SR8278

REV-ERBα(EC50 = 0.47 μM)
REV-ERBα (NR1D1) and REV-ERBβ (antagonist activity) [1]

REV-ERBα (NR1D1) [2]

SR8278 对 REV-ERBα 转录抑制的 EC50 值为 0.47 μM[1]。SR8278 的结构与激动剂相似，但在共转染实验中，SR8278 能阻断 GSK4112 增强 REV-ERBα 依赖性抑制的能力。此外，GSK4112 抑制参与糖异生的 REV-ERBα 靶基因的表达，而 SR8278 则刺激这些基因的表达。因此，SR8278 是一种独特的化学工具，可用于探测 REV-ERB 的功能，并可作为进一步优化开发 REV-ERB 拮抗剂的起点，从而探索其在昼夜节律和代谢功能方面的作用[1]。在利用 HEK293 细胞进行的 GAL4-REV-ERB 共转染实验中，SR8278 (10 μM) 增强了报告基因的表达，这可能是通过阻断内源性激动剂血红素的作用实现的，表明其具有拮抗活性。相反，激动剂 GSK4112 则增强了这种抑制作用。 [1]

在转染了全长 REV-ERBα 和在 Bmal1、PEPCK 或 G6Pase 启动子控制下的荧光素酶报告基因的 HEK293 细胞中，用 SR8278 (10 μM) 处理可增强报告基因的表达，这与 GSK4112 观察到的抑制作用相反。[1]
在 Bmal1-荧光素酶/REV-ERBα 共转染实验中，SR8278 呈剂量依赖性地抑制 REV-ERBα 的转录抑制活性 (EC50 = 0.47 μM)。[1]
在用 5 μM GSK4112 处理的细胞的共转染实验中，增加 SR8278 的剂量可消除激动剂的活性，IC50 为 0.35 μM，并且由于 SR8278 阻断了血红素的作用，活性高于基线水平。 [1]
在对6-OHDA损伤小鼠的VTA多巴胺能神经元进行FISH分析时，显微注射SR8278（20 μg/只小鼠）显著降低了CT00（黎明）时Rev-erba mRNA的表达，并恢复了其节律性转录；同时，SR8278还降低了CT00时Nurr1 mRNA的水平，并在CT12时上调了其水平。[2]
在对6-OHDA损伤小鼠的VTA组织进行ChIP实验时，显微注射SR8278通过降低CT00时REV-ERBα与TH启动子R/N位点的结合亲和力，恢复了其结合亲和力。相反，SR8278处理通过增加CT00时NURR1与R/N位点的结合亲和力，挽救了其结合亲和力。[2]

在6-OHDA损伤小鼠中，SR8278（缓慢微量注射；20 μg/只）可恢复情绪相关行为的昼夜节律，并以昼夜节律依赖的方式发挥抗抑郁和抗焦虑作用[1]。缓慢微量注射（SR8278；20 μg/只）可富集REV-ERBα和NURR1识别的R/N基序，同时恢复这两种蛋白与酪氨酸羟化酶启动子的结合活性[1]。

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SR8278对REV-ERBα活性的药理学抑制可恢复帕金森病小鼠模型的昼夜节律情绪相关行为。SR8278微量注射可改变腹侧被盖区（VTA）中剩余的多巴胺能神经元特异性Rev-erbα和Nurr1转录水平。 SR8278 微注射可恢复黎明时分腹侧被盖区 (VTA) 中 REV-ERBα 和 NURR1 结合活性与酪氨酸羟化酶 (TH) 启动子和 TH 蛋白水平之间的拮抗性串扰。SR8278 治疗可诱导黎明时分 REV-ERBα 和 NURR1 结合基序的富集。[3] 在 6-羟基多巴胺 (6-OHDA) 损伤的帕金森病小鼠模型中，向 VTA 微注射 SR8278 (20 μg/只) 可显著抑制 CT22-01（黎明时分）强迫游泳试验 (FST) 和悬尾试验 (TST) 中小鼠不动时间的增加，表明 SR8278 在此特定昼夜节律时间点具有抗抑郁作用。 [2] 在同一模型中，向腹侧被盖区 (VTA) 微量注射 SR8278 (20 μg/只小鼠) 可增加 CT22-01 时高架十字迷宫 (EPM) 测试中小鼠进入开放臂的持续时间和频率，表明其在黎明时具有抗焦虑作用。[2] 在 6-OHDA 损伤的小鼠中，蛋白质印迹分析显示，SR8278 治疗可使 CT00（黎明）时 VTA 中的酪氨酸羟化酶 (TH) 蛋白水平恢复至与载体对照组小鼠相当的水平。[2]

稳定性[2]
测定了SR8278在血浆中的长期稳定性（-80 °C，10天）和三次冻融循环稳定性。稳定性以不同操作后的浓度与初始浓度的比值表示。

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在GAL4-REV-ERB共转染实验中，将HEK293细胞与嵌合受体共转染，嵌合受体由GAL4的DNA结合域与REV-ERBα或REV-ERBβ融合而成，同时转染含有GAL4结合位点的荧光素酶报告基因。加入内参Renilla荧光素酶作为标准化对照。用10 μM化合物处理细胞，并在处理后24小时测定荧光素酶活性。REV-ERB的抑制作用依赖于血红素。由于血红素是一种内源性激动剂，因此阻断该活性的化合物被认为是拮抗剂。 [1]
在ChIP实验中，从每组两只动物中分别收集包含SN和VTA的脑组织，并在指定时间点进行收集。将染色质剪切、预清除，并在4°C下用抗REV-ERBα或抗NURR1抗体进行免疫沉淀过夜。使用蛋白G磁珠收集免疫复合物。使用TaqMan通用PCR预混液和针对TH启动子R/N位点的特异性引物组进行qPCR，以确定结合活性，结果以占总输入染色质的百分比表示，并以对照组进行标准化。[2]

HEK293细胞在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于37℃、5% CO2条件下培养。HepG2细胞在添加10%胎牛血清的最低必需培养基（MEM）中，于37℃、5% CO2条件下培养和常规扩增。转染前24小时，将HepG2细胞以15 × 10³个细胞/孔的密度接种于96孔板中。转染采用Lipofectamine™ 2000（Invitrogen）试剂进行。转染16小时后，用载体或化合物处理细胞。处理24小时后，使用Dual-Glo™荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性。所示数值为四个独立转染孔的平均值±标准误差。实验至少重复三次。 REV-ERBα 和报告基因构建体已在文献[1]中描述。

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HEK293 细胞在添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO2 条件下培养。转染前 24 小时接种细胞。转染采用脂质体转染试剂进行。转染 16 小时后，用载体或化合物处理细胞。处理 24 小时后，使用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。所有数值均代表来自四个独立转染孔的平均值 ± 标准误差。[1]
HepG2 细胞在添加 10% 胎牛血清的最低必需培养基中，于 37°C、5% CO2 条件下培养。实验中，细胞在转染前 24 小时以 15,000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中。转染方法与 HEK293 细胞类似。为了进行mRNA表达分析，HepG2细胞用10 μM的SR8278或溶剂（DMSO）处理24小时后，收集细胞进行总RNA提取、cDNA合成和定量PCR（QPCR）。基因表达以环孢亲和素mRNA进行标准化。[1]
对于小鼠脑切片的荧光原位杂交（FISH），将包含腹侧被盖区（VTA）的新鲜冷冻冠状切片（14 μm厚）固定于4%多聚甲醛中，经乙醇脱水，并风干。组织在室温下用蛋白酶预处理10分钟。分别使用特异性探针（Mm-Th-C3、Mm-Nr4a2-C1、Mm-Nr1d1-C2）检测酪氨酸羟化酶（TH）、Nurr1和Rev-erba mRNA。探针杂交和扩增在40°C下使用商业试剂盒进行。使用共聚焦显微镜采集图像，并使用 ImageJ 软件对 TH+ 神经元中的 mRNA 颗粒进行计数。[2]

动物/疾病模型： 6-OHDA损伤小鼠[1]
剂量： 20 μg/只小鼠
给药途径： 缓慢微量注射；20 μg/只小鼠
实验结果： 6-OHDA损伤小鼠的情绪相关行为缺陷得到恢复。腹侧被盖区（VTA）中残存的多巴胺能神经元特异性REV-ERBα和Nurr1转录水平发生改变。REV-ERBα和NURR1结合活性的恢复与VTA中酪氨酸羟化酶（TH）启动子和TH蛋白水平的拮抗性串扰有关。黎明诱导 REV-ERBα 和 NURR1 结合基序的富集。

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SR8278 的局部注射 [3]
在每次行为学测试前 3 小时，于昏暗红光下将 SR8278 局部注射到中脑腹侧被盖区 (VTA)。我们遵循先前报道的时间安排，进行动物操作和在行为学测试前 3 小时缓慢微量注射 SR8278 到 VTA。SR8278 溶解于乙醇中，浓度为 50 µg/µL。使用连接 10 µL Hamilton 注射器的 33 号注射套管，以 0.1 µL/min 的速率将 SR8278（20 µg/只小鼠）或相应的溶剂（乙醇）直接微量注射到 VTA 中。对于微量输注，小鼠用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉，固定在立体定位仪上，单侧植入26号不锈钢套管至中脑腹侧被盖区（VTA）（AP −3.2 mm，ML −0.5 mm，DV −3.5 mm）。每个引导套管内插入一根32号假套管以防止堵塞。将固定螺钉植入颅骨后，用树脂水泥将整个装置固定在颅骨上。[3]

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药代动力学研究[2]
在给予SR8278之前，按照先前发表的方法，将套管插入颈静脉，用于注射制剂和采集血液。在进行颈静脉手术前，使用麻醉混合液（氯胺酮 50 mg/mL、赛拉嗪 3.3 mg/mL 和乙酰丙嗪 3.3 mg/mL）对大鼠进行麻醉，并在手术后皮下注射卡洛芬[2]。
通过颈静脉插管，以 2 mg/kg 的剂量向大鼠注射 SR8278。分别于给药后 5、10、15、30、45 分钟以及 1、1.5、2、4 和 6 小时，从颈静脉插管抽取血样（200 μL）。每次取样时，均用等体积的生理盐水补充抽取的血液。血液样本立即在 4 °C 下离心，以分离血浆和血细胞，血浆样本储存在 −80 °C 直至分析。[2]

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对于 6-OHDA 诱导的帕金森病小鼠模型，雄性 C57BL/6J 小鼠接受单侧纹状体内注射 6-OHDA（15 μg 溶于 1.0 μL 含 0.02% 抗坏血酸的 0.9% 生理盐水中），注射部位为左侧背侧纹状体。注射后约 5 周，将小鼠置于持续黑暗 (DD) 环境中 3-4 天。局部给药时，将 SR8278 溶于乙醇中，配制成 50 μg/μL 的溶液，然后在行为学测试前 3 小时，使用注射器以 0.1 μL/min 的速率将 20 μg/只小鼠的 SR8278 微量注射到腹侧被盖区 (VTA)。行为学测试（悬尾实验、强迫游泳实验、高架十字迷宫实验）在特定昼夜节律时间（CT22-01 或 CT10-13）的昏暗红光下进行。[2]
大鼠药代动力学研究采用雄性 Sprague Dawley 大鼠（200-250 g）。通过腹腔注射 30 mg/kg 链脲佐菌素 (STZ) 建立糖尿病大鼠模型，使血糖水平 >11.1 mmol/L 并持续 7 天。将导管插入颈静脉，用于化合物给药和血液采集。通过颈静脉导管给予大鼠 2 mg/kg 的 SR8278 。分别于给药后 5、10、15、30、45 分钟以及 1、1.5、2、4 和 6 小时抽取血样（200 μL）。通过离心分离血浆，并储存于 -80°C 直至分析。[3]

使用WinNonlin 3.3软件，采用三室模型计算了SR8278的药代动力学参数，结果见表4。各时间点的预测浓度如图5所示。如图所示，预测浓度与实测值接近，表明三室药代动力学模型与数据拟合良好。静脉给药后，正常大鼠和糖尿病大鼠体内SR8278的初始浓度（C0）分别为2410.25 ± 202.36 ng/mL和3742.11 ± 1300.21 ng/mL。较低的血浆药物浓度可能是由于药物快速分布到除中央室以外的其他室所致。 SR8278在正常大鼠和糖尿病大鼠体内的分布容积（V）分别为44401.58 ± 2106.63 mL/kg和43516.94 ± 22982.75 mL/kg。此外，由于其消除速率常数（K10）较快，SR8278的消除半衰期（t1/2）也极短，在正常大鼠体内仅为0.17 ± 0.084 h，在糖尿病大鼠体内仅为0.11 ± 0.04 h。SR8278在正常大鼠和糖尿病大鼠体内的AUC值分别为608.33 ± 295.25 ng·h/mL和598.59 ± 276.92 ng·h/mL。SR8278血药浓度低和清除迅速可能是其临床应用的主要障碍。 [2] 在-80 °C下保存10天以及经历三次冻融循环后，评估了SR8278在血浆中的稳定性（表3）。各种稳定性测试后，所有样品的回收率均在90.82%至95.75%之间，表明SR8278在血浆样品中于储存条件下稳定。此外，我们还测定了SR8278在50%甲醇溶液中室温保存24小时后的稳定性。结果表明，SR8278在50%甲醇溶液中稳定超过24小时（表3），足以完成测定。方法验证参数（包括回收率和活性）的良好结果也表明SR8278在样品制备和分析过程中保持稳定。[2]

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采用经验证的分析方法测定了SR8278在正常大鼠和糖尿病大鼠体内的药代动力学行为。图5显示了两组大鼠血浆中SR8278的平均浓度-时间曲线。静脉注射SR8278（2 mg/kg）后，糖尿病大鼠在所有时间点的血浆SR8278浓度均略高于正常大鼠。然而，这些差异无统计学意义，表明糖尿病对SR8278的体内行为没有影响。[2] SR8278的药代动力学性质较差，这可能限制其在生化和细胞分析中的应用。[1] 我们建立了一种UPLC-MS/MS方法来定量大鼠血浆中的SR8278。该方法的线性范围为30-3000 ng/mL，定量限（LOQ）为6 ng/mL。日间和日内变异系数均在10%以内。 [3]
在大鼠中静脉注射2 mg/kg后，正常大鼠的初始血浆浓度（C0）为2410.25 ± 202.36 ng/mL，糖尿病大鼠为3742.11 ± 1300.21 ng/mL。正常大鼠的消除半衰期（t1/2）为0.17 ± 0.08 h，糖尿病大鼠为0.11 ± 0.04 h。正常大鼠的血浆浓度-时间曲线下面积（AUC）为608.33 ± 295.25 ng·h/mL，糖尿病大鼠为598.59 ± 276.92 ng·h/mL。正常大鼠的清除率 (CL) 为 3330.83 ± 1609.48 mL/kg·h，糖尿病大鼠的清除率为 3364.81 ± 1111.38 mL/kg·h。正常大鼠的分布容积 (V) 为 44,401.58 ± 2106.63 mL/kg，糖尿病大鼠的分布容积为 43,516.94 ± 22,982.75 mL/kg。正常大鼠和糖尿病大鼠的药代动力学参数无显著差异。[3]

[1]. Identification of SR8278, a synthetic antagonist of the nuclear heme receptor REV-ERB. ACS Chem Biol. 2011 Feb 18;6(2):131-4.

[2]. A validated ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method to identify the pharmacokinetics of SR8278 in normal and streptozotocin-induced diabetic rats. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2016 May 1;1020:142-7.

[3]. Pharmacological Rescue with SR8278, a Circadian Nuclear Receptor REV-ERBα Antagonist as a Therapy for Mood Disorders in Parkinson's Disease. Neurotherapeutics. 2022 Mar;19(2):592-607.

昼夜节律与代谢紊乱之间存在关联。活性成分SR8278与核受体Rev-erb（哺乳动物昼夜节律系统的主要调节因子）竞争性结合并抑制其活性，从而调节机体的代谢。然而，我们对SR8278的药代动力学(PK)特征的了解仍然有限。本文介绍了一种灵敏且可重复的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法，用于体内SR8278的定量分析。SR8278的线性范围和定量限(LOQ)分别为30–3000 ng/mL和6 ng/mL。日间和日内变异系数均在10%以内。该UPLC-MS/MS方法已成功用于表征正常大鼠和糖尿病大鼠静脉注射2 mg/kg剂量SR8278后的药代动力学行为。正常大鼠和糖尿病大鼠的SR8278药代动力学参数未见显著差异。具体而言，正常大鼠和糖尿病大鼠SR8278的血浆浓度-时间曲线下面积（AUC）、初始血浆浓度（C0）、消除半衰期（t1/2）和清除率（CL）分别为608.33 ± 295.25 vs. 598.59 ± 276.92 ng·h/mL、2410.25 ± 202.36 vs. 3742.11 ± 1300.21 ng/mL、0.17 ± 0.08 vs. 0.11 ± 0.04 h和3330.83 ± 1609.48 vs. 3364.81 ± 1111.38 mL/kg·h。总之，我们首次成功建立并验证了一种UPLC-MS/MS方法，该方法具有线性范围宽、定量限低、样品用量少（10 μL）、分析速度快（4 min）和回收率高（>80%）等优点。该方法还用于阐明SR8378在大鼠体内的药代动力学特征。SR8378在正常大鼠和糖尿病大鼠中表现出相同的药代动力学行为，表明糖尿病可能对SR8378在体内的分布、代谢和/或消除影响甚微或无影响，这对未来的临床研究具有重要意义。[2] 帕金森病是一种以多巴胺能神经元进行性丢失为特征的神经退行性疾病。帕金森病患者的运动障碍已得到充分证实，但包括与昼夜节律紊乱相关的情绪障碍在内的非运动症状也是常见的特征。一种常见的现象是“日落综合征”，其特征是神经精神症状在特定时间（黄昏）出现，导致生活质量严重下降。本研究旨在阐明帕金森病日落综合征的潜在机制及其与生物钟的分子联系。我们发现，作为帕金森病小鼠模型的6-羟基多巴胺（6-OHDA）损伤小鼠仅在黎明时分（相当于人类的黄昏）表现出抑郁和焦虑样行为的增加。在6-OHDA损伤小鼠中，给予REV-ERBα拮抗剂SR8278后，其以昼夜节律依赖的方式发挥抗抑郁和抗焦虑作用，恢复了情绪相关行为的昼夜节律。 6-OHDA损伤会改变多巴胺能特异性受体Rev-erbα和Nurr1的转录，以及REV-ERBα和NURR1（酪氨酸羟化酶启动子区域的上游核受体）的非典型结合活性。SR8278治疗恢复了REV-ERBα和NURR1与酪氨酸羟化酶启动子的结合活性，并诱导了REV-ERBα和NURR1识别的R/N基序的富集，ATAC测序证实了这一点；因此，在注射6-OHDA的小鼠腹侧被盖区，酪氨酸羟化酶的表达升高，尤其是在黎明时分。这些结果表明，REV-ERBα是一个潜在的治疗靶点，其拮抗剂SR8278有望成为治疗与昼夜节律紊乱相关的情绪障碍（例如帕金森病中的日落综合征）的潜在药物。 [3]

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SR8278是一种核血红素受体REV-ERB的合成拮抗剂，其结构与激动剂GSK4112相似。[1]
SR8278是一种独特的化学工具，可用于在细胞模型中研究REV-ERB的功能，并可能成为进一步优化以开发更有效拮抗剂的起点。[1]
在帕金森病小鼠模型（6-OHDA损伤）中，SR8278的给药以昼夜节律依赖性方式（在黎明时分）发挥抗抑郁和抗焦虑作用，表明其具有治疗与昼夜节律紊乱相关的情绪障碍（例如日落综合征）的潜力。 [2]
糖尿病（链脲佐菌素诱导）可能对体内SR8278的分布、代谢和/或消除几乎没有影响，因为其在正常大鼠和糖尿病大鼠中的药代动力学行为相似。[3]

C18H19NO3S2

361.47

361.081

C, 59.81; H, 5.30; N, 3.87; O, 13.28; S, 17.74

1254944-66-5

1254944-66-5

53393127

White to light yellow solid powder

3.538

100.15

0

5

5

24

473

0

UIEBLUZPSFAFOC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H19NO3S2/c1-3-22-18(21)14-10-12-6-4-5-7-13(12)11-19(14)17(20)15-8-9-16(23-2)24-15/h4-9,14H,3,10-11H2,1-2H3

ethyl 2-{[5-(methylsulfanyl)thiophen-2-yl]carbonyl}-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylate

SR8278; SR 8278; ethyl 2-{[5-(methylsulfanyl)thiophen-2-yl]carbonyl}-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylate; ethyl 2-(5-methylsulfanylthiophene-2-carbonyl)-3,4-dihydro-1H-isoquinoline-3-carboxylate; CHEMBL4754504; ethyl 2-(5-(methylthio)thiophene-2-carbonyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylate; SR-8278

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~276.64 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。