REV-ERBα(IC50 = 790 nM); REV-ERBβ(IC50 = 560 nM)

在表达嵌合 Gal4 DNA 结合域 (DBD) - REV-ERB 配体结合域 (LBD) α 或 β 和 Gal4 响应性荧光素酶报告基因的 HEK293 细胞中（REV-ERBα IC50=790 nM，REV-ERBβ IC50=560 nM） , SR9011 剂量依赖性地增强 REV-ERB 依赖性阻遏物活性。在使用全长 REV-ERBα 和 Bmal1 启动子驱动的荧光素酶报告基因的共转染测试中，SR9011 (IC50=620 nM) 有效且有效地抑制转录。 SR9011 以依赖于 REV-ERBα/β 的方式抑制 HepG2 细胞中 BMAL1 mRNA 的表达[1]。此外，SR9011 还可抑制乳腺癌细胞系的生长，无论其 ER 或 HER2 状态如何。 SR9011 似乎可以在乳腺癌细胞进入 M 期之前停止其细胞周期。由于细胞周期蛋白 A (CCNA2) 是 REV-ERB 的直接靶基因，因此细胞周期停滞可能是通过 SR9011 降低该细胞周期蛋白表达来介导的。 SR9011 治疗后 G0/G1 期细胞增加以及 S 和 G2/M 期细胞减少意味着 REV-ERB 激活可能导致从 G1 到 S 期和/或从 S 到 G2/M 期的转变减少[2] 。

由于 SR9011 表现出相当大的血浆暴露量，因此在六天内给予不同剂量 SR9011 的小鼠肝脏中研究了对 REV-ERB 敏感的基因表达。作为 REV-ERB 靶基因，纤溶酶原激活剂抑制剂 1 型基因 (Serpine1) 在 SR9011 的作用下表现出剂量依赖性表达减少。还证明，随着 SR9011 浓度的增加，REV-ERB 反应基因胆固醇 7α-羟化酶 (Cyp7a1) 和甾醇反应元件结合蛋白 (Srepf1) 受到剂量依赖性抑制。在 D:D 环境中 12 天后，小鼠在 CT6 处单次注射 SR9011 或载体，这代表 Rev-erbα 的最大表达。注射媒介物后昼夜节律运动活动没有变化。然而，在受试者黑暗阶段，单剂量的 SR9011 会导致运动活动减少。正常活动恢复到下一个昼夜节律周期与药物在二十四小时内清除是一致的。 SR9011 依赖性减少永久黑暗小鼠轮跑行为的功效 (ED50=56 mg/kg) 与 SR9011 介导的 REV-ERB 反应基因 Srebf1 体内抑制作用相当 (ED50=67毫克/千克）[1]。

在这项研究中，研究人员开发了两种REV-ERBα/β激动剂，它们具有足够的血浆/脑暴露，可以在体内评估其效果。SR9009和SR9009（图1a，补充图1）均剂量依赖性地增加了在表达嵌合Gal4 DNA结合结构域（DBD）-REV-ERB配体结合结构域α或β和Gal4反应性萤光素酶报告子的HEK293细胞中评估的REV-ERB依赖性阻遏物活性（图1b）（SR9009:REV-ERBαIC50=670 nM，REV-ERBβIC50=800 nM；SR9011:REV-ERB a IC50=790 nM，REV-ERBβIC50=560 nM）。REV-ERB配体GSK4112（补充图2）没有暴露于血浆中，其活性有限（图1b）。在使用全长REV-ERBα以及由Bmal1启动子驱动的萤光素酶报告子的共转染试验中，SR9011和SR9009均有效地抑制了转录（图1c）（SR9009 IC50=710 nM；SR9011 IC50=620 nM）。SR9011和SR9009以REV-ERBα/β依赖的方式抑制HepG2细胞中BMAL1 mRNA的表达（补充图3）。与这两种化合物作为REV-ERB的直接激动剂的作用一致，我们注意到，使用生化分析，这些化合物增加了NCoR的CoRNR盒肽片段的募集（补充图4）。SR9009与REV-ERBα的直接结合也通过圆二色谱分析得到证实（补充图5）（Kd=800 nM）。这两种化合物都没有在其他核受体上表现出活性12,13（补充图6）[1]。

萤光素酶测定[2]
HEK293细胞在37°C、5%CO2的条件下，在添加了10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中维持。转染前24小时，细胞以15 X 103个细胞/孔的密度铺在96孔板上。转染后8小时，用SR9011或DMSO处理细胞。治疗后24小时，使用Dual-GloTM萤光素酶测定系统测量萤光素酶活性。所示值代表三个独立转染孔的平均值±S.E。实验重复三次，并显示了代表性实验。

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细胞培养、复合治疗、过表达和敲除[2]
MCF10A、MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-361、SKBR3、BT474来自ATCC。在处理前一天将细胞铺在6孔板中。用SR9011或DMSO处理细胞24小时，并收获用于RNA分离或蛋白质印迹。对于过表达，将细胞用腺病毒感染24小时，然后切换到常规生长培养基。24小时后，收获细胞以分离总RNA。对于敲除试验，对照siRNA、人REV-ERBβsiRNA按照制造商的说明通过反向转染用LipofectamineTM RNAiMAX转染。24小时后，收集细胞进行定量PCR分析。

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MTT法[2]
根据制造商手册进行3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）细胞增殖试验。简而言之，在96孔板上每孔镀3×10~3至5×10~3个细胞。24小时后，用SR9011或DMSO处理细胞。处理72小时后，用1.2mM MTT标记细胞并孵育4小时。然后加入DMSO，在540nm的平板读数仪上读取读数。

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HEK293细胞在96孔板（1×106/孔）中生长，并使用Lipofectamine进行瞬时转染。每个孔用总共200ng的DNA转染细胞，所述DNA由pGL4-mIL-17萤火虫荧光素酶报告构建体、pGL4-mIL-17+CNS-5萤火虫荧光酶报告构建体或pGL4-mIL17-2kB RORE突变体（100ng/孔）、肌动蛋白启动子肾形莲子荧光素酶报告物（50ng/孔）以及单独的对照载体或测试DNA（50ng/孔的全长RORα或全长RORγ）组成。特异性测定中代表了所有48种人类核受体，SR9009在20μM的浓度下进行了测试。该检测的形式是HEK293细胞中Gal4 DNA结合结构域核受体融合的共转染检测[1]。

For circadian gene expression experiments male C57BL6 mice (8–10 weeks of age) were either maintained on a L:D (12h:12h) cycle or on constant darkness. At circadian time (CT) 0 animals were administered a single dose of 100 mg/kg SR9009 or SR9011 (i.p.) and groups of animals (n=6) were sacrificed at CT0, CT6, CT12 and CT18. Gene expression was determined by real time QPCR.[1]

[1]. Regulation of circadian behaviour and metabolism by synthetic REV-ERB agonists. Nature. 2012 Mar 29;485(7396):62-8.

[2]. Anti-proliferative actions of a synthetic REV-ERBα/β agonist in breast cancer cells. Biochem Pharmacol. 2015 Aug 15;96(4):315-22.

Synchronizing rhythms of behaviour and metabolic processes is important for cardiovascular health and preventing metabolic diseases. The nuclear receptors REV-ERB-α and REV-ERB-β have an integral role in regulating the expression of core clock proteins driving rhythms in activity and metabolism. Here we describe the identification of potent synthetic REV-ERB agonists with in vivo activity. Administration of synthetic REV-ERB ligands alters circadian behaviour and the circadian pattern of core clock gene expression in the hypothalami of mice. The circadian pattern of expression of an array of metabolic genes in the liver, skeletal muscle and adipose tissue was also altered, resulting in increased energy expenditure. Treatment of diet-induced obese mice with a REV-ERB agonist decreased obesity by reducing fat mass and markedly improving dyslipidaemia and hyperglycaemia. These results indicate that synthetic REV-ERB ligands that pharmacologically target the circadian rhythm may be beneficial in the treatment of sleep disorders as well as metabolic diseases.[1]

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REV-ERBα and REV-ERBβ are nuclear receptors that are ligand-dependent transcriptional repressors. Heme is the natural ligand for these receptors, but several synthetic agonists and antagonists have been designed recently. The gene that encodes REV-ERBα, NR1D1, is closely associated with ERBB2, the gene that encodes the HER2 oncogene, which is amplified in HER2(+) breast cancers. We examined the effect of a synthetic REV-ERB agonist, SR9011, on a range of estrogen receptor positive (ER(+)), ER(-), HER2(+), HER2(-) and triple negative breast cancer cell lines. We found that SR9011 suppressed proliferation of the breast cancer cell lines regardless of their ER or HER2 status. SR9011 had no effect on MCF10A cell proliferation. SR9011 appears to pause the cell cycle of the breast cancer cells prior to M phase. Cyclin A (CCNA2) was identified as a direct target gene of REV-ERB suggesting that suppression of expression of this cyclin by SR9011 may mediate the cell cycle arrest. These data indicate that synthetic REV-ERB ligands may hold utility in treatment of diseases associated with uncontrolled cellular proliferation such as cancer.[2]

C23H32CL2N4O3S

515.50

514.157

2070014-94-5

SR9011;1379686-29-9

119081411

Light yellow to brown solid powder

110

2

5

10

33

600

0

ADTZBBQVEUEODS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H31ClN4O3S.ClH/c1-2-3-4-12-25-23(29)27-13-11-19(16-27)15-26(14-18-5-7-20(24)8-6-18)17-21-9-10-22(32-21)28(30)31;/h5-10,19H,2-4,11-17H2,1H3,(H,25,29);1H

3-[[(4-chlorophenyl)methyl-[(5-nitrothiophen-2-yl)methyl]amino]methyl]-N-pentylpyrrolidine-1-carboxamide;hydrochloride

R9011 hydrochloride; SR9011 (hydrochloride); 2070014-94-5; 3-[[(4-chlorophenyl)methyl-[(5-nitrothiophen-2-yl)methyl]amino]methyl]-N-pentylpyrrolidine-1-carboxamide;hydrochloride;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ≥ 32 mg/mL (62.08 mM)
H2O: < 0.1 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。