Skp2 inhibitor C1 (SKPin C1)

S-phase kinase-associated protein 2 (Skp2) [1]
S-phase kinase-associated protein 2 (Skp2) [2]
S-phase kinase-associated protein 2 (Skp2) [3]
S-phase kinase-associated protein 2 (Skp2) (interacts with Skp2/Cks1 E3 ligase complex to block p27 binding,) [4]

体外活性：Skp2抑制剂C1处理MCF-7乳腺癌细胞系并没有增加，而是减少了G1期细胞的百分比，同时增加了G2/M细胞群。用 C1（5 μM，16 小时）处理的 T47D 细胞显示 G1 期增加 (p < 0.0001) 和 S 期减少 (p < 0.0001)，与 p27 蛋白诱导相关。相反，MCF-7 细胞对 C1 的反应是 G1 期显着减少（35%，p < 0.0001）和 G2-M 期增加（43%，p < 0.0001）。这种 G1 减少和 G2/M 停滞与 C1 剂量相关（图 5C 右侧；分别为 p < 0.001 和 p < 0.01），并且与 p27 蛋白水平增加相关。激酶测定：Skp2抑制剂C1处理MCF-7乳腺癌细胞系并没有增加，而是减少了G1期细胞的百分比，同时增加了G2/M细胞群。用 C1（5 μM，16 小时）处理的 T47D 细胞显示 G1 期增加 (p < 0.0001) 和 S 期减少 (p < 0.0001)，与 p27 蛋白诱导相关。相反，MCF-7 细胞对 C1 的反应是 G1 期显着减少（35%，p < 0.0001）和 G2-M 期增加（43%，p < 0.0001）。这种 G1 减少和 G2/M 停滞与 C1 剂量相关（图 5C 右侧；分别为 p < 0.001 和 p < 0.01），并且与 p27 蛋白水平增加相关。细胞测定：用每种抑制剂 (10 μM) 或 0.1% DMSO（媒介物）预处理 501 Mel 细胞系 16 小时。检查放线菌酮半衰期。用 C1（5 μM，16 小时）处理的 T47D 细胞显示 G1 期增加 (p < 0.0001) 和 S 期减少 (p < 0.0001)，与 p27 蛋白诱导相关。相反，MCF-7 细胞对 C1 的反应是 G1 期显着减少（35%，p < 0.0001）和 G2-M 期增加（43%，p < 0.0001）。这种 G1 减少和 G2/M 停滞与 C1 剂量相关（图 5C 右；分别为 p < 0.001 和 p < 0.01），并与 p27 蛋白水平增加相关（图 5E 左，S4A 右上）。

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1. 10 μM的SKPin C1可显著抑制多发性骨髓瘤（MM）U266和RPMI 8226细胞的活力，且抑制作用随剂量增加而增强；50 μM的SKPin C1在12小时内仅轻微降低正常B淋巴细胞的活力。与正常B淋巴细胞相比，U266和RPMI 8226细胞中Skp2表达水平更高，p27表达水平更低。SKPin C1处理或Skp2敲低可通过阻止p27泛素化来提高U266和RPMI 8226细胞中p27蛋白水平，进而减慢细胞周期、抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡（通过MTT、EdU染色、细胞周期检测、蛋白质免疫印迹、免疫沉淀实验验证）。[1]
2. C1（Skp2抑制剂）在体外筛选（悬尾实验、强迫游泳实验、社交互动实验）中，于5 mg/kg和10 mg/kg剂量下（1 mg/kg剂量无此效果）对雌雄小鼠均表现出抗抑郁样作用；5 mg/kg C1以24小时内三次给药方式（测试前24、5、1小时）可在无应激小鼠中诱导抗抑郁样作用，而急性给药（测试前1小时）无此效果；C1与氟西汀联合给药对无应激小鼠的抑郁样行为产生累加效应，且C1对小鼠自主活动能力无影响。[2]
3. C1在体外可选择性抑制Skp2介导的p27泛素化，其机制为结合Skp2-Cks1结合界面（由Skp2-R294、Skp2-Y346、Cks1-R44、Cks1-Q52构成）并减少p27与Skp2的结合；10 μM C1可提高转移性黑色素瘤细胞系（501 Mel、SK-MEL-147、SK-MEL-173）中p27蛋白水平及半衰期，诱导细胞周期阻滞（501 Mel细胞阻滞于G1期，MCF-7细胞阻滞于G2/M期，T47D细胞阻滞于G1期），且对E2-Ubc3/E2-Ubc5泛素转移、CyclinE/CDK2介导的p27磷酸化、非靶向E3连接酶（MDM2、SCF-βTrCP）无抑制作用。[3]
4. C1可提高子宫内膜癌ECC-1细胞和原代子宫内膜癌（ECA）细胞中p27蛋白水平；与特异性提高核内p27的C2/C20不同，C1可同时提高ECC-1细胞胞质和核内的p27水平；C1可抑制原代ECA细胞（III/III级和I/III级肿瘤）的增殖。[4]

通过尾悬试验（TST）、强迫游泳试验（FST）和社交互动试验（SIT），Skp2抑制剂C1（5 mg/kg和10 mg/kg；24小时内3次：24、5和测试前 1 小时）显示了长期治疗后的小鼠模型中的抗抑郁样作用。 [2]

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1. 5 mg/kg C1（Skp2抑制剂）长期处理可改善慢性社会挫败应激小鼠的抑郁样行为，表明其在应激条件下具有抗抑郁样作用。[2]

1. 体外泛素化实验：通过体外转录翻译生成重组蛋白（野生型/突变型Skp2、Cks1、p27）；实验体系包含UBE1、His-UbcH3/His-UbcH5c、泛素、ATP，以及50 μM C1或溶媒，30℃孵育60分钟；加入非变性样品缓冲液（含/不含β-巯基乙醇）终止反应，通过蛋白质免疫印迹检测p27多聚泛素化水平。[3]
2. 泛素充电实验：将UBE1（100 nM）、His-UbcH3（10 ng/μl）与泛素（2.5 μg/μl）、ATP（2 mM）、10 μM C1或溶媒混合，30℃孵育60分钟；通过蛋白质免疫印迹分析E2充电活性，证实C1无抑制作用。[3]
3. 差示扫描荧光法：将重组His-6Skp1-Skp2-Cks1（1.5 μM）与75 μM C1、非匹配化合物（UM-C1）或溶媒（0.5% DMSO）预孵育；以0.06℃/s的升温速率（20-85℃）检测荧光（激发波长465 nm，发射波长580 nm）并计算熔解温度（Tm），结果显示C1可改变Skp2-Cks1复合物的Tm值（C1处理组48.51℃ vs 溶媒组44.09℃，UM-C1组45.06℃）。[3]
4. 表面等离子体共振（SPR）实验：采用纯化的Skp2-Cks1复合物验证C1与该复合物的结合作用。[3]

细胞系：THP-1、U266、RPMI 8226 和 B 淋巴细胞
浓度：0、5、10、25 和 50 μM
孵育时间：12 小时、24 小时、36 小时和 48 小时< br> 结果：10 μM 浓度下，U266 和 RPMI 8226 细胞活力显着降低 12 小时。
50 μM 浓度下，对 B 细胞活力没有明显影响。
THP-1 细胞活力在 12 小时内降低。 50 μM 12 小时。

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1. 多发性骨髓瘤细胞实验：将正常B淋巴细胞、THP-1、U266、RPMI 8226细胞暴露于不同剂量的SKPin C1中48小时；不同时间点通过MTT法检测细胞活力；处理12小时后通过流式细胞术分析细胞周期；采用蛋白质免疫印迹检测Skp2、p27、剪切型caspase-3蛋白水平；通过免疫沉淀实验检测p27泛素化水平；对25 μM SKPin C1或Skp2 siRNA处理的U266/RPMI 8226细胞，采用EdU染色评估细胞增殖情况。[1]
2. 黑色素瘤细胞实验：将501 Mel、SK-MEL-147、SK-MEL-173细胞用10 μM C1或溶媒处理16小时；制备全细胞提取物，通过蛋白质免疫印迹检测p27、p21、Skp2、Skp1、Cul1水平；采用环己酰亚胺追踪实验（20 ng/ml环己酰亚胺）评估p27半衰期（C1处理后从1小时延长至>5小时）；利用慢病毒四环素诱导型shRNA（shSkp2/shp27）敲低Skp2/p27，随后用10 μM C1处理16小时，通过流式细胞术分析细胞周期。[3]
3. 乳腺癌/前列腺癌细胞实验：将MCF-7、T47D（乳腺癌）和LNCaP（前列腺癌）细胞分别用5 μM（MCF-7/T47D）或10 μM（LNCaP）C1处理16小时；通过流式细胞术分析细胞周期（MCF-7细胞阻滞于G2/M期，T47D/LNCaP细胞阻滞于G1期）；采用蛋白质免疫印迹检测p27、Skp2、Skp1水平。[3]
4. 子宫内膜癌细胞实验：将ECC-1细胞用C1 处理18小时；进行亚细胞组分分离（核/胞质），通过蛋白质免疫印迹检测p27水平（以α-微管蛋白/特异性蛋白1作为组分纯度对照）；采用MTS实验评估C1对细胞增殖的抑制作用；利用超分辨荧光定位显微镜量化核内p27簇（密度无数值变化，簇面积增加1.8倍）。[4]
5. 原代ECA细胞实验：将原代ECA细胞（I/I级、III/III级、I/III级、II/III级肿瘤）用C1 处理；通过蛋白质免疫印迹检测总细胞裂解液/核-胞质组分中的p27水平；采用MTS实验评估增殖抑制作用。[4]

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1. Antidepressant effect assay in mice: Male/female mice (strain not specified) were administered C1 at doses of 1, 5, 10 mg/kg via unspecified route; acute administration (1 h before test) and chronic administration (8 days treatment) were tested; three administrations within 24 h (24, 5, 1 h before test) were used for stress-naïve mice; chronic social defeat stress-exposed mice were treated with 5 mg/kg C1 for long-term to evaluate depression-like behaviors (tail suspension test, forced swimming test, social interaction test); locomotor activity was measured to exclude non-specific effects. [2]
2. Endometrial epithelial cell proliferation assay in mice: Ovariectomized C57Bl/6 mice were primed with 100 ng 17-β-estradiol (E2) intramuscularly for 2 days, followed by 2 days rest; mice were injected intraperitoneally with C1 (dose not reported) or vehicle for 2 consecutive days, euthanized 24 h later; immunohistochemistry (IHC) was performed on endometrial tissue to detect p27 (nuclear) and PH3 (proliferation marker) levels (no data for C1 in this assay, only C5/C2 reported). [4]

1. 50 μM SKPin C1 only marginally decreased the viability of normal B lymphocytes within 12 h, showing low in vitro toxicity to normal cells. [1]
2. C1 (5, 10 mg/kg) had no effect on locomotor activity in mice, indicating no acute toxic effects related to motor function; (LD50, hepatotoxicity, nephrotoxicity, plasma protein binding) reported. [2]
3. C1 (10 μM) was not cytotoxic to 501 Mel, MCF-7, T47D, LNCaP cells. [3]
4. C1 was not cytotoxic to ECC-1 cells (no cell viability reduction, no apoptosis detected by PARP1/caspase-3 cleavage). [4]

[1]. Braz J Med Biol Res. 2019;52(5):e8412.

[2]. Behav Pharmacol. 2021 Feb 1;32(1):62-72.

[3]. Chem Biol. 2012 Dec 21; 19(12)

[4]. 1515–1524.;Endocrinology.2013 Nov;154(11):4030-45.

1. SKPin C1 is a Skp2 inhibitor previously confirmed to have an inhibitory effect on metastatic melanoma cells; it acts as a potent inhibitor against aberrant proliferation and immortalization of multiple myeloma by stabilizing p27 (preventing ubiquitination) to slow cell cycle and induce apoptosis. [1]
2. C1 is a specific Skp2 inhibitor; inhibition of Skp2 may be a potential strategy for depression treatment, and Skp2 may be a target for novel antidepressant development; C1 has additive effects with fluoxetine in alleviating depression-like behaviors. [2]
3. C1 is a small molecule inhibitor identified via in silico virtual ligand screening (VLS) targeting the Skp2-Cks1 interface (pocket formed by Skp2-R294, Skp2-Y346, Cks1-R44, Cks1-Q52); it blocks Skp2-mediated p27 degradation by competitively inhibiting the Skp2-p27 interaction, with cell cycle arrest effects dependent on cell type (G1 in melanoma/prostate/endometrial cancer cells, G2/M in breast cancer cells). [3]
4. C1 is a Skp2/Cks1 E3 ligase inhibitor (Skp2E3LI) that stabilizes p27 (both nuclear and cytoplasmic) in endometrial carcinoma cells, inhibits E2-induced p27 degradation and cell proliferation; it has potential therapeutic value for endometrial cancer characterized by SCF-Skp2/Cks1-mediated nuclear p27 destruction, with advantages over general proteasome inhibitors. [4]

C18H13BRN2O4S2

465.34

463.95

C, 46.46; H, 2.82; Br, 17.17; N, 6.02; O, 13.75; S, 13.78

432001-69-9

5733396

White to yellow solid powder

3.646

137.12

1

7

6

27

631

0

S=C(S/1)N(CC2=CN=CC=C2)C(C1=C\C(C=C(Br)C=C3)=C3OCC(O)=O)=O

O=C(O)COC1=CC=C(Br)C=C1/C=C(SC(N2CC3=CC=CN=C3)=S)/C2=O

InChI=1S/C18H13BrN2O4S2/c19-13-3-4-14(25-10-16(22)23)12(6-13)7-15-17(24)21(18(26)27-15)9-11-2-1-5-20-8-11/h1-8H,9-10H2,(H,22,23)/b15-7-

2-[4-Bromo-2-[[4-oxo-3-(3-pyridinylmethyl)-2-thioxo-5-thiazolidinylidene]methyl]phenoxy]acetic acid

MDK-1699; MDK 1699; MDK1699; Skp2 inhibitor C1 and SKPin C1.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO :20.83~ 93 mg/mL ( 44.76~199.85 mM )

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 5% DMSO + Corn oil: 1.2mg/ml

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。