/kg/天的剂量口服给药，连续给药五天，然后停药两天，再给药五天（Wang et al, 2016）。吡啶斯他汀溶于生理盐水中，以7.5 mg/kg/天的剂量静脉注射给药，连续给药五天，然后停药两天，再给药五天。 NU-7441（Selleckchem）溶于5% DMSO、40% PEG300和5% Tween-80的混合溶液中，以10 mg/kg/天的剂量腹腔注射，连续给药5天，之后停药2天，再继续给药5天（Zhao等，2006）。紫杉醇溶于生理盐水中，于治疗的第1天和第8天以20 mg/kg/天的剂量静脉注射（Bizzaro等，2018）。与其他化合物联合用药时，紫杉醇于治疗的第5天和第12天静脉注射，吡啶斯他汀和NU-7441分别静脉注射和腹腔注射，连续给药4天，之后停药3天，再继续给药4天。 NU-7441 在给予吡啶斯他汀前 2 小时给药。在指定时间点，使用游标卡尺测量肿瘤的二维体积，并根据肿瘤体积估算肿瘤重量（1 mg = 1 mm³）。采用学生 t 检验（非配对，双尾）进行单组两两比较。当 P < 0.05 时，差异被认为具有统计学意义。小鼠的生存曲线采用 Kaplan-Meier 法绘制，并使用对数秩检验评估统计学意义。数据采用 GraphPad Prism 8.3 软件绘制。[4]

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\n\nPDTX 模型构建[4]
\n前瞻性地收集了携带 gBRCA 基因的乳腺癌患者的新鲜肿瘤样本，用于在机构伦理审查委员会 (IRB) 批准的方案和相关知情同意书下，或由剑桥郡国家研究伦理服务中心 (REC) 批准（REC 参考编号：08/H0308/178）（Bruna 等，2016）移植到小鼠体内。\n\nVHI0179 患者来源肿瘤异种移植模型 (PDTX) 由携带 BRCA1 种系截断且因 REV7 突变而对奥拉帕尼耐药的患者乳腺肿瘤构建而成。所有患者均签署了书面知情同意书，实验符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》和美国卫生与公众服务部《贝尔蒙特报告》中规定的原则。将冷冻肿瘤组织块（15–20 mm³）包被Matrigel基质胶后，通过腰背部一侧皮下切口植入一只6周龄CB17-SCID雌性小鼠体内。当肿瘤体积达到约400 mm³时，将肿瘤从处死的小鼠体内取出，切成约15–20 mm³的组织块，再次皮下植入14只CB17-SCID雌性小鼠体内。当肿瘤体积达到约200 mm³时，将小鼠随机分为载体组和治疗组，开始治疗。每个实验组包含7只小鼠。

[1]. Small-molecule-induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 2012;8(3):301-310. Published 2012 Feb 5.

[2]. A single-molecule platform for investigation of interactions between G-quadruplexes and small-molecule ligands. Nat Chem. 2011;3(10):782-787. Published 2011 Aug 28.

[3]. The G-quadruplex DNA stabilizing drug pyridostatin promotes DNA damage and downregulates transcription of Brca1 in neurons. Aging (Albany NY). 2017;9(9):1957-1970.

C35H34N10O7

706.70726

596.249

1085412-37-8

Pyridostatin hydrochloride;1781882-65-2; 1472611-44-1 (TFA salt)

25227847

Typically exists as solid at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

753.8±60.0 °C at 760 mmHg

409.7±32.9 °C

0.0±2.5 mmHg at 25°C

1.726

0.59

202.62

5

11

13

44

850

0

VGHSATQVJCTKEF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H32N8O5/c32-9-12-42-19-15-24(30(40)38-28-17-26(43-13-10-33)20-5-1-3-7-22(20)36-28)35-25(16-19)31(41)39-29-18-27(44-14-11-34)21-6-2-4-8-23(21)37-29/h1-8,15-18H,9-14,32-34H2,(H,36,38,40)(H,37,39,41)

4-(2-aminoethoxy)-2-N,6-N-bis[4-(2-aminoethoxy)quinolin-2-yl]pyridine-2,6-dicarboxamide

Pyridostatin; 1085412-37-8; Pyridostain; 4-(2-Aminoethoxy)-N2,N6-bis(4-(2-aminoethoxy)quinolin-2-yl)pyridine-2,6-dicarboxamide; RR-82; RR 82; 4-(2-aminoethoxy)-2-N,6-N-bis[4-(2-aminoethoxy)quinolin-2-yl]pyridine-2,6-dicarboxamide; RR82 hydrochloride;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。