VEGFR2 (IC50 = 30 nM); c-Met (IC50 = 32 nM)
Pamufetinib mesylate significantly inhibits the proliferation of MET-amplified cancer cells (GI50=0.032-0.362 μM) and strongly suppresses the VEGF-dependent proliferation of HUVECs (IC50=0.019 μM) as a MET-targeted inhibitor. In comparison to other VEGFR-targeted kinase inhibitors, pamufetinib mesylate is significantly less toxic in a variety of normal cell lines[1]. In PC-9 and HCC827 cells, erlotinib resistance, Met phosphorylation, and VEGF production induced by HGF are all inhibited by crizotinib and Pamufetinib mesylate[2].

体外活性：Pamufetinib/TAS-115 是一种新型、有效的 VEGFR 和肝细胞生长因子受体 (MET) 靶向激酶抑制剂，具有改进的安全性，对 rVEGFR2 和 rMET 的 IC50 分别为 30 和 32 nM。 VEGF 受体 (VEGFR) 信号在肿瘤血管生成中发挥关键作用。尽管一些 VEGFR 信号靶向药物已被批准用于临床，但其实用性受到相关毒性或对此类疗法的耐药性的限制。为了克服这些限制，开发了 TAS-115 来抑制 VEGFR2 和 MET 的激酶活性及其信号依赖性细胞生长，其抑制效果与其他已知的 VEGFR 或 MET 抑制剂一样强。 TAS-115 的激酶选择性比舒尼替尼更具特异性，并且 TAS-115 对 VEGFR 信号或 MET 信号独立的细胞产生相对较弱的生长抑制 (GI50 > 10 μmol/L)。此外，与其他 VEGFR 抑制剂相比，TAS-115 对各种正常细胞造成的损伤较小。这些数据表明 TAS-115 具有极高的选择性和特异性，至少在体外是如此。在体内研究中，TAS-115 通过阻断血管生成来完全抑制 MET 灭活肿瘤的进展，连续 6 周每天给药，即使是 TAS-115 的血清饱和剂量，也没有毒性。 TAS-115 对激酶和靶细胞的显着选择性与耐受性的改善相关，并有助于在不减少剂量或洗脱期的情况下维持治疗的能力。此外，TAS-115 还可诱导 MET 扩增的人类荷瘤小鼠的肿瘤显着缩小并延长生存期。这些数据表明TAS-115是一种独特的VEGFR/MET靶向抑制剂，具有提高的抗肿瘤功效和降低的毒性。此外，据报道，通过三联临床药物或TAS-115联合厄洛替尼对EGFR、HGF/Met和VEGF/VEGF受体2进行三重抑制，可能有助于控制EGFR突变的进展。通过逆转 EGFR-TKI 耐药性和抑制血管生成来治疗肺癌。激酶测定：使用迁移率变动测定进行酶抑制研究。简而言之，0.3 μg/mL 重组 MET（rMET，N 端谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 标签；Carna Biosciences）和 1.5 μmol/L FL-肽 2 (Caliper Life Sciences) 或 2 μg/mL 重组 VEGFR2将（rVEGFR2，氨基酸 790 末端，N 末端 6His 标记；Upstate）和 1.5 μmol/L FL-Peptide 22（Caliper Life Sciences）添加到含有 1/2 米氏常数 (Km) 水平的 25 μL 混合物中ATP、100 mmol/L HEPES (pH 7.2)、0.003% (w/v) Brij35、0.04% (v/v) Tween 20、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 二硫苏糖醇，完整迷你不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，KK）和 PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，KK），仅在 rVEGFR2 的情况下添加 0.05% (w/v) CHAPSO。将反应混合物在 28°C 下孵育 90 分钟，并通过添加 15 mmol/L EDTA 终止反应。使用 LabChip EZ Reader 版本 2.1.82.0（UCC 版本：1.96，CCD 版本：102）计算磷酸化肽。根据对照孔和药物处理孔中形成的磷酸化肽的量，使用逻辑回归分析计算50%抑制浓度(IC50)。使用 ProfilerPro Kit 1-8 (Caliper Life Sciences) 进行了总共 192 项激酶面板测定，并使用迁移率变动测定进行了分析。细胞测定：将MKN45细胞接种于6孔板中。第二天，将 TAS-115 以所需的最终浓度添加到孔中，并将细胞孵育 30 分钟。洗涤后，使用细胞提取缓冲液(Invitrogen Corporation)裂解细胞。使用试剂和抗体部分中提到的抗体进行免疫印迹分析细胞裂解物。为了研究细胞 VEGFR2 磷酸化，将 HUVEC 铺在胶原蛋白包被的培养皿中 (BD Biosciences, Inc.)。第二天，在过夜孵育期间进行血清饥饿。然后，以所需的最终浓度添加 TAS-115 和 VEGF。孵育 5 分钟后，用哺乳动物蛋白提取试剂（M-PER；Pierce Thermo Scientific）制备细胞裂解液，并使用免疫印迹检测 VEGFR2 磷酸化。使用 LAS1000 plus 和 Multi Gauge Ver. 来分析印迹图像。 3.0（富士胶片）。使用 GAPDH 的信号强度计算图像的相对信号值。

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TAS-115 在 PC-9/HGF 和 HCC827 肺癌细胞中抑制 MET 磷酸化。在浓度低于 10 μmol/L 时，TAS-115 不影响 PC-9 或 HCC827 细胞的生长。然而，当与厄洛替尼（0.3 μmol/L）联合使用时，它能以浓度依赖的方式逆转肝细胞生长因子（HGF）在这些细胞系中诱导的厄洛替尼耐药性。[2]
TAS-115 抑制由外源性或内源性 HGF 刺激的 PC-9 癌细胞中 VEGF 的产生。[2]
TAS-115 以剂量依赖的方式抑制 VEGF 刺激的人真皮微血管内皮细胞（HMVECs）的活力，效果与贝伐珠单抗类似。克唑替尼未显示此效果。[2]
蛋白质印迹分析表明，TAS-115 和贝伐珠单抗能抑制 VEGF 在 HMVECs 中诱导的 VEGFR-2 磷酸化。[2]

AS-115（50 mg/kg/d）在治疗期间完全阻止肿瘤生长。在 MET 扩增的人类癌症移植模型中，TAS-115（200 mg/kg/d）可诱导初始肿瘤体积缩小 48%。该模型中 TAS-115 的估计 50% 有效剂量 (ED50) 为 8 mg/kg/d。当以 50 或 200 mg/kg/天的剂量施用 TAS-115 时，TAS-115 显着延长了这些小鼠的存活时间。 TAS-115 在体内抑制 PC-9/HGF 肿瘤的血管生成。此外，厄洛替尼和 TAS-115 的双药组合成功抑制 PC-9/HGF 肿瘤生长，并延缓与持续肿瘤脉管系统抑制相关的肿瘤再生，即使在停止治疗后也是如此。

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在携带 PC-9/HGF 肿瘤（过表达 HGF）的裸鼠中，每日口服 TAS-115（75 mg/kg）单药可适度抑制肿瘤生长（第39天抑制率为76.6%）。[2]
TAS-115（每日口服75 mg/kg）与厄洛替尼（每日口服50 mg/kg）联用能强力抑制 PC-9/HGF 肿瘤的生长，第39天抑制率达93.7%。该抑制效果优于厄洛替尼、克唑替尼和贝伐珠单抗的三联方案。[2]
使用 TAS-115（每日口服75 mg/kg，持续4天）治疗可在体内抑制 PC-9/HGF 肿瘤的血管生成（通过 CD31+ 血管密度测量）。TAS-115 的抗血管生成效果比贝伐珠单抗更强。[2]
厄洛替尼与 TAS-115 联用能显著延迟在停止为期39天的治疗疗程后的肿瘤再生长。停止治疗10天后，厄洛替尼+TAS-115 组的肿瘤仅增长至停止治疗时初始大小的1.7倍，而厄洛替尼+克唑替尼组和厄洛替尼+克唑替尼+贝伐珠单抗组的肿瘤分别增长至4.5倍和3.3倍。[2]
这种延迟的再生长与即使在停止治疗10天后，肿瘤中持续的血管生成抑制（低血管密度）和高凋亡细胞数量相关。[2]

动员位移测定用于酶抑制的研究。简而言之，0.3 μg/mL 重组 MET（rMET，N 端谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 标签；Carna Biosciences）和 1.5 μmol/L FL-肽 2 (Caliper Life Sciences) 或 2 μg/mL 重组 VEGFR2将（rVEGFR2，氨基酸 790 末端，N 末端 6His 标记；Upstate）和 1.5 μmol/L FL-Peptide 22（Caliper Life Sciences）添加到含有 1/2 米氏常数 (Km) 水平的 25 μL 混合物中ATP、100 mmol/L HEPES (pH 7.2)、0.003% (w/v) Brij35、0.04% (v/v) Tween 20、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 二硫苏糖醇，完整迷你不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，KK）和 PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，KK），仅在 rVEGFR2 的情况下添加 0.05% (w/v) CHAPSO。 28℃孵育90分钟后，加入15mmol/L EDTA终止反应。使用 LabChip EZ Reader 版本 2.1.82.0（UCC 版本：1.96，CCD 版本：102）计算磷酸化肽。利用逻辑回归分析，根据药物处理孔和对照孔中产生的磷酸化肽的量确定50%抑制浓度(IC50)。 ProfilerPro 试剂盒 1-8（Caliper Life Sciences）用于进行 192 种激酶面板检测，然后使用迁移率变动检测进行分析。

将 Transwell 胶原包被室上室中的 MRC-5（1000 个细胞/300 μL）和肿瘤细胞（8000 个细胞/800 mL）与或不与 TAS-115（1.0 μM）或厄洛替尼（0.3微米）。接下来是拆除上室。利用 MTT 测定来确定细胞活力[2]。

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细胞活力实验（MTT法）： 将肿瘤细胞（PC-9, HCC827, PC-9/Vec, PC-9/HGF）接种于96孔板中。24小时后，加入包含 TAS-115、厄洛替尼、HGF 或其组合的试剂。细胞继续培养72小时。然后向每孔加入MTT溶液，孵育2小时。移除培养基，用二甲基亚砜溶解甲瓒晶体，在550 nm（参考波长630 nm）处测量吸光度。相对于未处理对照组计算生长百分比。[2]
共培养实验： 将含有或不含 TAS-115 或厄洛替尼的肿瘤细胞置于Transwell系统的下室。将成纤维细胞（MRC-5细胞）置于上室。共培养72小时后，移除上室，对下室进行MTT实验以评估肿瘤细胞活力。[2]
蛋白质印迹法（Western Blot）： 从处理过的细胞制备裂解液。蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移至膜上，封闭后与一抗（如抗磷酸化-Met、总Met、磷酸化-Akt、总Akt、磷酸化-Erk、总Erk、磷酸化-VEGFR-2、总VEGFR-2）孵育。洗涤后，膜与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。使用增强化学发光底物显示免疫反应条带。[2]
VEGF/HGF 产生量测定： 细胞在含血清的培养基中培养。48小时后收集上清液，离心并储存。使用商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，按照制造商说明书测定HGF和VEGF的浓度。在450 nm处测量颜色强度。[2]

小鼠：TAS-115 的剂量范围为 12.5、50 和 200 mg/kg/d。舒尼替尼的推荐日剂量为 40 mg/kg。在 SC-9 异种移植模型中，采用口服药物进行长期给药时，疗程连续 14 天或 42 天。治疗期间每周测量两次肿瘤体积 (TV) 和体重。在每个研究周期结束时，评估抗肿瘤疗效[1]。皮下异种移植疗效模型：将培养的 PC-9/Vec 或 PC-9/HGF 肿瘤细胞皮下植入雄性裸鼠侧腹。当肿瘤体积达到 100-200 mm³ 时，将小鼠随机分组。TAS-115 以 75 mg/kg 的剂量口服，每日一次。厄洛替尼以50 mg/kg的剂量口服，每日一次。贝伐珠单抗以100 µg/只小鼠的剂量腹腔注射，每周一次。治疗持续39天。每周测量肿瘤大小三次，并计算肿瘤体积。39天后，部分组停止治疗，以监测肿瘤复发情况，再观察10天。[2]
血管生成评估的短期治疗模型：将已建立皮下肿瘤（≈100 mm³）的裸鼠用药物（例如厄洛替尼、TAS-115）治疗4天。第4天处死小鼠，取出肿瘤，并通过CD31免疫组化染色评估血管生成情况。[2]

在裸鼠中，每日口服TAS-115（75 mg/kg）联合每日口服厄洛替尼（50 mg/kg），持续39天，未观察到明显的不良反应，包括体重减轻。[2]
该手稿指出，基于既往研究，存在一个潜在的担忧：抗VEGF疗法（TAS-115作用机制的一部分）可能诱发肿瘤的恶性进展，例如局部侵袭和远处转移增加。因此，生物标志物对于优化MET/VEGFR双重抑制剂的使用可能至关重要。[2]

[1]. The novel VEGF receptor/MET-targeted kinase inhibitor TAS-115 has marked in vivo antitumor properties and a favorable tolerability profile. Mol Cancer Ther. 2013 Dec;12(12):2685-96.

[2]. Triple inhibition of EGFR, Met, and VEGF suppresses regrowth of HGF-triggered, erlotinib-resistant lung cancer harboring an EGFR mutation. J Thorac Oncol. 2014 Jun;9(6):775-83.

TAS-115 被描述为一种新型口服抑制剂，对 VEGFR-2 和 MET 均有活性。[2]
该研究提出，使用厄洛替尼联合 TAS-115 来三重抑制 EGFR、MET 和血管生成（通过 VEGFR-2），可能是控制因 HGF/MET 激活而对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 产生耐药性的 EGFR 突变型肺癌进展的有效策略。[2]
在所用的实验条件下，双药方案（厄洛替尼 + TAS-115）在延缓治疗停止后肿瘤复发方面的疗效比临床上可用的三药方案（厄洛替尼 + 克唑替尼 + 贝伐珠单抗）更为显著。[2]

C28H27FN4O7S2

614.664987802505

614.13

C, 54.71; H, 4.43; F, 3.09; N, 9.12; O, 18.22; S, 10.43

1688673-09-7

Pamufetinib;1190836-34-0

118130255

White to off-white solid powder

196

4

10

7

42

891

0

NUYQWFCUOAVQAL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H23FN4O4S.CH4O3S/c1-29-26(34)19-14-18-21(15-24(19)35-2)30-11-10-22(18)36-23-9-8-17(13-20(23)28)31-27(37)32-25(33)12-16-6-4-3-5-7-16;1-5(2,3)4/h3-11,13-15H,12H2,1-2H3,(H,29,34)(H2,31,32,33,37);1H3,(H,2,3,4)

4-[2-fluoro-4-[(2-phenylacetyl)carbamothioylamino]phenoxy]-7-methoxy-N-methylquinoline-6-carboxamide;methanesulfonic acid

TAS115 mesylate; TAS115; Pamufetinib; TAS-115; TAS 115; Pamufetinib mesylate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~75 mg/mL (~122.02 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。