4-Hydroxyretinoic acid   中文名称: 4-羟基全反式维甲酸

UDP-glucuronosyltransferase, cytochrome P-450 isozyme[1]; RAR, RXR-alpha[2]

报告中，我们研究了atRA氧化产物通过葡萄糖醛酸化的生物转化。为此，我们合成了放射性和非放射性形式的4-Hydroxyretinoic acid/4-羟基-RA（4-OH-RA）、4-羟基-乙酸芳酯（4-OH-RTAC）和5,6-环氧-RA，所有这些都是atRA氧化的主要产物。对人肝微粒体和人重组UDP-葡糖醛酸基转移酶（UGTs）对这些维甲酸的葡糖醛酸化进行了表征，并与atRA的葡糖酰化进行了比较。人肝微粒体葡萄糖醛酸化4-OH-RA和4-OH-RAc的活性分别比atRA高6倍和3倍。对葡萄糖醛酸化产物的分析表明，4-OH-RA的羟基连接的葡萄糖醛酸化物 划译 这表明全反式维甲酸（atRA）通过氧化途径形成极性更强的代谢产物限制了其生物活性。在本报告中，我们研究了atRA氧化产物通过葡萄糖醛酸化的生物转化。为此，我们合成了放射性和非放射性形式的4-Hydroxyretinoic acid/4-羟基-RA（4-OH-RA）、4-羟基-乙酸芳酯（4-OH-RTAC）和5,6-环氧-RA，所有这些都是atRA氧化的主要产物。对人肝微粒体和人重组UDP-葡糖醛酸基转移酶（UGTs）对这些维甲酸的葡糖醛酸化进行了表征，并与atRA的葡糖酰化进行了比较。人肝微粒体葡萄糖醛酸化4-Hydroxyretinoic acid/4-OH-RA和4-OH-RAc的活性分别比atRA高6倍和3倍。对葡萄糖醛酸化产物的分析表明，4-OH-RA和4-OH-RAc的羟基连接的葡萄糖醛酸是主要产物，而与atRA、4-氧代-RA和5,6-环氧-RA形成的羧基连接的葡萄糖酸相反。我们还确定，人重组UGT2B7可以在RA、4-OH-RA和4-OH-RAc上葡萄糖醛酸化，其活性与人肝微粒体中发现的活性相似。因此，我们假设这种在人类肝脏、肾脏和肠道中表达的人类同工酶在atRA的生物学命运中起着关键作用。我们还提出，atRA通过细胞色素P450（CYP26）诱导自身的氧化代谢，并通过UGT介导的途径进一步生物转化为葡糖苷酸[1]。

视黄酸通过细胞色素P-450同工酶代谢为活性较低的代谢产物4-羟基视黄酸。研究了药理学剂量的视黄酸对皮肤中视黄酸水平和细胞色素P-450活性的影响。在封闭状态下，将含有0.1%视黄酸的乳膏或单独的乳膏局部应用于成人皮肤四天。用角膜刀切除治疗区域，并从每次活检中分离出微粒体部分。与单独用体内乳膏处理部位的微粒体体外孵育相比，3H-维甲酸与体内维甲酸处理部位的微粒体体外温育导致其转化为4-羟基维甲酸的比例增加了4.5倍（P=0.0001，n=13）。这种细胞色素P-450介导的活性是氧和NADPH依赖性的，被5微M酮康唑抑制68%（P=0.0035，n=8），被一氧化碳抑制51%（P=0.02，n=6）。将单个视黄酸受体（RAR）或维甲酸X受体α（RXR-alpha）和含有视黄酸反应元件的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告质粒共转染到CV-1细胞中，以确定视黄酸及其代谢产物刺激CAT活性的ED50值。RA治疗组织中全反式和13-顺式RA的水平大于用这些化合物对所有三种RAR测定的ED50值。此外，RXRα的全反式RA水平高于ED50，而4-OH RA水平高于RARβ和RARγ的ED50，但低于RARα和RXRα。这些数据表明，治疗过的皮肤中有足够量的视黄酸来激活RAR和RXRα的基因转录[2]。

人肝微粒体[1]
实验中使用的人肝微粒体来自一名死于脑出血的56岁男子（HLM15）和一名死于大脑损伤的13岁女孩（HLM18）。这些样本来自荷兰格罗宁根大学。HLM通过为重组UGT提供比较基础，作为葡萄糖醛酸化测定的对照。

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人重组UGTs[1]
如前所述，人重组UGT1A3在哺乳动物表达系统中表达。如前所述，UGT2B7在人胚胎肾（HK293）细胞中表达。如前所述制备富集的内质网膜组分。膜组分在-80°C下储存在5 mm HEPES、0.25 m蔗糖、20 mm MgCl2（pH 7.4）中。在这些条件下，重组UGT蛋白的酶活性可持续长达6个月。

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酶分析[1]
以放射性和未标记形式的atRA和4-OH-RA作为苷元，UDP-GlcUA作为糖供体（图1所示的类维生素A结构），测量UGT活性。所有维甲酸底物均以Brij 58（0.12%）的混合胶束形式制备。Brij 58胶束既能激活酶，又能溶解类维生素A。试验中使用了人肝微粒体和重组UGT（50μg蛋白质）。所有酶测定均在黄光下进行。形成的产物的量小于添加的总底物的10%，并且与添加的微粒体蛋白的量成线性比例。将类维生素a衍生物（终浓度0.10 mm）在100 mm HEPES NaOH、pH 7.5、5 mm MgCl2、5 mm糖内酯和0.05%Brij 58中孵育，最终体积为60μl。在开始反应之前，将反应混合物与蛋白质在室温下预孵育10分钟，然后加入50 mm UDP-GlcUA用于放射性类维生素A（终浓度4.17 mm）或20 mm[14C]-UDP GlcUA（终浓度3.33 mm）用于未标记的类维生素A。将反应物在37°C下孵育30分钟。用20μl乙醇停止反应，涡旋并置于冰上。对于TLC，将60μl反应混合物施加到19通道硅胶TLC板（Baker Si250 PA（19C）；VWR Scientific），之后将板干燥并在氯仿-甲醇-冰醋酸-水（65:25:2:4，v/v）中显影两次。这些TLC条件允许分离羧基和羟基连接的葡糖苷酸。显影后，将板干燥，并在-80°C下进行3-7天的放射自显影。

Metabolism / Metabolites
4-Hydroxyretinoic acid is a known human metabolite of Tretinoin.

[1]. 4-hydroxyretinoic acid, a novel substrate for human liver microsomal UDP-glucuronosyltransferase(s) and recombinant UGT2B7. J Biol Chem. 2000 Mar 10;275(10):6908-14.

[2]. Human skin levels of retinoic acid and cytochrome P-450-derived 4-hydroxyretinoic acid after topical application of retinoic acid in vivo compared to concentrations required to stimulate retinoic acid receptor-mediated transcription in vitro. J Clin Invest. 1992 Oct;90(4):1269-74.

All-trans-4-hydroxyretinoic acid is a retinoid that consists of all-trans-retinoic acid bearing a hydroxy substituent at position 4 on the cyclohexenyl ring. It has a role as a human metabolite. It is a retinoid and a secondary allylic alcohol. It is functionally related to an all-trans-retinoic acid. It is a conjugate acid of an all-trans-4-hydroxyretinoate.
4-Hydroxyretinoic acid has been reported in Homo sapiens with data available.

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The K m for the formation of the carboxyl-linked glucuronide of atRA is in the low micromolar range (1.3–1.5 μm) both for HLM15 and recombinant UGT2B7. The maximal catalytic rates (V max) for atRA, as determined with HLM15 and recombinant UGT2B7, are 764 and 523 pmol glucuronidated × min−1 × mg protein−1, respectively. These correspond to catalytic efficiencies (V max/K m) of 509 μl x min−1 × mg -1 for HLM15 and 402 μl × min−1 × mg–1 for recombinant UGT2B7, revealing significant efficiency of formation of atRA carboxyl-linked glucuronide. The K m values for 4-OH-directed glucuronidation are 273 and 221 μm for HLM15 and recombinant UGT2B7, respectively. Typical V maxvalues were determined to be in the low nanomolar range (2176 and 1709 pmol × mg−1 × min−1 for HLM15 and recombinant 2B7, respectively), leading to a much lower efficiency of formation for the hydroxyl-linked glucuronides, as shown by aV max/K m of 8 μl x min−1 × mg–1 for both HLM15 and recombinant UGT2B7. In general, the presence of the hydroxyl group in the retinoid moiety switches the site of glucuronidation from carboxyl to hydroxyl and reverses the affinity of the UGT(s) involved. The corresponding catalytic efficiencies (V max/K m) were several hundredfold higher for glucuronidation of the carboxyl function of atRA than for glucuronidation of the 4-OH moiety of the hydroxylated retinoid.

Of the UGT isoforms investigated to date, human recombinant UGT2B7 has the highest capacity to glucuronidate atRA and 4-OH-RA. UGT2B7 activities toward atRA and 4-OH-RA are similar to the reported activities in human liver microsomes, suggesting that UGT2B7 plays a key role in metabolizing atRA and 4-OH-RA to the carboxyl-linked RAG and the hydroxyl-linked 4-OH-RAG. UGT2B7 is capable of catalyzing the biosynthesis of the hydroxyl-linked glucuronide when 4-OH-RA is the substrate or the carboxyl-linked glucuronide when atRA is the substrate. Recent studies on glucuronidation of steroid hormones and fatty acids by UGT2B7 have shown that this isoform is actively involved in the formation of both hydroxyl- and carboxyl-linked glucuronides of those lipophilic substrates (30). Taken collectively, retinoids, steroid hormones, and fatty acids are important ligands involved in initiating cellular signaling events. We postulate that UGT2B7 may be involved in controlling intracellular levels of ligands, such as steroids and atRA. If this is the case, it may also be involved in a feedback loop that controls the amounts of ligands available for steroid and retinoid receptors.

In summary, we speculate that atRA induces its own oxidative metabolism via a cytochrome P450, CYP26, mechanism followed by a UGT-dependent mechanism. The hydroxyl-linked glucuronide of 4-OH-RA is the directed product of atRA metabolism by CYP26. Thus, 4-OH glucuronidation of 4-OH-RA terminates the biological activity of atRA, while the carboxyl-linked glucuronide of atRA might be a biologically active compound involved in cellular processes. Thus, CYP26 and UGT2B7 may together play a crucial role in the metabolism and biological fate of atRA. [1]

C20H28O3

316.43

316.204

66592-72-1

6438629

White to yellow solid powder

1.075g/cm3

506.5ºC at 760 mmHg

274.2ºC

1.574

4.573

57.53

2

3

5

23

598

0

CC1=C(C(CCC1O)(C)C)/C=C/C(=C/C=C/C(=C/C(=O)O)/C)/C

KGUMXGDKXYTTEY-FRCNGJHJSA-N

InChI=1S/C20H28O3/c1-14(7-6-8-15(2)13-19(22)23)9-10-17-16(3)18(21)11-12-20(17,4)5/h6-10,13,18,21H,11-12H2,1-5H3,(H,22,23)/b8-6+,10-9+,14-7+,15-13+

(2E,4E,6E,8E)-9-(3-hydroxy-2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)-3,7-dimethylnona-2,4,6,8-tetraenoic acid

4-Hydroxyretinoic acid; all-trans-4-hydroxyretinoic acid; 4-hydroxy-Retinoic acid; Retinoic acid, 4-hydroxy-; 4-OH-retinoate; GT84HX78DR; 4-hydroxy-Retinoate; ...; 66592-72-1;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。