BMX (IC50 = 6 nM); BTK (IC50 = 6.8 nM); TEC (IC50 = 48 nM); TXK (IC50 = 92 nM); BLK (IC50 = 0.3 μM); ERBB4 (IC50 = 0.77 μM); EGFR (IC50 = 3.02 μM); JAK3 (IC50 = 5.52 μM); ERBB2 (IC50 = 7.31 μM)
The primary target of Tirabrutinib HCl is Bruton's tyrosine kinase (BTK), a critical enzyme in the B-cell receptor signaling pathway. It acts as a potent, selective, and irreversible inhibitor, covalently binding to BTK. The compound has an IC50 of 6.8 nM and can cross the blood-brain barrier (BBB).

盐酸替布替尼（0.1-1000 nM 或 0.001-100 nM；72 小时）可抑制 OCI-L Y10 和 SU-DHL-6 细胞的生长，其 IC50 值分别为 9.127 nM 和 17.10 nM [1]。盐酸替布替尼（0.5、5、50 μM；24、48 小时）可诱导 SU-DHL-6 细胞凋亡；这需要大剂量和长时间给药（浓度高达 50 μM 时孵育 48 小时）[1]。在 TMD8 细胞中，盐酸替布替尼（300 nM，72 小时）可导致 caspase-3 和 PARP 裂解 [2]。替布替尼与 BTK Cys-481 发生不可逆的共价结合。本研究测量了失活效率 kinact/Ki，并利用该值计算了四种抑制剂对不同激酶的选择性。Tirabrutinib 对 BTK 的 kinact/Ki 值为 2.4 ± 0.6 × 10⁴ M⁻¹ s⁻¹，且对重要的脱靶激酶具有选择性。结论：对于本研究中测试的 BTK 抑制剂，失活动力学分析比传统的单点抑制测定方法能更准确地评估其效力和选择性。临床试验中测试的 BTK 抑制剂之间存在细微但明显的差异，这些差异可能转化为不同的临床疗效和安全性。总体意义：这是首个对四种具有临床意义的 BTK 抑制剂在 BTK 及相关激酶的失活方面进行详细并排比较的研究。[3]
体外实验表明，Tirabrutinib HCl 对多种 B 细胞恶性肿瘤具有强效的细胞毒性作用。它能抑制BTK活性，从而抑制B细胞受体信号传导并诱导癌细胞凋亡。该化合物的活性已在多种体外模型中得到证实。

单次口服盐酸替布替尼（10 mg/kg）可迅速被脑组织和血浆吸收，给药后两小时达到最大浓度（血药浓度Cmax = 339.53 ng/mL，脑组织浓度Cmax = 28.9 ng/mL）[1]。体内研究表明，盐酸替布替尼（6、20 mg/kg；口服；每日一次，持续3周）具有抑制肿瘤生长的作用[2]。
体内研究表明，盐酸替布替尼在小鼠模型中具有抗肿瘤活性。该药已在日本获批用于治疗复发或难治性原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）。该药为口服给药，通常耐受性良好。

共价结合测定[3]
蛋白质标记实验采用终浓度为2 μM的BTK，缓冲液包含10 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM氯化钠、10 mM氯化镁、2 mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)和1%甘油。抑制剂的终浓度为10 μM，所有样品中DMSO的终浓度均为1%。测试了四种条件，每种条件重复三次：BTK + tirabrutinib、BTK + staurosporine、BTK + ibrutinib和BTK + DMSO对照。化合物加入后，样品在4 °C下于旋转摇床（1200 rpm）中孵育过夜。孵育18小时后，从每种条件下收集等分试样进行分析，并将此时间点称为t = pre-chase。随后，在剩余样品中加入伊布替尼，使其最终浓度达到100 μM，对BTK + tirabrutinib和BTK + staurosporine样品进行追逐步骤。向BTK + ibrutinib和BTK + DMSO对照样品中加入等量的DMSO，以保持体积相同。在4 °C下孵育6小时后，收集剩余样品，即最终时间点t = post-chase。在收集时立即使用质谱和酶活性测定法分析两个时间点的等分试样。质谱分析使用配备Agilent 1200快速分离高效液相色谱仪的Agilent 6210飞行时间质谱仪，并使用Masshunter B.05采集软件进行数据采集。样品在安捷伦 Zorbax 300 Extend C18 快速分离柱上进行分离，柱温 70 °C，采用反相色谱法，流动相为含 0.1% 甲酸的乙腈，梯度为 20% 至 90%。数据使用安捷伦 MassHunter 定性分析 B.06 软件进行处理，采用 BioConfirm 工作流程进行蛋白质解卷积，以获得中性质量值。

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与 BTK Cys-481 的共价结合[3]
样品制备如下：将 25 μg (2 μM) 内部重组 BTK 蛋白在 50 mM 碳酸氢铵和 10 μM 替拉替尼中于 37 °C 孵育 1 小时。然后用 5 mM DTT 在 55 °C 下还原 45 分钟，再用 10 mM 碘乙酰胺在 25 °C 下烷基化 1 小时。样品先用 GluC 内切蛋白酶以 50:1 的比例在 37 °C 下消化 12 小时，再加入胰蛋白酶以 50:1 的比例在 37 °C 下继续消化 4 小时，得到预期的 BTK 靶肽序列 YMANGCLLNYLR。消化后的样品经冻干后，用 3% 乙腈和 0.1% 甲酸溶液重悬，并进行质谱分析。
质谱分析步骤如下：使用 ThermoFisher UltiMate 3000 RSLCnano 系统进样。分离采用 ThermoFisher Scientific ES800 Easy Spray 液相色谱柱（150 mm × 75 μm），流速为 300 nL/min，流动相 A 为 1% 乙腈、0.1% 甲酸，流动相 B 为 90% 乙腈、0.1% 甲酸，梯度洗脱时间为 60 min [3% B - 35% B (45 min)，35% B - 90% B (15 min)，90% B (5 min)，重新平衡 (20 min)]。质谱分析采用 ThermoFisher Q-Exactive HF 质谱仪，使用前 20 个数据依赖采集模式。自动增益控制设置下，MS 扫描（60 K 分辨率）的填充时间为 50 ms，离子计数为 3E6；MS/MS 扫描（15 K 分辨率）的填充时间为 100 ms，离子计数为 1E5。使用 Proteome Discoverer 2.2 软件，以 Swissprot 人类数据库为数据库，通过 tirabrutinib 的可变化学修饰进行数据检索。

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在 Z'-LYTE™ 和 LanthaScreen™ 检测中测定 tirabrutinib、ibrutinib、acalabrutinib 和 spebrutinib 对 BTK 和其他酪氨酸激酶的 IC50 值[3]
首先在 Life Technologies/ThermoFisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆）使用标准的 Z'-LYTE™ 激酶或 LanthaScreen™ 结合检测方法，研究了 tirabrutinib、ibrutinib、acalabrutinib 和 spebrutinib 对 BTK 和其他 TEC 家族激酶的 IC50 值。在每项生化检测中使用了不同的酶浓度。各酶的浓度如下：0.26 nM BLK、6.2 nM BMX、3.1 nM BTK、8.3 nM EGFR、17.5 nM ERBB2、16.2 nM ERBB4、30.0 nM ITK、2.7 nM JAK3、8.1 nM TXK 和 1 nM TEC。反应在室温下进行 1 小时。详细的检测条件见补充数据。

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BTK 酶活性和 IC50 评估[3]
使用 LanthaScreen™ 检测试剂盒测定荧光素标记底物的磷酸化情况来定量 BTK 活性。最终反应混合物包含激酶缓冲液 A [50 mM HEPES (pH 7.5)、10 mM MgCl2、0.01% Brij-35、1 mM EGTA 和 0.5 mg/mL BSA]、200–300 pM BTK、0.2 μM 荧光素标记的聚 GT 底物和 180 μM ATP (2× Km)。所有预孵育和反应均在室温下于黑色 96 孔非结合表面 (NBS™) 检测板中进行。为了评估质谱分析中所用样品中的酶活性，将每份样品的等分试样稀释至激酶反应缓冲液 A 中含有 300 pM BTK 和 1.5 nM 抑制剂。对于 IC50 测定，使用 HP D300 液体分配器制备化合物稀释液，并将反应中 DMSO 的最终浓度保持在 1%。在缓冲液 A 中将抑制剂和 BTK 预孵育 30 分钟后，加入等体积的 2× 荧光素-Poly GT 底物和 ATP（溶于缓冲液 A），启动激酶反应，使最终反应体系总体积为 100 μL，其中 BTK 的浓度为 200 pM。激酶反应进行 30 分钟后，加入 100 μL 溶于 Life Technologies TR-FRET 稀释缓冲液的 2× EDTA/LanthaScreen™ Tb-PY20 抗体混合物终止反应，使 EDTA 的最终浓度为 10 mM，抗体的最终浓度为 2 nM。反应在室温下至少孵育 90 分钟后，使用 TECAN Infinite M1000 Pro 多功能酶标仪读取荧光强度（激发波长 332 nm，发射波长 486/515 nm）。 515 nm 和 486 nm 处的荧光强度比值用于衡量产物生成量。将 TR-FRET 比值与抑制剂浓度作图，并以酶/无酶对照组进行归一化。使用 GraphPad Prism 软件，通过四参数逻辑拟合计算 IC50 值。

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BTK[3] 失活动力学的测定
使用基于 Sox 的荧光测定法研究了酶失活速率与抑制剂浓度的关系，该方法可以实时测量酶活性。在该测定中，激酶活性通过 Sox 标记底物磷酸化引起的荧光强度增加来测量。简而言之，在反应缓冲液 B [20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、5 mM β-甘油磷酸钠、1 mM EGTA、5 mM MgCl2 和 5% 甘油] 中配制含有 1.3× Sox 标记底物、ATP 和 DTT 的 Master Mix。将 75 μL 预混液加入到含有 1 μL 化合物 DMSO 溶液的检测板中。除仅使用反应缓冲液 B 的无酶对照组外，其余各组均加入 25 μL 4× 自制重组 BTK 蛋白（溶于反应缓冲液 B）启动反应。最终的检测混合物包含 5 nM BTK、10 μM Sox 标记的底物 AQT0101（伊布替尼使用 AQT0104）、300 μM ATP（2× Km）和 200 μM DTT，溶于反应缓冲液 B 中。使用 TECAN Infinite M1000 Pro 多功能酶标仪，在室温下每 30 秒采集一次荧光强度读数（激发波长 360 nm/发射波长 485 nm），持续 4 小时。

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EGFR、BMX、ITK 和 TEC 失活动力学的测定[3]
测试了替拉布替尼、伊布替尼、阿卡布替尼和斯普布替尼对 EGFR 和 TEC 家族激酶 BMX、ITK 和 TEC 的酶抑制作用。抑制剂的失活动力学研究方法与之前描述的BTK类似：EGFR浓度为2.5 nM，ATP浓度为70 mM（2×Km）；BMX浓度为1.25 nM，ATP浓度为100 mM（2×Km）；ITK浓度为5 nM，ATP浓度为50 mM（2×Km）；TEC浓度为2.5 nM，ATP浓度为80 mM（2×Km）。所用的Sox底物分别为：EGFR使用AQT0001，BMX和ITK使用AQT0025，TEC使用AQT0102。选择性定义为化合物与 BTK 结合的动力学参数 kinact/Ki 与化合物与 EGFR、ITK、BMX 或 TEC 结合的动力学参数 kinact/Ki 的比值。
盐酸替拉布替尼的体外酶或受体结合试验包括测量其对 BTK 激酶活性的抑制作用。该试验使用纯化的重组 BTK 酶和肽底物，并在 ATP 存在下进行。底物的磷酸化通过放射性或荧光法进行测量。将化合物与酶和底物在不同浓度下孵育，以确定 IC50 (6.8 nM)。

细胞增殖试验[1]
细胞类型： SU-DHL-6 和 OCI-LY Y10 细胞
测试浓度： 0.1-1000 nM；0.001nM-100nM。
孵育时间： 72 小时
实验结果： 对 OCI-LY Y10 和 SU-DHL-6 细胞均表现出良好的抗增殖活性，IC50 值分别为 9.127 nM 和 17.10 nM。

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细胞凋亡分析[1]
细胞类型： SU-DHL-6 细胞
测试浓度： 0.5、5、50 μM
孵育时间： 24、48 小时
实验结果： 当浓度达到 50 μM 并孵育 48 小时后，可诱导细胞凋亡。

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蛋白质印迹分析[2]
细胞类型： TMD8 细胞
测试浓度： 300 nM
孵育时间： 72 小时
实验结果： caspase-3 和 PARP 裂解的诱导。

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细胞死亡评估[2]
本研究中使用的细胞系此前已有描述，均来自原始作者或德国微生物和细胞培养物保藏中心 (DSMZ)。细胞系的身份通过中期细胞遗传学和短串联重复序列分析得到确认。细胞系在添加 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中培养。使用 CellTiterGlo® 细胞活力检测或 AnnexinV-FITC 染色法检测细胞系对替拉替尼的敏感性以及联合治疗的效果。EC50 值的计算使用 GraphPad Prism 软件完成。通过将 TMD8 细胞连续暴露于浓度范围为 3 nM 至 1000 nM 的替拉替尼中 9 个月，直至建立稳定的替拉替尼耐药性，从而构建替拉替尼耐药 TMD8 (TMD8R) 细胞系。具体而言，替拉替尼的浓度从 3、6、12、25、40、60、80、100、200、400、800 和 1000 nM 逐步增加。每周进行两次细胞传代。当细胞生长良好时，用含有相同浓度替拉替尼的新鲜培养基重悬细胞（最终细胞密度为 100,000 个细胞/mL）。在每次传代过程中，均使用 CellTiterGlo® 检测细胞对替拉替尼的敏感性。TMD8R 的突变状态通过 Sanger 测序确定。联合指数基于 Chou-Talalay 多药效应方程，使用 CalcuSyn 计算。
使用 B 细胞恶性肿瘤细胞系进行替拉替尼盐酸盐的体外细胞实验。用该化合物处理细胞，并使用标准方法评估细胞活力、增殖和凋亡。BTK 磷酸化及其下游信号通路通过蛋白质印迹法分析。

动物/疾病模型：雄性SD大鼠（219.0–260.5g）[1]。
剂量：10 mg/kg
给药途径：口服；单次给药。
实验结果：1.19 替拉替尼在雄性SD大鼠体内的药代动力学/PK参数[1]。血浆Cmax（ng/mL）脑Cmax（ng/mL）渗透性（%，脑Cmax/血浆Cmax）口服（10 mg/kg）339.53 28.9 8.5

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动物/疾病模型：免疫缺陷（SCID）小鼠（小鼠异种移植模型）[2]。
剂量： 6、20 mg/kg
给药途径： 口服（po，即灌胃），每日一次，持续3周。
实验结果： 抑制肿瘤生长。当剂量达到20 mg/kg时，肿瘤在第14天完全被抑制。
Tirabrutinib HCl的体内动物实验采用B细胞恶性肿瘤小鼠异种移植模型进行。将荷皮下肿瘤的小鼠用该化合物治疗，并随时间测量肿瘤体积。评估该化合物对肿瘤生长和生存的影响。

对于局限于脑部的疾病，伊布替尼和替拉布替尼可能比泽布替尼更合适[1]。抑制和凋亡实验表明，需要长时间维持较高的药物浓度才能完全抑制肿瘤细胞。因此，为了确定BTK抑制剂治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）的可行性，我们测试了它们是否能在脑内维持有效的肿瘤抑制药物浓度。SD大鼠单次口服BTK抑制剂。在特定时间点采集血浆和脑组织样本以检测药物浓度（图4）。如图4所示，三种BTK抑制剂均能被血浆和脑组织迅速吸收。伊布替尼和特拉替尼在给药后2小时均达到血浆峰浓度（Cmax），并在血液和脑组织中维持相对稳定的浓度水平（伊布替尼：血浆Cmax = 412.7 ng/mL，脑组织Cmax = 40.4 ng/mL，n=3；特拉替尼：血浆Cmax = 339.53 ng/mL，脑组织Cmax = 28.9 ng/mL，n=3）。然而，泽布替尼在给药后0.5小时即迅速达到血浆和脑组织峰浓度，且其血浆浓度下降速度略快于其他BTK抑制剂。另一方面，泽布替尼在脑组织中的浓度急剧下降，并在给药后4小时降至检测限以下。由于每种 BTK 抑制剂在血液和脑组织中均同时达到 Cmax（伊布替尼和特拉替尼：口服给药后 2 小时；泽布替尼：口服给药后 0.5 小时），因此在达到 Cmax 时计算了游离脑组织与血浆的浓度比。泽布替尼、特拉替尼和伊布替尼的游离脑组织与血浆浓度比分别为 3.5%、8.5% 和 9.8%（表 2）。伊布替尼的该比值略高于特拉替尼。然而，泽布替尼的该比值远低于伊布替尼和替拉替尼，表明其穿过血脑屏障的能力不如伊布替尼和替拉替尼。总之，这些数据表明，口服伊布替尼、替拉替尼和泽布替尼后均能迅速被吸收入血并分布至脑组织。与泽布替尼相比，伊布替尼和替拉替尼具有更强的血脑屏障穿透能力，并能在脑内维持较高且稳定的浓度，从而使这些抑制剂能够在脑内发挥抗肿瘤作用，使其成为治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）更有前景的候选药物。替拉替尼盐酸盐的药代动力学（PK）特性表明其具有口服生物利用度。该化合物的分子量为490.94，分子式为C25H23ClN6O3。CAS号为1439901-97-9。IUPAC名称为(R)-6-氨基-9-(1-(丁-2-炔酰基)吡咯烷-3-基)-7-(4-苯氧基苯基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮盐酸盐。

ONO-4059耐受性良好，未观察到剂量限制性毒性（DLT）。14例患者中，6例报告了18例与ONO-4059相关的不良事件；其中10例为CTCAE-V4.0 G1级（6例患者中的1例），5例为G2级。2例患者报告了3例与ONO-4059相关的G3级血液学毒性：血小板减少症（2例）和贫血。未报告与ONO-4059相关的G4级不良事件、严重不良事件（SAE）或感染。ONO-4059的药代动力学特征为吸收和消除迅速，半衰期约为6小时，暴露量随剂量增加而增加，无ONO-4059蓄积，且患者间和患者内变异性低。在所有剂量水平下，外周血中Btk的占有率（通过磷酸化Btk测定）至少维持24小时。
Tirabrutinib HCl的毒理学数据显示其总体耐受性良好。常见副作用可能包括腹泻、恶心和疲劳。该化合物也可能引起中性粒细胞减少症和感染。目前正在进行的临床试验中评估其长期安全性数据。

[1]. Bruton's tyrosine kinase inhibitors in primary central nervous system lymphoma-evaluation of anti-tumor efficacy and brain distribution. Transl Cancer Res. 2021 May;10(5):1975-1983.

[2]. Responses to the Selective Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) Inhibitor Tirabrutinib (ONO/GS-4059) in Diffuse Large B-cell Lymphoma Cell Lines. Cancers (Basel). 2018 Apr 23;10(4):127.

[3]. Biochemical characterization of tirabrutinib and other irreversible inhibitors of Bruton's tyrosine kinase reveals differences in on - and off - target inhibition. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2020 Apr;1864(4):129531.

[4]. Dhillon S. Tirabrutinib: First Approval. Drugs. 2020 Jun;80(8):835-840.

盐酸替拉替尼是替拉替尼的盐酸盐形式，是一种口服制剂，含有布鲁顿氏无丙种球蛋白血症酪氨酸激酶 (BTK) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，替拉替尼与 B 细胞内的 BTK 共价结合，从而阻断 B 细胞受体信号传导并抑制 B 细胞发育。因此，该药物可能抑制 B 细胞恶性肿瘤的增殖。BTK 是一种胞质酪氨酸激酶，属于 Tec 激酶家族，在 B 淋巴细胞的发育、激活、信号转导、增殖和存活中起着至关重要的作用。
其他信息：盐酸替拉替尼也称为 ONO-4059、GS-4059 和 Steboronine。它是一种强效且选择性的 BTK 抑制剂，已在日本获批用于治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤 (PCNSL)。其 UNII 为 U374135N48。该化合物仅供研究使用。

C25H23CLN6O3

490.948

490.152

C, 61.16; H, 4.72; Cl, 7.22; N, 17.12; O, 9.78

1439901-97-9

Tirabrutinib;1351636-18-4;ONO-4059 analog;1351635-67-0

71571562

White to off-white solid powder

2.31

105Ų

2

6

4

35

825

1

CC#CC(=O)N1CC[C@H](C1)N2C3=NC=NC(=C3N(C2=O)C4=CC=C(C=C4)OC5=CC=CC=C5)N.Cl

UQYDCIJFACDXSG-GMUIIQOCSA-N

InChI=1S/C25H22N6O3.ClH/c1-2-6-21(32)29-14-13-18(15-29)31-24-22(23(26)27-16-28-24)30(25(31)33)17-9-11-20(12-10-17)34-19-7-4-3-5-8-19/h3-5,7-12,16,18H,13-15H2,1H3,(H2,26,27,28)1H/t18-/m1./s1

(R)-6-amino-9-(1-(but-2-ynoyl)pyrrolidin-3-yl)-7-(4-phenoxyphenyl)-7,9-dihydro-8H-purin-8-one hydrochloride

GS4059; ONO-WG-307; ONO-4059 HCl; GS 4059; ONO4059; Tirabrutinib hydrochloride; ONO-4059 Hydrochloride; Tirabrutinib HCl; Tirabrutinib (hydrochloride); ONO-4059 (hydrochloride); GS-4059 hydrochloride; Ono-4059(HCl salt); ONO 4059; ONO-4059; GS-4059; Tirabrutinib HCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~203.69 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.09 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.79 mg/mL (3.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 17.9 mg/mL的澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中并混合均匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。