Synta66

Store-operated calcium entry channel Orai
Synta66 targets the Orai channel, which forms the pore of the CRAC (calcium release-activated calcium) channel. It is a CRAC channel inhibitor that blocks store-operated Ca2+ entry (SOCE). By inhibiting Orai, it prevents calcium influx into cells, which is important for various cellular functions including immune cell activation and platelet function.

CRAC通道孔由Orai形成，而Orai可被Synta66抑制。在Müller胶质细胞中，Synta66（10 μM）可降低峰值SOCE。在Trpc1−/− Müller细胞中，Synta66（10 μM）可阻断Orai通道介导残余SOC电流[1]。Synta66（10 μM）几乎完全阻断了CaCl2注射引起的Ca2+内流信号，而血小板中储存Ca2+的动员仅略微降低10%至30%。Synta66（10 μM）可抑制血浆中的人血小板活化和全血血栓形成。在小鼠中，Synta66（10 μM）也能抑制血栓形成和血小板反应[2]。Synta66（10 μM）可抑制人肥大细胞系中LAD2的表达。 Synta66 (10 μM) 对人肺肥大细胞 (HLMC) 中 FcεRI 刺激的前列腺素 D2 和细胞因子释放具有不同的影响，并能强烈抑制 FcεRI 刺激的组胺和 TNFα 的产生 [3]。
体外实验表明，Synta66 能高效阻断人血管平滑肌细胞 (VSMC) 中的 SOCE（基于最大 Ca2+ 水平和增加速率的 IC50 分别为 26 nM 和 43 nM）。它能抑制血浆中人血小板的活化和全血血栓形成。在 10 µM 浓度下，它能抑制 LAD2 人肥大细胞系，显著抑制 FcεRI 刺激的组胺和 TNFα 分泌，并对 FcεRI 刺激的前列腺素 D2 和细胞因子释放产生不同的影响。

Synta66 在体内也能抑制小鼠的血小板反应和血栓形成。它被用于神经系统疾病的研究。目前公开文献中关于 Synta66 在动物模型中的详细剂量反应和药代动力学数据有限。

SOCE阻滞剂抑制血浆和全血血栓形成中的人血小板活化[2]
在血浆或全血系统中，亲脂性抑制剂的浓度通常需要比在非血浆缓冲系统中高10倍至50倍才能影响血小板功能。28 SOCE抑制剂似乎也存在这种情况。当添加到富血小板血浆中时，需要100 μmol/L的Synta66、2APB或GSK-7975A才能抑制convulxin诱导的Ca2+升高和PS暴露，抑制率达41%至49%（数据未显示）。为了验证这些抑制剂是否影响血小板促凝活性，我们测量了富血小板血浆中Synta66、2APB或GSK-7975A（100 μmol/L）对凝血酶生成的影响。在1 pmol/L组织因子触发后，Synta66、2APB和GSK-7975A分别将凝血酶生成峰值降低至对照组的29±2%、58±2%和28±2%。
对于无细胞实验，可以使用电生理技术（膜片钳）在人工膜上研究Synta66对Orai/CRAC通道的抑制活性，或者使用含有该通道的膜制备物进行基于荧光的离子流测定。通道抑制的IC50值由浓度-反应曲线计算得出。

CRAC通道在内质网游离[Ca2+]ER降低后以STIM依赖的方式被激活（Prakriya和Lewis，2015）。为了评估这些Ca2+选择性通道对Müller胶质细胞SOCE的贡献，我们在假定的选择性抑制剂Synta66和GSK7975A存在的情况下耗竭了内质网的Ca2+储存。Synta66（10 μM）将SOCE峰值从511.0 ± 78.5 nm降低至349.9 ± 40.1 nm（N = 2；p < 0.01），而该拮抗剂对基础[Ca2+]i没有显著影响（未处理的对照组为221.5 ± 29.2 nm，Synta66处理的细胞为251.7 ± 31.3 nm；图5）。同样，野生型细胞中的SOCE反应可被GSK-7975A（10 μM；图5C-E）部分拮抗。Orai抑制细胞中残留的SOCE可被2-APB/SKF 96365/Gd3+消除（图5A,B）。[1]核心体温激活STIM1，使STIM1与Orai1解偶联（Xiao等，2011），并可能刺激Müller细胞中表达的TRPV4温度通道（Ryskamp等，2014）。因此，ICRAC在室温（RT）下激活不足（Somasundaram等，1996）。为了确定神经胶质细胞的SOCE是否受温度调控，我们比较了对照组和Synta66处理组细胞的超射反应幅度。温度从室温升高至 32°C 导致 SOCE 略有增加，但未达到统计学显著性（图 5C）。32°C 时 SOCE 幅度为 0.723 ± 0.165，在 Synta66 存在下降至 0.371 ± 0.058（n = 6/9 个细胞）。尽管降低了约 49%，但由于反应的变异性较大，该结果未达到统计学显著性。这些数据表明，Orai 与 TRPC [Ca2+]SOCE 反应的相对比例可能在核心体温下保持不变。[1]
对于体外细胞实验，Synta66 的活性在表达 CRAC 通道的细胞（例如血管平滑肌细胞、血小板或肥大细胞）中进行评估。细胞加载钙敏感荧光染料，并用不同浓度的 Synta66 处理。可通过使用毒胡萝卜素（耗竭细胞内钙库）或其他方法诱导胞内钙库耗竭型钙离子内流。使用荧光成像板读数仪（FLIPR）测量钙离子内流的抑制情况。IC50 值由浓度-反应曲线计算得出。

野生型或嵌合型Orai1−/−小鼠按指示注射载体溶液或2APB（3 mg/kg）。注射后60分钟采集血样，并按上述方法检测胶原诱导的血栓形成。为诱导小鼠局灶性脑缺血，采用腔内丝线短暂阻断大脑中动脉（MCA）60分钟，具体方法见其他文献（短暂性MCA阻断模型）²⁰。MCA供血区再灌注后，立即注射载体溶液或2APB（3 mg/kg）。动物在短暂性大脑中动脉闭塞后第1天被安乐死，脑组织切片用2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色，以量化缺血性脑体积（校正水肿）。[2]
在体内研究中，Synta66可通过腹腔注射或口服给药于血栓形成或神经系统疾病的动物模型。在血栓形成模型中，终点指标包括血小板聚集和血栓形成。在神经系统疾病模型中，终点指标包括行为学测试和神经炎症评估。

Synta66（CAS 835904-51-3）的分子式为C20H17FN2O3，分子量为352.36 g/mol。IUPAC名称：N-[4-(2,5-二甲氧基苯基)苯基]-3-氟吡啶-4-甲酰胺。外观：通常为粉末。溶解性：溶于DMSO和其他有机溶剂。储存：与小分子化合物的储存方式相同（干燥、避光、-20°C）。纯度：通常用于科研用途时纯度>98%。

目前尚无公开的详细毒性数据。作为一种CRAC通道抑制剂，其潜在副作用可能包括对免疫功能和血小板功能的影响。药物研发需要进行标准的毒理学研究。

[1]. Store-Operated Calcium Entry in Müller Glia Is Controlled by Synergistic Activation of TRPC and Orai Channels. J Neurosci. 2016 Mar 16;36(11):3184-98.

[2]. Antithrombotic potential of blockers of store-operated calcium channels in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012 Jul;32(7):1717-23.

[3]. Orai and TRPC channel characterization in FcεRI-mediated calcium signaling and mediator secretion in human mast cells. Physiol Rep. 2017 Mar;5(5).

内质网 (ER) 在星形胶质细胞的 Ca²⁺ 信号传导中起着核心作用。我们旨在阐明小鼠 Müller 细胞中由内质网钙补充介导的钙内流的分子机制。在无钙生理盐水中，通过阻断钙螯合物转运蛋白诱导的钙耗竭可协同激活经典瞬时受体电位通道 1 (TRPC1) 和 Orai 通道。我们利用电生理特性、药理学抑制剂和 Trpc1 基因敲除技术鉴定了由内质网钙补充介导的 TRPC1 通道。我们通过离子通透性、电压依赖性和对选择性 Orai 拮抗剂 Synta66 和 GSK7975A 的敏感性来表征钙释放激活电流 (ICRAC)。耗竭诱导的钙内流起源于 Müller 细胞的末端足突和顶端突起，并触发 Ca²⁺ 波向细胞体的离心传播。电镜分析显示，终末足区高密度内质网池遮蔽了视网膜神经节细胞（RGC）的胞体和轴突，以及原浆星形胶质细胞、血管内皮细胞和终末足玻璃体表面的内质网-线粒体连接。小鼠视网膜表达编码Stim和所有已知Orai基因的转录本；Müller胶质细胞主要表达基质相互作用分子1（STIM1），而STIM2主要局限于外丛状层和RGC层。TRPC1的缺失促进了眼压升高诱导的Müller胶质细胞增殖，提示TRPC通道可能在机械应激过程中发挥神经保护作用。通过表征Müller细胞中钙离子储存调控信号通路的特性，这些研究拓展了我们对这些细胞在视网膜生理和病理学中功能作用的现有认识，并进一步证实了中枢神经系统星形胶质细胞中钙信号机制的复杂性。[1]

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目的：血小板Orai1通道介导钙离子储存调控内流（SOCE），这对于促凝活性和动脉血栓形成至关重要。药理学阻断这些通路可能提供一种新的抗血栓治疗方法。因此，本研究旨在确定靶向血小板Orai1的SOCE阻滞剂的抗血栓作用。方法和结果：筛选候选抑制剂对洗涤人血小板中SOCE的影响。测试的拮抗剂包括已知化合物SKF96365、2-氨基乙基二苯硼酸酯和MRS1845，以及新型化合物Synta66和GSK-7975A。SOCE抑制效力的顺序为：Synta66、2-氨基乙基二苯硼酸酯、GSK-7975A、SKF96365、MRS1845。前三种化合物的特异性已使用Orai1缺陷小鼠的血小板进行验证。在血浆和全血中评估了这些化合物对促凝活性和高剪切力血栓形成的抑制作用。在血浆存在的情况下，所有三种化合物均能抑制血流条件下的血小板反应和血栓形成。使用小鼠卒中模型，通过短暂性大脑中动脉闭塞在体内诱导动脉血栓形成。术后给予2-氨基乙基二苯硼酸酯可显著减少梗死面积。结论：血浆可溶性SOCE阻滞剂，例如2-氨基乙基二苯硼酸，可以抑制血小板依赖性凝血和血栓形成。血小板Orai1通道是预防导致脑梗死的血栓事件的新靶点。[2]肥大细胞通过FcεRI受体异常激活会导致炎症介质的释放和过敏性疾病的症状。钙离子内流是肥大细胞信号传导的关键调节因子，对于预先形成的介质的胞吐以及花生酸、细胞因子和趋化因子的合成至关重要。对啮齿动物和人类肥大细胞的研究证实，Orai钙通道是FcεRI启动的介质释放的关键因素。然而，迄今为止，尚未有关于TRPC钙通道在FcεRI介导的人类肥大细胞信号传导中的作用的报道。本研究证实了Orai 1、2和3以及TRPC1和6在原代人肺肥大细胞和LAD2人肥大细胞系中的表达。然而，我们发现只有Orai通道而非TRPC通道在FcεRI介导的钙离子内流中发挥功能性作用。使用Orai选择性拮抗剂（Synta66）进行的钙成像实验表明，Orai参与了人肥大细胞中FcεRI介导的信号通路。然而，使用TRPC3/6选择性拮抗剂和激动剂（分别为GSK-3503A和GSK-2934A）均未发现TRPC6参与人肥大细胞中FcεRI介导的钙信号通路的证据。同样，在人肥大细胞中，STIM1调控的TRPC1失活（通过将STIM1-KK684-685EE-TRPC1门控突变体转染细胞进行检测）未能改变LAD2人肥大细胞中FcεRI介导的钙信号传导。介质释放实验证实，FcεRI介导的钙离子通过Orai通道的内流对于组胺和TNFα的释放至关重要，但在细胞因子和花生酸的产生中发挥不同的作用。[3] Synta66是一种研究级化合物，尚未获准用于治疗用途。它主要用作研究CRAC通道功能、钙信号传导和神经系统疾病的药理学工具。其作用机制涉及抑制Orai/CRAC通道。目前尚未有临床试验报道。

C20H17N2O3F

352.359

352.122

835904-51-3

11337104

Typically exists as White to gray solids at room temperature

1.3±0.1 g/cm3

422.4±45.0 °C at 760 mmHg

209.3±28.7 °C

0.0±1.0 mmHg at 25°C

1.611

2.52

60.4Ų

1

5

5

26

456

0

O=C(C1C(F)=CN=CC=1)NC1C=CC(C2C(OC)=CC=C(OC)C=2)=CC=1

GFEIWXNLDKUWIK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H17FN2O3/c1-25-15-7-8-19(26-2)17(11-15)13-3-5-14(6-4-13)23-20(24)16-9-10-22-12-18(16)21/h3-12H,1-2H3,(H,23,24)

N-[4-(2,5-dimethoxyphenyl)phenyl]-3-fluoropyridine-4-carboxamide

Synta-66; CHEMBL3403742; SCHEMBL1829334; CHEBI:231608; GLXC-03244; GSK1349571A;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~77.5 mg/mL (~219.95 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.58 mg/mL (7.32 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声和加热处理
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.58 mg/mL (7.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.8mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 2.58 mg/mL (7.32 mM) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。