TCN-201

GluN1/GluN2A (NR1/NR2A)-containing N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs).
Selectivity: Shows >300-fold selectivity for GluN1/GluN2A over GluN1/GluN2B receptors [1].
In functional assays, it is inactive at GluN1/GluN2B and GluN1/GluN2D receptors up to 30 µM [1][2].

化合物 1，TCN 201，其 pIC50 值分别为 <4.3 和 6.8，表明其对 GluN1/GluN2A NMDAR 的选择性高于 GluN1/GluN2B NMDAR [1]。在卵母细胞中，TCN 201 (10 μM) 仅轻微抑制 GluN1/GluN2B NMDAR 介导的电流 [2]。在卵母细胞中，TCN 201 (10-30 μM) 对 NMDAR 介导的反应表现出更强的拮抗作用，且该作用依赖于亚型和甘氨酸 [2]。在卵母细胞中，TCN 201 (0.1-100 μM) 并不能完全阻断 NMDAR 介导的反应 [2]。在大鼠皮层神经元中，TCN 201 (10 μM) 对 NMDAR 介导电流的拮抗活性与其对伊芬普罗地尔的敏感性呈负相关 [2]。在鸡视网膜中，TCN 201 (1-9 μM) 可抑制皮层扩散性抑制 (CSD) [3]。重组 GluN1/GluN2A 受体拮抗作用：在 U-2 OS 细胞中表达的人重组 NR1/NR2A 受体上，TCN-201（简称化合物 1）在 FLIPR/Ca2+ 检测中完全抑制（92-100%）该受体，pIC50 为 6.8（IC50 ≈ 158 nM）。在浓度高达 50 µM 时，TCN 201 对 NR1/NR2B 受体没有活性（pIC50 <4.3）[1]。
- 电生理活性：在表达人NR1/NR2A受体的HEK 293T细胞的全细胞膜片钳实验中，TCN-201在3 µM甘氨酸存在下抑制了30 µM NMDA诱导的电流，IC50值为109 nM（pIC50 = 7.0 ± 0.1），Hill斜率为1.4 ± 0.3 [1]。
- 作用机制研究（FLIPR）：在表达NR1/NR2A的U-2 OS细胞中，TCN-201（以及化合物2、3、6、13）的抑制作用可被1 mM甘氨酸逆转，但不能被1 mM L-谷氨酸逆转。这表明其作用机制依赖于甘氨酸[1]。
- 重组受体（非洲爪蟾卵母细胞）中的拮抗作用：在表达 GluN1/GluN2A 受体的非洲爪蟾卵母细胞的 TEVC 记录中，TCN-201 拮抗了 NMDAR 介导的反应。阻断程度取决于 GluN1 位点共激动剂（甘氨酸或 D-丝氨酸）的浓度，但与谷氨酸浓度无关。例如，当谷氨酸浓度为 30 µM，甘氨酸浓度为 3 µM 时，抑制率约为 82%；而当谷氨酸浓度为 30 µM，甘氨酸浓度为 30 µM 时，抑制率约为 51% [2]。
- IC50 测定（非洲爪蟾卵母细胞）：利用 TEVC 技术，TCN-201 对 GluN1/GluN2A 受体的 IC50 值取决于 GluN1 激动剂的浓度。在谷氨酸浓度固定为 30 µM 的情况下，IC50 值分别为：3 µM 甘氨酸时为 0.446 µM（Hill 斜率 1.42）；10 µM 甘氨酸时为 0.746 µM（Hill 斜率 1.49）；30 µM 甘氨酸时为 3.89 µM（Hill 斜率 1.17）。使用 D-丝氨酸时，IC50 值分别为：3 µM D-丝氨酸时为 0.326 µM（Hill 斜率 1.57）；10 µM D-丝氨酸时为 0.816 µM（Hill 斜率 1.33）； 30 µM D-丝氨酸的浓度为 1.92 µM（Hill 斜率为 1.17）[2]。
- 天然 NMDAR 拮抗作用（皮层神经元）：在大鼠皮层神经元中，TCN-201 (10 µM) 在 GluN2B 表达占主导地位的早期培养物（DIV 9-10）中对 NMDA 诱发电流的阻断作用最小（5 ± 2%）。在较老的培养物（DIV 15-18）中，阻断作用更大（16 ± 3%）。在转染 GluN2A 的神经元中，阻断作用为 47 ± 4%。TCN-201 的阻断程度与 GluN2B 选择性拮抗剂伊芬普罗地尔产生的阻断作用呈负相关（R² = 0.91）[2]。
- 选择性分析：TCN-201在10 µM浓度下测试时，对包括离子通道（TRPV4、hERG、hNaV1.5）、受体（腺苷受体、肾上腺素受体、大麻素受体、多巴胺受体、组胺受体、乙酰胆碱受体、血清素受体、神经激肽受体、阿片受体、血管加压素受体）、酶（环氧合酶、磷酸二酯酶）和转运蛋白（去甲肾上腺素、血清素）在内的30多个靶点均表现出高特异性[1]。

患有皮层扩散性抑制（CSD）的大鼠对TCN-201（10 mg/kg；腹腔注射）的血氧水平依赖性（BOLD）信号反应不足[4]。

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与体外研究结果相反，先前一项使用BOLD fMRI在大鼠中进行的研究表明，TCN-201并未改变CSD的传播特征。这种差异可能归因于不同的记录方法：BOLD fMRI主要基于脑特异性血流动力学反应，而固有光学信号则基于鸡视网膜的神经元活动。TCN-201是否能通过电生理学方法在体内改变CSD，还需要进一步研究[3]。

大鼠皮质膜放射性配体置换：为了确定结合位点，我们对大鼠脑皮质膜进行了单浓度（10 µM）置换结合实验。TCN-201置换谷氨酸位点拮抗剂[3H]CGP 39653 36%。它对甘氨酸位点拮抗剂[3H]MDL 105,519（24%）、孔道阻滞剂[3H]TCP（11%）和NR2B NTD配体[3H]ifenprodil（16%）的置换率均较低（<25%）[1]。
- [3H]CGP 39653 置换曲线：在与 [3H]CGP 39653 竞争性结合大鼠脑皮层膜的实验中，TCN-201 部分抑制了特异性结合，最大置换率为 44 ± 3%，pIC50 为 6.5 ± 0.1（Hill 斜率为 0.8 ± 0.1，n=5）[1]。

重组U-2 OS细胞的FLIPR/Ca2+检测：将含有NR1和NR2A（或NR2B）NMDAR亚基的BacMam载体瞬时转染至人骨肉瘤（U-2 OS）细胞。将细胞接种于384孔板中。次日，在含有丙磺舒（2.5 mM）的检测缓冲液中加入胞质钙指示剂Fluo-4 AM（2 µM）以防止染料外流。洗涤去除氯胺酮后，将细胞板置于FLIPR仪器中。加入拮抗剂TCN-201（或其他化合物），并监测5分钟的荧光（激发波长488 nm，发射波长540 nm）。将反应值标准化为30 µM (+)-MK-801诱导的最大反应值。为了研究作用机制，在加入化合物 5 分钟后，再次加入 1 mM 甘氨酸或 L-谷氨酸，并继续测量荧光 5 分钟 [1]。
- 大鼠皮层神经元 FLIPR/Ca2+ 检测：将胚胎第 18/19 天的 Sprague-Dawley 大鼠皮层神经元培养 15 天。在检测当天，洗涤培养物，并用 Fluo-4 AM (2 µM) 和丙磺舒 (2.5 mM) 进行标记。洗涤后，将细胞转移至 FLIPRTETRA 系统。为了评估拮抗剂活性，首先将细胞暴露于不同浓度的测试药物（例如，TCN-201）10 分钟，然后暴露于亚最大浓度的 NMDA（EC50 10–20 µM）3 分钟。 Ca2+ 反应以曲线下面积 (AUC) 进行量化，并以 NMDA 诱发的反应进行标准化 [1]。
- HEK 293T 细胞全细胞膜片钳电生理学：将人胚肾 (HEK) 293T 细胞瞬时转染人 NMDAR 亚基（NR1/NR2A、NR1/NR2B 或 NR1/NR2D）和用于筛选的 EGFP 质粒。在 -60 mV 的钳制电位下进行全细胞电压钳记录。通过每 60 秒快速将细胞外液更换为含有 NMDA (30 µM) 和甘氨酸 (3 µM) 的溶液，持续 5 秒来诱发电流。为了测试拮抗剂，将 TCN-201 与激动剂共同施加。对于浓度-反应曲线 (CRC)，累积施加浓度递增的 TCN-201（0.03 至 3 µM）[1]。
- 非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳 (TEVC)：将大鼠 GluN1 和 GluN2A 或 GluN2B 亚基的 cRNA 注射到非洲爪蟾卵母细胞中。TEVC 记录在室温下进行，钳制电位为 -30 至 -40 mV。浴液中含有 BaCl2 和 EDTA 以螯合 Zn2+。在拮抗剂实验中，TCN-201 与谷氨酸 (3-30 µM) 和甘氨酸或 D-丝氨酸 (3-30 µM) 共同施加。对于Schild分析，在不存在和存在递增浓度的TCN-201（0.3、1、3、10 µM）的情况下，构建了甘氨酸的两点浓度-反应曲线[2]。

实验采用8-28日龄的雄性雏鸡。将后眼球置于灌注室中，以0.5 ml/min的流速灌注林格氏液。在32°C恒温条件下，组织稳定至少30分钟后，诱导皮层扩散性抑制（CSD）。通过注入1 μl 0.1 μM KCl溶液诱导视网膜扩散性抑制（RSD）。重复诱导10次CSD，每次间隔20分钟以使组织恢复。使用高功率LED聚光灯（峰值波长625 nm）以1 Hz的频率照射视网膜25 ms。同时使用单色相机记录反射光。从诱发CSD开始，以1 Hz的频率连续拍摄3分钟的图像序列[3]。
对于TCN-201测试，使用的浓度分别为1、3和9 μM。 DMSO用作溶剂对照，最高浓度0.1%的DMSO对鸡视网膜的皮层扩散性抑制（CSD）无影响。每个实验诱导10次CSD发作：初始林格氏液对照；低浓度药物或溶剂；中浓度；高浓度；以及林格氏液对照处理后（药物去除）。在每个测试序列中，灌注液在第2、4、6和8次CSD记录结束后立即更换[3]。

[1]. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. J Pharmacol Exp Ther. 2010 Dec; 335(3): 636-44.

[2]. TCN 201 selectively blocks GluN2A-containing NMDARs in a GluN1 co-agonist dependent but non-competitive manner. Neuropharmacology. 2012 Sep; 63(3): 441-9.

[3]. NR2A contributes to genesis and propagation of cortical spreading depression in rats. Sci Rep. 2016 Mar 22;6:23576.

[4]. Involvement of NMDA receptor subtypes in cortical spreading depression in rats assessed by fMRI. Neuropharmacology. 2015 Jun; 93:164-70.

背景与创新点：TCN-201（原名化合物1）是从一项包含约200万个化合物的高通量筛选(HTS)活动中发现的。它是一种磺酰胺衍生物。据作者所知，它是最早报道的对NR1/NR2A受体具有高度选择性的化合物之一[1]。
- 作用机制（推测）：其作用机制为非竞争性变构作用。Schild分析显示，在较高拮抗剂浓度下，其作用强度与浓度呈非线性关系，这与变构非竞争性机制相符。推测其结合位点位于谷氨酸和甘氨酸结合位点附近，可能位于GluN1和GluN2激动剂结合域之间的二聚体界面，从而加速甘氨酸/D-丝氨酸从GluN1亚基上的解离。这种抑制作用可被甘氨酸克服，但不能被谷氨酸克服[1][2]。
- 效力比较：TCN-201的效力约为相关化合物TCN-213（也称为化合物13）的30倍。TCN-201的pA2值为7.15，而TCN-213的pA2值为5.69 [2]。
- 实验局限性：TCN-201的应用受限于两个因素：1）其阻断含GluN2A亚基的NMDAR的能力强烈依赖于GluN1位点激动剂（甘氨酸或D-丝氨酸）的浓度，即使在这些激动剂达到饱和浓度时，也无法完全阻断。2）其在生理盐溶液中的溶解度较低，限制了可测试的浓度范围[2]。

C21H17N3O4FSCL

461.89378

461.061

852918-02-6

852918-02-6;

4787937

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.625

4.13

116.24

3

6

6

31

719

0

FYIBXBFDXNPBSF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H17ClFN3O4S/c22-18-12-17(10-11-19(18)23)31(29,30)24-13-14-6-8-16(9-7-14)21(28)26-25-20(27)15-4-2-1-3-5-15/h1-12,24H,13H2,(H,25,27)(H,26,28)

N-[[4-(benzamidocarbamoyl)phenyl]methyl]-3-chloro-4-fluorobenzenesulfonamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。  (2). 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~541.25 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。