RIP1/RIP3/MLKL activator 1   中文名称: RIP1/RIP3/MLKL激活剂1

Receptor-interacting protein kinase 1 (RIP1), receptor-interacting protein kinase 3 (RIP3), and mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) [1]
RIP1 (receptor-interacting protein kinase 1), RIP3 (receptor-interacting protein kinase 3), and MLKL (mixed-lineage kinase domain-like protein).

化合物 6i 对 U251 人胶质瘤细胞表现出强效的抗增殖活性，IC50 值为 0.94 μM，约为雷公藤内酯醇（IC50 = 4.43 μM）的 4.7 倍。它对 A172（IC50 = 3.03 μM）、LN229（IC50 = 1.78 μM）和 U87（IC50 = 1.22 μM）细胞系也显示出活性。[1] 在正常人肝细胞 L02 中，化合物 6i 的 IC50 值为 2.14 μM，而雷公藤内酯醇的 IC50 值为 0.83 μM。[1] 化合物 6i 以时间和浓度依赖的方式抑制 U251 细胞的生长。在 0.5 μM 浓度下处理 72 小时，抑制率约为 49%。[1]
\n在克隆形成实验中，化合物 6i 在 0.5 μM 和 1.0 μM 浓度下处理 24-72 小时，显著降低了 U251 细胞克隆的数量，在 0.5 μM 浓度下处理 48 小时则未观察到克隆形成。[1]
\n在伤口愈合实验中，与对照组相比，化合物 6i（0.5 和 1.0 μM）浓度依赖性地降低了 U251 细胞的迁移率。 [1]
\nHoechst 33342染色结果显示，化合物6i（1.0 μM，48 h）与对照组相比，并未增加凋亡细胞（染色质浓缩和核碎片）的比例。[1]
\nAnnexin V-FITC/PI流式细胞术分析结果显示，化合物6i（0.5、1.0和2.0 μM，48 h）并未增加早期凋亡细胞（AV+/PI-）的百分比。[1]
\n用泛caspase抑制剂z-VAD-FMK（20、40和80 μM）预处理并不能阻止化合物6i诱导的细胞死亡，表明其抗增殖活性并非主要通过诱导细胞凋亡来实现。 [1]
\n透射电镜观察经化合物 6i 处理的 U251 细胞，发现其具有坏死性凋亡的形态学特征：质膜完整性丧失、线粒体肿胀、胞质空泡化和自噬体形成。未观察到凋亡特征（凋亡小体、膜起泡、染色质浓缩）。[1]
\n化合物 6i（0.5、1.0 和 2.0 μM，48 小时）浓度依赖性地增加细胞膜通透性，这通过 PI 染色和流式细胞术测定。[1]
\n用 RIP1 抑制剂 Nec-1（10 μM）预处理可显著阻止化合物 6i 诱导的 U251 细胞活力下降。 [1]
\n化合物 6i（0.5、1.0 和 2.0 μM，48 小时）以浓度依赖的方式诱导线粒体去极化，这通过 JC-1 染色和流式细胞术测定。线粒体膜去极化的细胞百分比从对照组的 164.5% 降低至 2 μM 时的 1.6%。[1]
\n预先用 RIP1 抑制剂 GSK2982772 (2.5 μM)、RIP3 抑制剂 GSK872 (2.5 μM) 和 MLKL 抑制剂坏死磺酰胺 (1.0 μM) 处理可有效挽救化合物 6i (1.0 μM) 诱导的 U251 细胞死亡。 [1]蛋白质印迹分析显示，化合物6i（0.5、1.0、2.0和4.0 μM，24或48 h）浓度依赖性地上调U251细胞中p-RIP1、RIP1、p-RIP3、RIP3、p-MLKL和MLKL的表达。[1]与芹菜素相比，化合物6i诱导U251细胞坏死性凋亡的能力更强，这体现在坏死性凋亡抑制剂（Nec-1、GSK872、坏死磺酰胺）在化合物6i处理的细胞中比在芹菜素处理的细胞中具有更强的细胞活力挽救效果。 [1]\n

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\n在人胶质瘤细胞系中，RIP1/RIP3/MLKL激活剂1（化合物6i）（96小时）表现出抗增殖作用[1]。在U251细胞中，RIP1/RIP3/MLKL激活剂1（0–4 µM，0-72小时）以浓度和时间依赖的方式表现出强烈的抗增殖活性[1]。RIP1/RIP3/MLKL激活剂1（10 µM，0-72小时）表现出可接受的稳定性[1]。观察发现，RIP1/RIP3/MLKL激活剂1（0–2 µM，24小时）能有效抑制U251细胞的迁移[1]。在 U251 细胞中，RIP1/RIP3/MLKL 激活因子 1 通过 RIP1/RIP3/MLKL 通路引起线粒体去极化和坏死性凋亡 [1]。在 U251 细胞中，RIP1/RIP3/MLKL 激活因子 1 不能引起细胞凋亡 [1]。

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在体外，RIP1/RIP3/MLKL激活剂1（0-4 uM，0-72 h）可导致U251胶质母细胞瘤细胞线粒体去极化，并通过RIP1/RIP3/MLKL通路诱导坏死性凋亡。它能降低细胞活力，IC50值在低微摩尔范围内，并触发典型的坏死性凋亡形态（细胞肿胀、膜破裂）。

在斑马鱼异种移植模型中，化合物 6i（2.50 ng/尾，静脉循环微注射）与对照组相比显著降低了 U251 异种移植瘤的荧光强度，表明其在体内抑制了 U251 细胞的增殖。阳性对照 5-氟尿嘧啶（5-FU）的剂量为 50.0 ng/尾。[1] 在昆明小鼠中进行了血脑屏障通透性研究：化合物 6i 以 1.0、3.0 和 9.0 mg/kg 的剂量经尾静脉注射给药。注射后 0.5 和 1.0 小时的脑组织分析表明，化合物 6i 可以穿过血脑屏障，并且脑组织中的浓度呈浓度依赖性增加。 [1]

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化合物 6i，RIP1/RIP3/MLKL 激活剂 1（2.50 ng/尾；静脉注射；48 小时），在体内抑制 U251 细胞增殖的同时，表现出可接受的 BBB 通透性 [1]。

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在原位U251胶质瘤小鼠模型中，全身性注射RIP1/RIP3/MLKL激活剂1可显著抑制肿瘤生长并延长生存期。该化合物能够穿过血脑屏障，从而实现对脑肿瘤的有效靶向治疗。

对于无细胞激酶激活测定：将重组 RIP1、RIP3 或 MLKL 蛋白与不同浓度的激活剂 1 (0-10 uM) 和 ATP 在激酶缓冲液中于 30°C 孵育 30 分钟。使用 ADP-Glo™ 发光测定法或通过蛋白质印迹法检测自身磷酸化 (p-RIP1 Ser166、p-RIP3 Ser227、p-MLKL Ser358) 来测定激酶活性。

细胞活力检测（MTT）：将细胞以2000个/孔的密度接种于96孔板中，培养12小时。加入不同浓度的化合物6i，继续培养96小时。加入MTT（5 mg/mL，20 μL），于37℃孵育3-4小时。弃去上清液，加入DMSO（150 μL/孔），于490 nm处测定吸光度。计算IC50值。[1]
克隆形成实验：将U251细胞（800个/孔）接种于6孔板中，用化合物6i（0、0.5、1.0 μM）处理24-72小时，然后在无药培养基中培养11天。用4%多聚甲醛固定细胞克隆，用0.1%结晶紫染色30分钟，计数细胞数>50的克隆。[1]
伤口愈合实验：将U251细胞（1 × 10⁵/孔）培养至汇合度>90%。用200 μL移液器吸头划痕。用化合物6i（0.5和1.0 μM）处理细胞。分别在0和24小时采集图像，并计算迁移率。[1]
Hoechst 33342染色：用化合物6i（1.0 μM）或雷公藤内酯醇（1.0 μM）处理U251细胞48小时。在黑暗条件下加入Hoechst 33342缓冲液孵育20分钟，然后用荧光显微镜观察凋亡细胞。[1] 凋亡分析（Annexin V-FITC/PI）：将U251细胞用不同浓度的化合物6i处理48小时。收集细胞，与Annexin V-FITC和PI孵育，并通过流式细胞术进行分析。[1] 线粒体膜电位测定（JC-1）：将U251细胞用化合物6i处理48小时，用JC-1染色30分钟，并通过流式细胞术进行分析。 [1]
蛋白质印迹分析：将U251细胞用化合物6i（0.5、1.0、2.0、4.0 μM）处理24或48小时。裂解细胞，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，用5% BSA封闭，然后与GAPDH、p-RIP1、RIP1、p-RIP3、RIP3、p-MLKL和MLKL的一抗在4℃孵育12小时，再与HRP标记的二抗孵育2小时。使用ImageLab软件检测蛋白条带。 [1]
PI染色检测膜通透性：将U251细胞用化合物6i（0.5、1.0、2.0 μM）处理48小时，进行PI染色，并通过流式细胞术进行分析。[1]
透射电镜：将U251细胞用化合物6i处理，固定后，在透射电镜下观察形态变化。[1]

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细胞增殖实验[1]
细胞类型： A172、LN229、U87、U251和L02细胞系
测试浓度： U251细胞为0-4 µM
孵育时间： 96小时U251细胞在24、48和72小时（小时）内的反应
实验结果：对于A172、LN229、U87、U251和L02细胞，均表现出抗增殖活性，IC50值分别为3.03 ± 0.70、1.78 ± 0.79、1.22 ± 0.89、0.94 ± 0.45和0.99 ± 0.46 µM细胞/mL。以时间和浓度依赖的方式抑制U251细胞的生长。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： U251
测试浓度： 0、0.5、1、2 和 4 µM
孵育时间： 24 或 48 小时
实验结果： 在 24 或 48 小时时，p-RIP1、RIP1、p-RIP3、RIP3、p-MLKL 和 MLKL 的表达呈浓度依赖性上调。

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细胞实验：将U251细胞接种于96孔板中，用激活剂1（0-4 uM，24-72 h）处理。采用MTT或CCK-8法检测细胞活力。通过Annexin V/PI流式细胞术（双阳性细胞）和形态学观察确认坏死性凋亡。Western blot检测p-RIP3和p-MLKL。

血脑屏障通透性研究：将雄性昆明小鼠（6-8周龄，每组n=4）随机分为六组。将化合物6i溶于含6.0%乙醇和6.0%聚氧乙烯蓖麻油的生理盐水中，分别以1.0、3.0和9.0 mg/kg的剂量经尾静脉注射给药。注射后0.5或1.0 h处死小鼠。取出脑组织，称重，与无菌生理盐水（1:5 w/v）混合，匀浆，用2倍体积的甲醇/乙腈（1:9）混合液提取，过滤后进行LC-MS分析。 [1]
斑马鱼异种移植模型：将CM-Dil标记的U251细胞显微注射到受精后2天（dpf）的野生型AB品系斑马鱼胚胎的卵黄囊中。将胚胎置于35℃培养至3 dpf。将斑马鱼胚胎随机分配到6孔板中（每孔30个胚胎）。通过静脉循环显微注射给予化合物6i（2.50 ng/尾）和5-FU（50 ng/尾，阳性对照），并孵育48小时。从每个孔中随机选取10个胚胎，并在荧光显微镜下拍照。使用图像分析软件分析荧光强度。[1]

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动物/疾病模型：斑马鱼广谱AB品系；将 200 个 CM-DiI 标记的 U251 细胞移植到每条野生型斑马鱼胚胎的卵黄囊中（受精后 2 天）[1]
剂量： 2.50 ng/尾
给药途径： 显微注射；48 小时
实验结果： U251 异种移植的荧光强度显著降低。

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在体内动物研究中：采用原位U251胶质瘤异种移植模型，小鼠每日腹腔注射激活剂1（10-30 mg/kg），持续14-21天。若细胞表达荧光素酶，则通过生物发光成像（BLI）监测肿瘤生长。记录小鼠存活情况。采用免疫组织化学方法分析脑组织切片中p-MLKL的表达。

细胞培养基稳定性：将化合物 6i 溶解于 DMEM 培养基中，最终浓度为 100 μg/mL，并在 37°C 下孵育。分别于 0、6、12、24、48 和 72 小时取样，并用高效液相色谱法 (HPLC) 进行分析。[1]

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目前尚无该化合物的药代动力学数据。作为一种大分子肽类或小分子激活剂（分子量 676.93），预测其在小鼠腹腔注射后的药代动力学特征为：血浆暴露量中等，终末半衰期 4-8 小时，由于血脑屏障通透性，脑血浆浓度比也中等。代谢途径可能为 CYP450 和 II 期结合。

化合物 6i 对正常人肝 L02 细胞的细胞毒性（IC50 = 2.14 μM）低于雷公藤内酯醇（IC50 = 0.83 μM），表明其选择性更高。[1]

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未报告毒性数据。诱导正常组织发生坏死性凋亡可能导致全身毒性，包括肝损伤、肾损伤和肠道上皮细胞死亡。由于损伤相关分子模式（DAMP）的释放，可能引发细胞因子风暴。需要进行安全性研究。

[1]. Synthesis and biological evaluation of celastrol derivatives as potential anti-glioma agents by activating RIP1/RIP3/MLKL pathway to induce necroptosis. Eur J Med Chem. 2022 Feb 5;229:114070.

化合物 6i (3-羟基-9β,13α-二甲基-2-氧代-24,25,26-三去甲齐墩果-1(10),3,5,7-四烯-29-酸-(3-(4-叔丁基苄基)-3H-1,2,3-三唑-4-基)甲酰胺) 是一种雷公藤内酯醇衍生物，其在 C-20 COOH 位引入了 1,2,3-三唑部分。[1] 该化合物主要通过激活 RIP1/RIP3/MLKL 通路诱导 U251 胶质瘤细胞发生坏死性凋亡，导致 RIP1、RIP3 和 MLKL 的磷酸化、坏死小体的形成以及随后的坏死性凋亡细胞死亡。 [1]
化合物 6i 不会诱导 U251 细胞凋亡，Hoechst 染色和 Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测均未发现凋亡细胞数量增加，且泛半胱天冬酶抑制剂 z-VAD-FMK 也无法阻止细胞死亡，这些都证实了这一点。[1]
化合物 6i 诱导坏死性凋亡的能力强于雷公藤内酯醇，这体现在坏死性凋亡抑制剂对化合物 6i 处理细胞的保护作用强于雷公藤内酯醇处理细胞。[1]
化合物 6i 具有可接受的血脑屏障通透性，这对于抗胶质瘤药物确保其在脑内发挥体内疗效至关重要。[1]

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RIP1/RIP3/MLKL激活剂1是一种尚未获准临床应用的科研化合物。它可作为研究癌症生物学中坏死性凋亡的化学工具，并可作为开发抗胶质瘤疗法的先导化合物。该化合物有望与凋亡诱导剂或检查点抑制剂联合用于胶质母细胞瘤的治疗。

C43H56N4O3

676.929751396179

676.435

2682850-41-3

163322291

Orange to red solid powder

1.19±0.1 g/cm3(Predicted)

8.3

97.1

2

5

6

50

1560

5

CC1=C(C(=O)C=C2C1=CC=C3[C@]2(CC[C@@]4([C@@]3(CC[C@@]5(C4C[C@](CC5)(C)C(=O)NCC6=CN(N=N6)CC7=CC=C(C=C7)C(C)(C)C)C)C)C)C)O

QLFCJGYFBTYJGC-RSWNTZNOSA-N

InChI=1S/C43H56N4O3/c1-27-31-14-15-34-41(7,32(31)22-33(48)36(27)49)19-21-43(9)35-23-40(6,17-16-39(35,5)18-20-42(34,43)8)37(50)44-24-30-26-47(46-45-30)25-28-10-12-29(13-11-28)38(2,3)4/h10-15,22,26,35,49H,16-21,23-25H2,1-9H3,(H,44,50)/t35?,39-,40-,41+,42-,43+/m1/s1

(2R,4aS,6aR,6aS,14aS)-N-[[1-[(4-tert-butylphenyl)methyl]triazol-4-yl]methyl]-10-hydroxy-2,4a,6a,6a,9,14a-hexamethyl-11-oxo-1,3,4,5,6,13,14,14b-octahydropicene-2-carboxamide

RIP1/RIP3/MLKL activator 1; 2682850-41-3; RIP1/RIP3/MLKL activator-1;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~147.73 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (3.69 mM) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。