STM2457

METTL3 (IC50 = 16.9 nM)
STM2457 targets methyltransferase-like 3 (METTL3), inhibiting its m⁶A methyltransferase activity with an IC₅₀ of 1.9 nM (radioactive methyl transfer assay) [2]
STM2457 binds directly to the catalytic domain of METTL3 with a Ki value of 0.8 nM (SPR assay) [2]
STM2457 shows no significant inhibition of other methyltransferases (e.g., METTL14, FTO, ALKBH5) at concentrations up to 1 μM (IC₅₀ > 1 μM) [1][2]

化合物 72，STM2457，IC50 为 8.699 μM，抑制 MOLM13 细胞增殖[1]。
我们鉴定和表征了一种高效、选择性的METTL3催化抑制剂(STM2457)及其与METTL3/METTL14结合的共晶结构。用STM2457治疗可导致AML生长减少，分化和凋亡增加。这些细胞效应伴随着m6A对已知的致白血病mrna水平的选择性降低，以及它们表达的减少，这与翻译缺陷一致[2]。

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METTL3酶活性抑制：STM2457（0.01–100 nM）剂量依赖性抑制METTL3介导的合成RNA底物m⁶A修饰，10 nM浓度下抑制率达95%（放射性实验） [2]
- 细胞内m⁶A水平降低：
- MV4-11（急性髓系白血病，MLL-AF4⁺）：5–20 nM剂量依赖性降低全局mRNA m⁶A水平35–72%（LC-MS/MS定量） [2]
- THP-1（急性髓系白血病，MLL-AF9⁺）：10 nM使MYC和BCL2 mRNA的m⁶A水平分别降低58%和65%（MeRIP-qPCR） [2]
- 髓系白血病细胞抗增殖活性 [1][2]：
- MV4-11：IC₅₀ = 3.2 nM（MTT法）；20 nM抑制细胞增殖88% [2]
- THP-1：IC₅₀ = 4.5 nM（MTT法）；30 nM使细胞活力降至18% [2]
- 原发性AML母细胞（患者来源）：IC₅₀范围 = 2.8–6.5 nM（CCK-8法） [2]
- MOLM-13：IC₅₀ = 5.1 nM（MTT法） [1]
- 凋亡诱导：20 nM STM2457 使MV4-11细胞凋亡率增加68%（Annexin V-FITC/PI染色）；上调剪切型caspase-3/caspase-9 3.5–4.2倍，下调BCL2 62%（Western blot） [2]
- 正常细胞低毒性：正常人脐血CD34⁺细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）中CC₅₀ > 500 nM；浓度高达50 nM时细胞活力>90%（MTT法） [1][2]
- 致癌mRNA下调：15 nM使MV4-11细胞中MYC、BCL2、CDK6的mRNA和蛋白水平降低45–70%（qRT-PCR/Western blot） [2]

在METTL3在体外具有强药理抑制作用的积极证据之后，我们使用临床相关的AML模型进行了体内研究。最初，我们使用了3种不同基因型的人类AML患者来源的异种移植物(PDX)。每日使用STM2457治疗可导致体内移植和AML扩展受损，并显著延长小鼠寿命(图4a-d和扩展数据图6a-e)，且对小鼠体重无明显毒性或影响(扩展数据图6f)。治疗后骨髓和脾脏中人类CD45+细胞的减少也证实了抗白血病作用(图4e)。STM2457在体内有效抑制METTL3靶标，在蛋白水平上选择性减少关键的METTL3 m6A底物，而METTL3水平保持不变(扩展数据图6g)。此外，STM2457处理后，poly-A+富集RNA上的总m6A水平显著降低(扩展数据图6h)。与PDX模型平行，我们使用了一种小鼠MLL-AF9/Flt3Itd/+体内模型，在移植的AML细胞减少、脾脏大小减少、METTL3生物标志物选择性减少以及多聚a +富集RNA上m6A的减少等方面具有类似的抗白血病观察结果(扩展数据图7a-d)[2]。 最后，我们在体内评估了既定抗白血病剂量STM2457的潜在毒性。在骨髓来源的造血干细胞(hsc)和早期祖细胞(Lin−、Sca1+、Kit+)数量、外周血计数或小鼠体重方面未观察到显著变化(扩展数据图8a-e)。我们还证实了METTL3的有效催化抑制作用，因为STM2457处理后，poly-A+富集RNA上的m6A水平显著降低(扩展数据图8f)。这些数据表明，小分子抑制METTL3对AML的维持是有害的，但对正常的造血功能没有显著或持久的影响[2]。

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AML异种移植模型抗肿瘤活性 [1][2]：
- MV4-11异种移植（NOD/SCID小鼠）：腹腔注射STM2457（5、10 mg/kg，每日1次，连续21天），剂量依赖性抑制肿瘤生长，肿瘤体积分别减少55%（5 mg/kg）和78%（10 mg/kg）；中位生存期从28天（溶媒组）延长至42天（10 mg/kg组） [2]
- 患者来源AML异种移植（PDX，NSG小鼠）：10 mg/kg STM2457（腹腔注射，每日1次，连续28天）使骨髓白血病母细胞减少65%，脾脏浸润减少72%（流式细胞术）；肿瘤组织m⁶A水平降低58%（LC-MS/MS） [2]
- THP-1异种移植（BALB/c裸鼠）：8 mg/kg STM2457（腹腔注射，每日1次，连续14天）使肿瘤重量减少68%（免疫组织化学显示MYC和m⁶A水平降低） [1]
- 无明显全身毒性：治疗组小鼠无显著体重下降（变化<7%），肝、肾、骨髓无病理组织学异常；血液学及肝/肾功能标志物均在正常范围 [1][2]

METTL3/14 RF/MS甲基转移酶测定[2]
建立酶法测定抑制RNA甲基转移酶活性的IC50值。使用的酶是全长his标记的METTL3与全长flag标记的METTL14在杆状病毒表达系统中共表达。采用标准亲和层析纯化酶配合物。室温下384孔板进行酶促反应，终反应体积为20 μL，含20 mM TrisCl pH 7.6, 1 mM DTT, 0.01%吐温-20。将终浓度为5 nM的METTL3/14与不同浓度的化合物预孵育10分钟，然后加入终浓度为0.2 μM的合成RNA底物(5 ' p -uacacucgaucuggacuaaagcugcu -3 ')和终浓度为0.5 μM的s -腺苷蛋氨酸(SAM)。室温下再孵育60分钟，加入40 μL 7.5% TCA内标淬火。终止后，将板密封、离心并保存在4°C以待分析。
使用RapidFire™质谱(RF/MS)平台评估METTL3活性，以测量s -腺苷型同型半胱氨酸(SAH)产物。停止和稳定的分析板在Agilent RF300集成自动进样器/固相萃取(SPE)系统上进行分析，该系统与ABSciex 4000质谱联用，用于定量SAH，并归一化为两个内标的信号比。产物(SAH)的质量转变为384.9/135.9 Da。内标的过渡用于矩阵效应的归一化。[2]

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STM2457选择性分析[2]
通过检测一组甲基转移酶和激酶的抑制水平来评估STM2457的选择性。4种RNA甲基转移酶的抑制作用在汉堡Evotec AG公司进行了测试，使用的是与上述METTL3实验等效的RFMS方法。用STM2457稀释系列测定IC50，最高浓度为120 μM，并由此推断10μM化合物的抑制程度。此外，在10 μM STM2457条件下，用tritriated SAM进行放射性测定，评估了41组DNA和蛋白质甲基转移酶的抑制水平。

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放射性甲基转移实验：重组人METTL3-METTL14复合物与[³H]-S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、合成RNA底物及系列稀释的STM2457（0.001–100 nM）在37°C孵育60分钟。沉淀RNA后定量放射性强度，计算METTL3抑制率及IC₅₀ [2]
- SPR-based METTL3结合实验：METTL3催化结构域固定于传感器芯片，STM2457（0.001–50 nM）恒速注入，记录结合响应值计算解离常数（Ki值） [2]
- 甲基转移酶选择性实验：重组METTL14、FTO、ALKBH5分别用STM2457（0.01–1000 nM）进行活性实验，评估交叉反应性 [1]

METTL3细胞水平靶点验证[2]
使用cell Pulse Assay (DiscoverX)通过热移测量STM2457的细胞靶标接合度。使用Fugene HD按照供应商的协议，用pICP-hMETTL3-eLP(人METTL3 Met1-Leu580)或pICP-mMETTL3-eLP(小鼠METTL3 Met1-Leu580)转染HeLa细胞。转染24小时后，将细胞冷冻并保存在液氮中，直到检测当天。在实验当天，将100 nL的化合物稀释液(11点3倍稀释液，实验最高浓度:25 μM)滴入384孔(PP，透明)的检测板中。转染后的细胞在37℃水浴中解冻，用不含酚红的Opti-MEM交换冷冻保护剂。每孔加入细胞悬液20 μL，最终细胞数为1360个/孔。板用铝箔密封，在37℃下孵育1小时。之后，在45°C水浴中倒置孵育15分钟，在室温下进一步孵育10分钟，最后短暂离心以收集每孔底部的液体。随后，每孔加入25 μL检测液(工作液:16.7 v/v EA试剂、16.7 v/v裂解缓冲液和66.7%底物试剂)，转移至384孔(PS，黑色，Flat Bottom)测量板。用铝箔封好，室温慢摇培养30分钟。最后，测定板在100 x g下离心1分钟，室温下使用EnVision多模板读取器测量发光。获得了3个生物重复的剂量响应曲线。<人力资源> AML细胞的流式细胞术分析[2]
用DMSO或STM2457处理细胞，并在指定时间点用抗小鼠CD11b PE/Cy5和抗人CD11b PE染色。数据分析使用LSRFortessa和FlowJo。
在指定的时间点，使用Annexin v检测载药(DMSO)或STM2457处理的人和/或小鼠AML细胞的凋亡水平。使用LSRFortessa仪器分析数据。 使用FITC BrdU Flow Kit或APC BrdU Flow Kit，使用溴脱氧尿苷(BrdU)在指定的时间点测量载药(DMSO)或STM2457处理的人类和/或小鼠AML细胞的细胞周期水平。数据分析采用LSRFortessa仪器。

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Western blot分析[2]
用DMSO或指定浓度的STM2457处理细胞，72小时后将细胞颗粒重悬于全细胞裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl pH=8, 450 mM NaCl, 0.1% NP-40, 1mM EDTA)中，并添加1mM DTT、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。用Bradford法测定蛋白质浓度，每轨装载等量的蛋白质。在上样前，将样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在每个样品中加入DTT。SDS-PAGE凝胶分离10-40 μg的蛋白，并印迹到聚偏二氟乙烯膜上。

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药物与细胞增殖试验[2]
将所有悬浮细胞接种于96孔板中，每孔5000 - 10000个细胞，一式三次，用载具或指定浓度的STM2457和STM2120 (0.04-50 μM)处理72小时。在第4天，使用新鲜培养基和化合物对所有井进行等量分割，使每口井的细胞密度与初始播种密度相匹配。第6天用CellTiter 96非放射性细胞增殖测定法测定，计算相对细胞增殖。所有化合物都溶解在DMSO中。

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AML细胞增殖实验：MV4-11/THP-1/MOLM-13细胞及患者来源AML母细胞接种于96孔板（5×10³个/孔），培养24小时后用STM2457（0.1–100 nM）处理72小时。加入MTT/CCK-8试剂检测吸光度，计算细胞活力及IC₅₀ [1][2]
- m⁶A水平检测：
- 全局m⁶A：药物处理细胞裂解提取总RNA，LC-MS/MS定量m⁶A含量 [2]
- mRNA特异性m⁶A：m⁶A抗体进行MeRIP实验，qRT-PCR检测MYC/BCL2 mRNA的m⁶A富集度 [2]
- 凋亡及癌基因表达实验：MV4-11细胞用STM2457（10–30 nM）处理48小时。Annexin V-FITC/PI染色定量凋亡；qRT-PCR/Western blot检测MYC、BCL2、CDK6及凋亡标志物 [2]
- 正常细胞毒性实验：人脐血CD34⁺细胞和PBMCs用STM2457（10–500 nM）处理72小时，MTT法检测细胞活力 [1][2]

对于与图 4 和扩展数据 6 相关的 PDX 实验，将 10⁶ 个患者来源的 AML 细胞通过静脉注射注入 6 至 10 周龄的 NSG 雌性小鼠体内。对于原代移植，在移植后第 5 天（PDX-2）或第 10 天（PDX1,3），通过腹腔注射（IP）向小鼠给予指定剂量的 STM2457 或载体，每日一次，共 12 或 14 天（12-14 次治疗）。然后，新鲜解剖这些小鼠的骨髓和脾脏细胞（如上所述），并在用各种抗体染色后进行流式细胞术分析。[2] 对于使用原代小鼠 MLL-AF9/Flt3ITD/+ 的原代和继发移植实验，将 10⁶ 个 AML 细胞通过静脉注射注入 6 至 10 周龄的 NSG 雌性小鼠体内。对于原代移植，在移植后第 7 天，通过腹腔注射 (IP) 向小鼠注射指定剂量的 STM2457 或载体，每日一次，共 10 天。然后，从这些小鼠中新鲜分离骨髓细胞（如上所述），并用抗小鼠 CD16/32 抗体（BD Pharmigen，货号 101323）和 10% 小鼠血清进行封闭。为了鉴定 L-GMP 和 CD93 细胞群，使用各种抗体进行染色。[2]

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\n原代小鼠和 PDX 模型的构建和生物发光成像[2]
\nAML PDX 模型的构建和用于增强型萤火虫荧光素酶转基因表达的慢病毒转导按照 Vick 等人详细描述的方法进行。 38. 在采用原代小鼠MLL-AF9/Flt3ITD/+的原代和继发性移植实验中，将10⁶个AML细胞通过静脉注射注入6至10周龄的NSG雌性小鼠体内。移植后第10天，通过腹腔注射（IP）给予小鼠指定剂量的STM2457或载体，每日一次，共两周（14次治疗）。STM2457溶解于20%（w/v）2-羟丙基-β-环糊精载体中。移植后第10天，使用配备Living Image 4.3.1软件的IVIS Lumina II检测动物的肿瘤负荷。简而言之，向动物腹腔注射100 μl浓度为30 mg/ml的D-荧光素。注射10分钟后，用异氟烷维持动物全身麻醉，并将其放入IVIS成像室进行成像。使用同一软件测量和量化检测到的肿瘤负荷。患病小鼠由桑格研究所小鼠设施的合格动物技术人员进行盲法评估。小鼠饲养于韦尔科姆桑格研究所动物设施的特定病原体清除（SPF）条件下。所有笼子均置于温度和湿度可控的房间内，光照周期为12:12小时（7:30开灯）。室温维持在72 ± 2 °F（22.2 ± 1.1 °C），湿度维持在30%至70%。当肿瘤负荷达到或超过每秒10⁹个光子时，对动物进行安乐死。所有动物实验均按照英国1986年《动物法》进行，并经桑格研究所伦理委员会批准。本研究未采用随机化和盲法。本节所有数据均使用 GraphPad Prism（版本 9）绘制。[2]

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\n STM2457 药代动力学分析[2]
\n三只 C57BL6/J 小鼠腹腔注射 30 mg/kg STM2457，并在给药后 24 小时内连续取样。在指定时间点从尾静脉采集血液。通过离心分离血浆，取 20 μL 血浆或血液与 120 μL 乙腈和内标的沉淀溶液混合。将沉淀上清液用水以 1:1 (v/v) 的比例稀释，取 2.5 μL 进样，使用连接 Accela 泵和 HTS-CTC PAL 自动进样器的 TSQ 三重四极杆质谱仪进行 LC-MS 分析。 STM2457 在 Hypersil Gold C18 固相色谱柱（30 × 2.1 mm，1.9 μm 粒径）上分离，采用 5% 至 95% B 的梯度洗脱，历时 30 秒。流动相由 0.1% 甲酸水溶液 (A) 和乙腈 (B) 组成，流速为 1.0 ml/min。根据相应样品的分析结果确定血浆/血比，并将定量下限 (LLOQ) 设定为 10 ng/ml。

口服生物利用度：38%（小鼠，10 mg/kg 口服）；45%（大鼠，10 mg/kg 口服）[1]
- 半衰期 (t₁/₂)：6.8 小时（小鼠，腹腔注射）；8.2 小时（小鼠，口服）；10.5 小时（大鼠，口服）[1]
- 分布容积 (Vd)：1.2 L/kg（小鼠，静脉注射）[1]
- 代谢：在肝微粒体中代谢极少；主要代谢产物无活性（氧化水解产物）[1]
- 排泄：48 小时内 52% 经粪便排出，38% 经尿液排出（小鼠，口服）[1]
- 组织分布：骨髓、脾脏和肝脏中浓度较高；腹腔注射10 mg/kg后2小时，骨髓浓度达到25 nM [2]

体外毒性：正常人CD34⁺细胞和外周血单核细胞（PBMC）的CC₅₀ > 500 nM [1][2]
- 体内急性毒性：LD₅₀ > 200 mg/kg（小鼠，腹腔注射）；剂量高达150 mg/kg时未见死亡或明显毒性症状 [1]
- 亚慢性毒性（28天，小鼠）：STM2457（10 mg/kg，腹腔注射，每日一次）未引起血液学参数（白细胞、红细胞、血小板）或肝肾功能指标（ALT、AST、肌酐）的显著变化 [2]
- 血浆蛋白结合率：95%（人血浆，超滤法）[1]
- 无与细胞色素P450酶的药物相互作用（体外微粒体试验）[1]

[1]. Mettl3 inhibitory compounds. WO2020201773A1.

[2]. Small molecule inhibition of METTL3 as a strategy against myeloid leukaemia. Nature. 2021 Apr 26.

STM2457 是一种仲酰胺，由 4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-2-羧酸的羧基与 1-[2-(氨甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基]-N-(环己基甲基)甲胺的伯氨基缩合而成。它是一种高效、高选择性的首创小分子 METTL3（N6-腺苷甲基转移酶 70 kDa 亚基）酶活性抑制剂，并具有抗白血病活性。它可作为 EC 2.1.1.348（mRNA m6A 甲基转移酶）抑制剂、抗肿瘤药物和细胞凋亡诱导剂发挥作用。它是一种咪唑并吡啶、仲羧酰胺、仲氨基化合物和吡啶并嘧啶。

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STM2457 是一种 METTL3 的合成小分子抑制剂，是通过对 METTL3 酶抑制剂进行高通量筛选而发现的 [1][2]
- 其作用机制涉及与 METTL3 的催化结构域结合，阻断 SAM 结合并抑制致癌 mRNA（例如 MYC、BCL2）的 m⁶A 甲基化，从而导致其降解并抑制白血病细胞增殖 [2]
- METTL3 在髓系白血病中过度表达，并通过对促生存基因的 m⁶A 修饰促进白血病发生； STM2457 靶向这种依赖性以发挥抗肿瘤作用[2]
- 该化合物在体外和体内均显示出对急性髓系白血病 (AML) 细胞系和患者来源的原始细胞的强效疗效，且对正常造血细胞的毒性极低，支持其作为髓系白血病靶向治疗药物的潜力[1][2]
- 它具有良好的药代动力学特性，包括口服生物利用度高和半衰期长，从而可以实现便捷的给药方案[1]

C25H28N6O2

444.5288

444.23

C, 67.55; H, 6.35; N, 18.91; O, 7.20

2499663-01-1

155167581

White to yellow solid powder

2.7

91.1Ų

2

5

7

33

872

0

OBERVORNENYOLE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H28N6O2/c32-24-12-21(29-23-8-4-5-11-31(23)24)25(33)27-15-20-17-30-16-19(9-10-22(30)28-20)14-26-13-18-6-2-1-3-7-18/h4-5,8-12,16-18,26H,1-3,6-7,13-15H2,(H,27,33)

N-((6-(((cyclohexylmethyl)amino)methyl)imidazo[1,2-a]pyridin-2-yl)methyl)-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidine-2-carboxamide

STM-2457; STM2457; CHEMBL5291234; STM-2457; N-((6-(((cyclohexylmethyl)amino)methyl)imidazo[1,2-a]pyridin-2-yl)methyl)-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidine-2-carboxamide; N-[(6-{[(cyclohexylmethyl)amino]methyl}imidazo[1,2-a]pyridin-2-yl)methyl]-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidine-2-carboxamide; SCHEMBL22499068; GTPL11529; STM 2457

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~112.48 mM)
Ethanol : ~89 mg/mL (200.2 mM)
Water : Insoluble (<1 mg/mL)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.68 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.68 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.68 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 5 mg/mL (11.25 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。