VEGFR2 (IC50 = 30 nM); c-Met (IC50 = 32 nM)
Pamufetinib is ATP antagonistic, having inhibition constants (Ki) of 12 and 39 nM against rVEGFR2 and rMET, respectively. Similar to other known inhibitors of VEGFR or MET, pamufetinib also strongly suppresses the kinase activity of both VEGFR2 and MET, as well as their signal-dependent cell growth. In comparison to other VEGFR inhibitors, parmatetinib causes less damage to a variety of normal cells[1]. At concentrations below 10 μM, Pamufetinib has no effect on PC-9 or HCC827 cell growth; however, when combined with Erlotinib, it reverses HGF-induced resistance in the cell lines in a concentration-dependent manner. Pamufetinib inhibits the proliferation of endothelial cells and the production of VEGF by cancer cells[2].

体外活性：Pamufetinib/TAS-115 是一种新型、有效的 VEGFR 和肝细胞生长因子受体 (MET) 靶向激酶抑制剂，具有改进的安全性，对 rVEGFR2 和 rMET 的 IC50 分别为 30 和 32 nM。 VEGF 受体 (VEGFR) 信号在肿瘤血管生成中发挥关键作用。尽管一些 VEGFR 信号靶向药物已被批准用于临床，但其实用性受到相关毒性或对此类疗法的耐药性的限制。为了克服这些限制，开发了 TAS-115 来抑制 VEGFR2 和 MET 的激酶活性及其信号依赖性细胞生长，其抑制效果与其他已知的 VEGFR 或 MET 抑制剂一样强。 TAS-115 的激酶选择性比舒尼替尼更具特异性，并且 TAS-115 对 VEGFR 信号或 MET 信号独立的细胞产生相对较弱的生长抑制 (GI50 > 10 μmol/L)。此外，与其他 VEGFR 抑制剂相比，TAS-115 对各种正常细胞造成的损伤较小。这些数据表明 TAS-115 具有极高的选择性和特异性，至少在体外是如此。在体内研究中，TAS-115 通过阻断血管生成来完全抑制 MET 灭活肿瘤的进展，连续 6 周每天给药，即使是 TAS-115 的血清饱和剂量，也没有毒性。 TAS-115 对激酶和靶细胞的显着选择性与耐受性的改善相关，并有助于在不减少剂量或洗脱期的情况下维持治疗的能力。此外，TAS-115 还可诱导 MET 扩增的人类荷瘤小鼠的肿瘤显着缩小并延长生存期。这些数据表明TAS-115是一种独特的VEGFR/MET靶向抑制剂，具有提高的抗肿瘤功效和降低的毒性。此外，据报道，通过三联临床药物或TAS-115联合厄洛替尼对EGFR、HGF/Met和VEGF/VEGF受体2进行三重抑制，可能有助于控制EGFR突变的进展。通过逆转 EGFR-TKI 耐药性和抑制血管生成来治疗肺癌。激酶测定：使用迁移率变动测定进行酶抑制研究。简而言之，0.3 μg/mL 重组 MET（rMET，N 端谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 标签；Carna Biosciences）和 1.5 μmol/L FL-肽 2 (Caliper Life Sciences) 或 2 μg/mL 重组 VEGFR2将（rVEGFR2，氨基酸 790 末端，N 末端 6His 标记；Upstate）和 1.5 μmol/L FL-Peptide 22（Caliper Life Sciences）添加到含有 1/2 米氏常数 (Km) 水平的 25 μL 混合物中ATP、100 mmol/L HEPES (pH 7.2)、0.003% (w/v) Brij35、0.04% (v/v) Tween 20、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 二硫苏糖醇，完整迷你不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，KK）和 PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，KK），仅在 rVEGFR2 的情况下添加 0.05% (w/v) CHAPSO。将反应混合物在 28°C 下孵育 90 分钟，并通过添加 15 mmol/L EDTA 终止反应。使用 LabChip EZ Reader 版本 2.1.82.0（UCC 版本：1.96，CCD 版本：102）计算磷酸化肽。根据对照孔和药物处理孔中形成的磷酸化肽的量，使用逻辑回归分析计算50%抑制浓度(IC50)。使用 ProfilerPro Kit 1-8 (Caliper Life Sciences) 进行了总共 192 项激酶面板测定，并使用迁移率变动测定进行了分析。细胞测定：将MKN45细胞接种于6孔板中。第二天，将 TAS-115 以所需的最终浓度添加到孔中，并将细胞孵育 30 分钟。洗涤后，使用细胞提取缓冲液(Invitrogen Corporation)裂解细胞。使用试剂和抗体部分中提到的抗体进行免疫印迹分析细胞裂解物。为了研究细胞 VEGFR2 磷酸化，将 HUVEC 铺在胶原蛋白包被的培养皿中 (BD Biosciences, Inc.)。第二天，在过夜孵育期间进行血清饥饿。然后，以所需的最终浓度添加 TAS-115 和 VEGF。孵育 5 分钟后，用哺乳动物蛋白提取试剂（M-PER；Pierce Thermo Scientific）制备细胞裂解液，并使用免疫印迹检测 VEGFR2 磷酸化。使用 LAS1000 plus 和 Multi Gauge Ver. 来分析印迹图像。 3.0（富士胶片）。使用 GAPDH 的信号强度计算图像的相对信号值。

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Pamufetinib (TAS-115) 在浓度 ≥ 0.01 µM时能有效抑制VEGF诱导的HUVECs和MS-1细胞中VEGFR2的酪氨酸磷酸化，并在浓度 ≥ 0.03 µM时抑制MKN45细胞（MET扩增的胃癌细胞系）中HGF诱导的MET酪氨酸磷酸化及其下游信号（p-ERK1/2, p-AKT, p-FAK, p-S6, p-STAT3）。[1]
它能强效抑制HUVECs的VEGF依赖性增殖，IC₅₀为0.019 µM，但在VEGF非依赖性（10% FBS）条件下效力弱得多（IC₅₀ = 19.3 µM）。[1]
Pamufetinib (TAS-115) 选择性抑制MET扩增的癌细胞系（MKN45, Hs746T, NUGC-4）的增殖，GI₅₀值分别为0.032、0.035和0.362 µM。它对无MET扩增的癌细胞系（HCT-116, MCF-7, SK-OV-3, DU145）的生长抑制较弱（GI₅₀ > 10 µM）。[1]
与舒尼替尼、索拉非尼和克唑替尼相比，Pamufetinib (TAS-115) （10 µM）在多种正常细胞系（包括大鼠心肌细胞、人冠状动脉平滑肌细胞、正常肺成纤维细胞和人肺泡上皮细胞）中诱导的caspase 3/7激活（细胞凋亡指标）和细胞损伤最小。[1]

AS-115（50 mg/kg/d）在治疗期间完全阻止肿瘤生长。在 MET 扩增的人类癌症移植模型中，TAS-115（200 mg/kg/d）可诱导初始肿瘤体积缩小 48%。该模型中 TAS-115 的估计 50% 有效剂量 (ED50) 为 8 mg/kg/d。当以 50 或 200 mg/kg/天的剂量施用 TAS-115 时，TAS-115 显着延长了这些小鼠的存活时间。 TAS-115 在体内抑制 PC-9/HGF 肿瘤的血管生成。此外，厄洛替尼和 TAS-115 的双药组合成功抑制 PC-9/HGF 肿瘤生长，并延缓与持续肿瘤脉管系统抑制相关的肿瘤再生，即使在停止治疗后也是如此。

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在MET低表达的SC-9胃癌异种移植模型中，口服Pamufetinib (TAS-115) 200 mg/kg/天，连续42天，通过抑制血管生成完全抑制了肿瘤生长，且未观察到体重下降。相比之下，舒尼替尼（40 mg/kg/天，2周给药/1周间歇方案）最初抑制生长，但在1周的停药期内肿瘤迅速再生。[1]
在MET扩增的MKN45胃癌异种移植模型中，口服Pamufetinib (TAS-115) 连续14天，能剂量依赖性地抑制肿瘤生长（12.5 mg/kg/天时TGI=76%；50 mg/kg/天时完全抑制生长），并在200 mg/kg/天时诱导48%的肿瘤消退。估计ED₅₀为8 mg/kg/天。舒尼替尼（40 mg/kg/天）显示出显著的生长抑制（TGI=84%）但未引起消退。[1]
在MET扩增的NUGC-4胃癌腹膜播散模型中，口服Pamufetinib (TAS-115) 50和200 mg/kg/天（每周5天）能显著延长生存期（200 mg/kg/天组中位生存期>60天，对照组为29天），而舒尼替尼（40 mg/kg/天）未显示出显著的生存获益。[1]
在AZ-521荷瘤小鼠中的药效学分析显示，单次口服Pamufetinib (TAS-115) 能抑制肿瘤中VEGF诱导的VEGFR2磷酸化。在MKN45荷瘤小鼠中，低至3.1 mg/kg的剂量即可抑制肿瘤中MET及其下游效应因子ERK和AKT的磷酸化。[1]

迁移率变动测定用于酶抑制的研究。总之，25 μL 混合物含有 1/2 米氏常数 (Km) 水平的 ATP、100 mM HEPES (pH 7.2)、0.003% (w/v) Brij35、0.04% (v/v) Tween 20、10 mM MgCl²、1 mM 二硫苏糖醇、完整迷你不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物片剂和 PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合物片剂与 1.5 μM FL-肽 2 或 2 μg/mL 组合重组 VEGFR2（rVEGFR2，氨基酸 790 末端，N 末端 6His 标记）和 1.5 μM FL-肽 22。添加 15 mM EDTA 结束反应混合物在 28°C 下的 90 分钟孵育期。使用 LabChip EZ Reader 版本 2.1.82.0（UCC 版本：1.96，CCD 版本：102）计算磷酸化肽。利用逻辑回归分析，根据药物处理孔和对照孔中产生的磷酸化肽的量确定50%抑制浓度(IC50)。使用 ProfilerPro 试剂盒 1-8，通过迁移率变动测定进行 192 种激酶面板测定并进行分析。

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使用迁移率变动分析法评估激酶抑制活性。简要步骤是：将重组MET或VEGFR2激酶、荧光标记的肽底物、Km浓度的ATP和测试化合物在含有HEPES、MgCl₂、DTT以及蛋白酶/磷酸酶抑制剂的反应缓冲液中孵育。反应在28°C下进行90分钟，用EDTA终止。磷酸化和非磷酸化肽段被分离，并使用微流控芯片阅读器进行定量。根据药物处理组与对照组相比磷酸化肽段形成的减少来计算IC₅₀值。[1]
使用类似的迁移率变动分析法，通过预先配置的激酶组确定了广泛的激酶选择性谱（192种激酶）。[1]

MTT染料还原法用于测量细胞的生长。每孔使用 10% 胎牛血清 (FBS)，将肿瘤细胞以 2×10³ 细胞/100 mL RPMI-1640 培养基的密度接种到 96 孔板中。 24小时孵育期后，向每个孔中添加不同的试剂，并将细胞再孵育72小时。接下来，向每个孔中添加50 μL MTT溶液（2 mg/mL），并将细胞再孵育两小时。除去含有MTT溶液的介质后，加入100mL二甲基亚砜溶解深蓝色晶体。分别在 550 nm 和 630 nm 的测试波长和参考波长下，使用酶标仪测量每个孔的吸光度。与未处理的对照相比，显示生长百分比。每个实验都涉及测试每种试剂浓度至少三次，如果可能的话，一式三份。

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对于细胞磷酸化检测，将HUVECs血清饥饿过夜，用Pamufetinib (TAS-115) 处理，然后用VEGF刺激5分钟，再进行细胞裂解和p-VEGFR2的免疫印迹分析。[1]
MKN45细胞用Pamufetinib (TAS-115) 处理30分钟，然后裂解并进行p-MET及下游信号蛋白的免疫印迹分析。[1]
增殖实验：将癌细胞铺板，贴壁后，用Pamufetinib (TAS-115) 处理72小时，使用发光法ATP检测试剂评估细胞活力。[1]
VEGF依赖性HUVEC增殖评估：将饥饿的HUVECs铺板，同时加入VEGF和Pamufetinib (TAS-115)，24小时后使用溴脱氧尿苷摄取法测量DNA合成。[1]
正常细胞损伤评估：将正常细胞（如大鼠心肌细胞）用化合物处理72或96小时。通过结晶紫染色或多重检测法测量细胞活力，并使用发光法caspase检测试剂盒测量caspase-3/7活性来评估细胞凋亡。Caspase活性以细胞活力进行标准化。[1]

每只小鼠的右侧腹部均通过套管针植入皮下SC-9肿瘤碎片。制备MKN45细胞悬液，并将其皮下植入每只裸鼠的右侧腹部。计算肿瘤体积（TV，mm³）。TAS-115的剂量分别为12.5、50和200 mg/kg/d。舒尼替尼的最大耐受剂量（MTD）为40 mg/kg/d，该剂量已确定。在SC-9异种移植模型中，连续14天或42天进行口服药物治疗。在治疗期间，每周测量两次肿瘤体积和体重。对于皮下异种移植模型（SC-9、MKN45），将肿瘤碎片或细胞悬液植入裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约 250 mm³ 时，将小鼠分组并开始治疗（第 1 天）。将帕莫非替尼 (TAS-115) 悬浮于合适的溶剂中，并以指定剂量（例如 12.5、50 或 200 mg/kg/天）每日一次灌胃给药，连续给药 14 天或 42 天。每周测量两次肿瘤体积和体重。[1] 对于 NUGC-4 腹膜播散模型，将 Matrigel 中的 NUGC-4 细胞腹腔接种到裸鼠体内。从第 1 天开始，分别给予帕莫非替尼 (TAS-115)（50 或 200 mg/kg/天）或舒尼替尼（40 mg/kg/天）治疗，每日一次，每周 5 天。监测小鼠的生存情况直至濒死。 [1]
在药效学研究中，荷瘤小鼠单次口服帕莫非替尼（TAS-115）。三小时后，为进行VEGFR2分析，静脉注射VEGF，并在注射后5分钟收集肿瘤组织进行免疫沉淀和免疫印迹分析。为进行MET分析，在给药后3小时收集肿瘤组织进行直接免疫印迹分析。[1]

据报道，安全裕度（最大耐受剂量与估计有效剂量的比值）大于25倍（MET放大模型中MTD > 200 mg/kg/天，而ED₅₀为2-8 mg/kg/天）。[1]

与舒尼替尼、索拉非尼和克唑替尼相比，帕莫非替尼（TAS-115）（10 µM）在多种正常细胞系（大鼠心肌细胞、hCASMC、MRC-5、AEPiC）中引起的caspase活化和细胞损伤显著减少。[1] 在慢性体内研究中，SC-9荷瘤小鼠每日口服帕莫非替尼（TAS-115），剂量为200 mg/kg/天，持续6周，耐受性良好，未观察到体重减轻。[1] 与舒尼替尼不同，帕莫非替尼（TAS-115）在体外或大鼠心肌细胞中均不抑制AMP活化蛋白激酶（AMPK）活性，而舒尼替尼则抑制AMPK（IC₅₀ = 0.061 µM）并诱导心肌细胞损伤。 [1]

[1]. The novel VEGF receptor/MET-targeted kinase inhibitor TAS-115 has marked in vivo antitumor properties and a favorable tolerability profile. Mol Cancer Ther. 2013 Dec;12(12):2685-96.

[2]. Triple inhibition of EGFR, Met, and VEGF suppresses regrowth of HGF-triggered, erlotinib-resistant lung cancer harboring an EGFR mutation. J Thorac Oncol. 2014 Jun;9(6):775-83.

帕莫非替尼（TAS-115）是一种新型口服双重VEGFR和MET酪氨酸激酶抑制剂，旨在克服现有VEGFR抑制剂的局限性，例如毒性和耐药性。其高选择性和良好的耐受性使其能够每日持续给药，无需停药期或剂量调整，这对于维持抗血管生成和抗肿瘤疗效至关重要。同时抑制VEGFR和MET可能通过同时靶向肿瘤血管生成和MET驱动的肿瘤生长、侵袭和耐药机制，产生协同抗肿瘤活性。[1]

C27H23FN4O4S

518.56

518.142

C, 62.54; H, 4.47; F, 3.66; N, 10.80; O, 12.34; S, 6.18

1190836-34-0

Pamufetinib mesylate;1688673-09-7

44247727

Solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.678

4.38

134

3

7

7

37

798

0

S=C(N([H])C(C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])=O)N([H])C1C([H])=C([H])C(=C(C=1[H])F)OC1C([H])=C([H])N=C2C([H])=C(C(C(N([H])C([H])([H])[H])=O)=C([H])C2=1)OC([H])([H])[H]

ORRNXRYWGDUDOG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H23FN4O4S/c1-29-26(34)19-14-18-21(15-24(19)35-2)30-11-10-22(18)36-23-9-8-17(13-20(23)28)31-27(37)32-25(33)12-16-6-4-3-5-7-16/h3-11,13-15H,12H2,1-2H3,(H,29,34)(H2,31,32,33,37)

4-[2-fluoro-4-[(2-phenylacetyl)carbamothioylamino]phenoxy]-7-methoxy-N-methylquinoline-6-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。