BMX (IC50 = 6 nM); BTK (IC50 = 6.8 nM); TEC (IC50 = 48 nM); TXK (IC50 = 92 nM); BLK (IC50 = 0.3 μM); ERBB4 (IC50 = 0.77 μM); EGFR (IC50 = 3.02 μM); JAK3 (IC50 = 5.52 μM); ERBB2 (IC50 = 7.31 μM)
Bruton’s tyrosine kinase (BTK) inhibitor. No specific IC50, Ki, or EC50 values for BTK were provided in this study. [1]

Tirabrutinib（0.1-1000 nM 或 0.001-100 nM；72 h）的 IC50 值分别为 9.127 nM 和 17.10 nM，限制 OCI-L Y10 和 SU-DHL-6 细胞的生长[1]。
Tirabrutinib（0.5、5、50 μM；24、48 小时）诱导 SU-DHL-6 细胞凋亡；然而，它需要高剂量和长时间给药（在高达 50 μM 的浓度下孵育 48 小时）[1]。
Tirabrutinib（300 nM，72 小时）会导致 TMD8 细胞中 caspase-3 和 PARP 裂解[ 2]。

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Tirabrutinib与BTK Cys-481不可逆共价结合。测量了失活效率kinact/Ki，并用于计算所研究的四种抑制剂在不同激酶之间的选择性。Tirabrutinib对BTK的kinact/Ki值为2.4±0.6 × 104 M-1 s-1，对重要脱靶有选择性。
结论:对于本研究中测试的BTK抑制剂，失活动力学分析比传统的单时间点抑制测量更准确地测量了效力和选择性。临床测试的BTK抑制剂之间存在细微但明显的差异，这可能转化为临床疗效和安全性的差异。
一般意义:这是第一个提供四种临床相关BTK抑制剂关于BTK和相关激酶失活的详细并排比较的研究。[3]

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Tirabrutinib在体外对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系具有抗增殖作用。
在SU-DHL-6细胞系中，Tirabrutinib处理72小时的IC50值为17.10 µM (n=2)。
在OCI-LY10细胞系中，Tirabrutinib处理72小时的IC50值为9.127 µM (n=2)。
在测试的三种BTK抑制剂（伊布替尼、赞布替尼、替拉鲁替尼）中，Tirabrutinib在两个细胞系中均显示出最弱的抗增殖效果。[1]
Tirabrutinib以剂量和时间依赖性的方式诱导SU-DHL-6细胞凋亡。当用高浓度Tirabrutinib（50 µM）处理细胞48小时后，可观察到晚期凋亡/死亡细胞（Annexin V+/7-AAD+）显著增加。在较低浓度（0.5 µM或5 µM）下处理24或48小时，未诱导显著的细胞凋亡。[1]

替拉替尼（10 mg/kg；口服；单次）快速进入大脑和血浆，给药后两小时达到其 C_max（血液 C_max = 339.53 ng/mL，脑 C_max = 28.9 ng/mL)[1].
替拉替尼（6、20 mg/kg；口服；每日一次，持续 3 周）可抑制体内肿瘤生长[2] 。

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在使用重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠皮下植入TMD8细胞的异种移植模型中，通过饮食口服给予Tirabrutinib，剂量相当于6、20和60 mg/kg/天，持续三周，可引起剂量依赖性的肿瘤消退。以0.012%的饮食浓度（约20 mg/kg/天）治疗导致所有动物（10/10）的肿瘤消退。任何治疗组均未观察到体重下降。
相比之下，相同的治疗（饮食中0.012%和0.037%）对植入Tirabrutinib耐药TMD8R细胞的小鼠的肿瘤生长没有影响。[2]

共价结合的测定[3]
蛋白标记实验采用终浓度为2 μM的BTK，在含有10 mM HEPES、pH 7.5、150 mM氯化钠、10 mM氯化镁、2 mM Tris(2-羧乙基)膦(TCEP)和1%甘油的缓冲溶液中进行。抑制剂的终浓度为10 μM，所有样品的终浓度为1% DMSO。四种条件分别为:BTK +替拉替尼、BTK + staurosporine、BTK +依鲁替尼、BTK + DMSO对照。添加化合物后，样品在旋转摇床(1200 rpm)中于4°C下孵育过夜。孵育18小时后，从每种条件中收集等分进行分析，此时间点称为t =预孵育。然后对剩余样品进行后续处理，将伊鲁替尼加入BTK +替若替尼和BTK + staurosporine样品中，最终浓度为100 μM。在BTK +依鲁替尼和BTK + DMSO对照样品中加入等量的DMSO以保持相同的体积。在4℃下孵育6小时后，在最终时间点(t = post-chase)收集剩余样品。在两个时间点采集的等分在收集时使用质谱法和酶活性测定法进行分析。
质谱分析采用Agilent 6210飞行时间质谱仪和Agilent 1200快速分辨率高效液相色谱，使用Masshunter B.05采集软件。样品在Agilent Zorbax 300 Extend C18快速分辨柱上运行，温度为70°C，采用反相色谱法，梯度从20%到90%乙腈(含0.1%甲酸)。使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.06处理数据，采用BioConfirm工作流，允许蛋白质反卷积以获得中性质量值。

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BTK Cys-481的共价结合[3]
样品制备方法为:25 μg (2 μM)的内部重组BTK蛋白在50 mM碳酸氢铵和10 μM替拉替尼中37℃孵育1 h。然后用5 mM DTT在55°C下还原45分钟，然后用10 mM碘乙酰胺在25°C下烷基化1小时。然后用50:1的葡聚糖内源性蛋白酶在37°C下酶切12小时，然后以50:1的比例加入胰蛋白酶，再在37°C下酶切4小时，得到序列为YMANGCLLNYLR的BTK的预期肽目标。消化后的样品冻干，再悬浮在3%乙腈、0.1%甲酸中，进行质谱分析。
质谱分析方法如下:样品使用ThermoFisher UltiMate 3000 rslnano系统进样。分离采用ThermoFisher Scientific ES800 Easy Spray LC色谱柱(150 mm × 75 μm)，流速为300 nL/min，梯度为60 min，使用1%乙腈，0.1%甲酸为溶剂a, 90%乙腈，0.1%甲酸为溶剂B [3% B - 35% B (45 min)， 35% B - 90% B (15 min)， 90% B (5 min)，再平衡(20 min)]。质谱分析在ThermoFisher Q-Exactive HF上进行，使用前20个数据依赖采集。自动增益控制设置使用50 ms填充时间和3E6离子计数的ms扫描(60 K分辨率)和100 ms文件时间和1E5离子计数的MSMS扫描(15 K分辨率)。使用Proteome Discoverer 2.2对Swissprot人类数据库进行数据检索，使用tirabrutinib进行可变化学修饰。

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Z'-LYTE™和LanthaScreen™试验中tirabrutinib、ibrutinib、acalabrutinib和spebrutinib对BTK和其他酪氨酸激酶的IC50测定[3]
tirabrutinib, ibrutinib, acalabrutinib和spebrutinib的IC50值首先在Life Technologies/ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)的标准Z'-LYTE™激酶或LanthaScreen™结合试验中对BTK和其他TEC家族激酶进行研究。每个生化分析中使用不同的酶浓度。各酶的浓度分别为:BLK 0.26 nM、BMX 6.2 nM、BTK 3.1 nM、EGFR 8.3 nM、ERBB2 17.5 nM、ERBB4 16.2 nM、ITK 30.0 nM、JAK3 2.7 nM、TXK 8.1 nM、TEC 1 nM。反应在室温下进行1小时。详细的实验条件可在补充数据中找到。

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BTK酶活性与IC50评价[3]
通过使用LanthaScreen™Assay Kit测定荧光素标记底物的磷酸化来定量BTK活性。最终的反应混合物含有激酶缓冲液A [50 mM HEPES (pH 7.5)， 10 mM MgCl2, 0.01% brij-35, 1 mM EGTA和0.5 mg/mL BSA]， 200-300 pM BTK, 0.2 μM荧光素- poly GT底物和180 μM ATP (2× Km)。所有预孵育和反应均在黑色96孔非结合表面(NBS™)分析板中进行，室温下进行。为了评估质谱分析中所用样品的酶活性，将每个样品的等分液稀释至300 pM BTK和1.5 nM激酶反应抑制剂.

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质谱法验证共价结合： 将重组BTK蛋白（2 µM）与10 µM Tirabrutinib（或对照：伊布替尼、星形孢菌素、DMSO）在4°C下孵育过夜。对于部分样品，通过添加100 µM伊布替尼并再孵育6小时进行"竞争"步骤。在竞争前和竞争后取样。使用LC-TOF质谱分析BTK的完整质量，以检测对应于化合物结合的质量位移。为了确认特定位点，将与Tirabrutinib孵育的BTK样品进行还原、烷基化，并用Glu-C和胰蛋白酶消化。通过LC-MS/MS分析所得肽段，并搜索Tirabrutinib引起的可变修饰以鉴定修饰肽。[3]
IC50测定（LanthaScreen实验）： 通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测荧光素标记的肽底物的磷酸化来测量BTK活性。反应体系包含0.2-0.3 nM BTK、0.2 µM荧光素-poly(GT)底物和180 µM ATP，置于测定缓冲液中。将Tirabrutinib的系列稀释液与BTK在室温下预孵育30分钟，然后通过添加底物/ATP启动反应。反应30分钟后，用EDTA/Tb-抗体混合物终止反应。再孵育90分钟后，读取荧光（激发332 nm，发射486/515 nm）。利用发射光比率（515/486 nm）计算抑制百分比，并通过将数据拟合到四参数逻辑曲线来确定IC50值。[3]
失活动力学（基于Sox的荧光实验）： 使用Sox标记的肽底物实时测量Tirabrutinib对BTK的失活速率，该底物磷酸化后荧光增强。实验体系包含5 nM BTK、10 µM Sox底物、300 µM ATP以及不同浓度的Tirabrutinib，置于反应缓冲液中。通过将BTK加入含有抑制剂和底物的混合物中来启动反应。在室温下，每30秒监测一次荧光（激发360 nm，发射485 nm），持续4小时。将反应进程曲线拟合到单指数方程，以获得每个抑制剂浓度下的观测速率常数 (kobs)。然后将kobs对[抑制剂]的图拟合到双曲线方程，以推导最大失活速率 (kinact) 和半最大失活的抑制剂浓度 (Ki)。当无法精确确定单独的kinact和Ki值时，失活效率常数 (kinact/Ki) 报告为低抑制剂浓度下kobs对[I]作图的斜率。该实验形式也用于在各自优化条件（酶浓度、ATP Km）下测定脱靶激酶（EGFR、BMX、ITK、TEC）的kinact/Ki。[3]
激酶选择性谱（Z’-LYTE/LanthaScreen实验）： 使用商业化的Z’-LYTE激酶活性或LanthaScreen结合实验测定针对十种酪氨酸激酶的选择性谱的IC50值。每种激酶的浓度不同（例如，BTK 3.1 nM，EGFR 8.3 nM，ITK 30.0 nM）。将Tirabrutinib进行系列稀释，与酶在室温下孵育1小时，然后根据制造商方案启动激酶反应。生成剂量反应曲线以计算IC50值。[3]

细胞系：SU-DHL-6 和 OCI-L Y10 细胞
浓度：0.1-1000 nM； 0.001 nM-100 nM
孵育时间：72 h
结果：对 OCI-L Y10 和 SU-DHL-6 细胞具有良好的抗增殖活性，IC50 分别为 9.127 nM 和 17.10 nM。

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细胞死亡评估[2]
本研究中使用的细胞系以前已经描述过，并且是从发起人或从Deutsche Sammlung von microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)获得的。通过中期细胞遗传学和短串联重复评估证实了细胞系的身份。细胞系在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中生长。细胞系对Tirabrutinib的敏感性以及联合处理使用CellTiterGlo®活力测定或AnnexinV-FITC染色进行。EC50的计算使用GraphPadPrism完成。Tirabrutinib耐药TMD8 (TMD8R)是通过连续暴露在3 nM至1000 nM的Tirabrutinib浓度下超过9个月产生的，直到对Tirabrutinib建立稳定的耐药性。其中，从3、6、12、25、40、60、80、100、200、400、800、1000 nM的浓度逐渐增加。细胞传代每周2次。当细胞生长良好时，用含有相同浓度的替拉替尼的新鲜培养基重新悬浮细胞(最终细胞密度为100,000个细胞/mL)。细胞对替拉替尼的敏感性在每一步通过CellTiterGlo®检测。通过Sanger测序确定TMD8R的突变状态。根据秋-塔拉莱的多重药效方程，用CalcuSyn计算联合指数。

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抑制实验： 培养DLBCL细胞系（SU-DHL-6和OCI-LY10）。收集对数生长期的细胞，重悬后接种到96孔板中。孵育24小时后，用六种或十种不同浓度的Tirabrutinib处理细胞72小时。二甲基亚砜（DMSO）用作溶剂对照。处理结束后，使用CCK-8试剂盒评估细胞活力。使用酶标仪在450 nm波长下测量吸光度。使用适当软件通过非线性回归分析计算半数抑制浓度（IC50）。每个实验重复两次。[1]
凋亡实验： 将SU-DHL-6细胞接种于96孔板。24小时后，用三种不同浓度（0.5 µM, 5 µM, 50 µM）的Tirabrutinib处理细胞24或48小时。DMSO作为对照。孵育结束后，收集细胞，根据试剂盒说明书用Annexin V和7-AAD进行染色。染色后的细胞用流式细胞仪进行分析。将细胞分为活细胞（Annexin V-/7-AAD-）、早期凋亡细胞（Annexin V+/7-AAD-）和晚期凋亡/死亡细胞（Annexin V+/7-AAD+）。[1]

雄性SD大鼠（219.0–260.5克）
10毫克/千克
口服；单次给药。

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小鼠异种移植模型[2]
为了评估替拉替尼的体内疗效，将1 × 10⁷个细胞悬浮于Matrigel中，皮下注射到重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内。当TMD8细胞的平均肿瘤体积达到400毫米³，替拉替尼耐药细胞的平均肿瘤体积达到200毫米³时，开始随机分组和治疗。随后，通过饲料分别给予小鼠0.0037%、0.012%和0.037%浓度的替拉替尼。结果发现，每日剂量与6、20和60毫克/千克/天的剂量相当。使用游标卡尺评估肿瘤生长情况。

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大鼠药代动力学研究：将雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠随机分为几组。一组大鼠单次口服tirabrutinib，剂量为10 mg/kg。该剂量根据临床等效剂量，并采用体表面积转换因子计算得出。给药后，分别在六个指定时间点（0.25、0.5、1、2、4和24小时）从颈静脉采集血样。离心血样获得血浆。在每个相应时间点，将大鼠断头处死，并收集全脑。将脑组织在生理盐水中匀浆。血浆和脑匀浆样品均冷冻保存，直至使用液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 分析药物浓度。[1]

伊布替尼和替拉布替尼可能比泽布替尼更适合治疗局限于脑内的疾病[1]。抑制和凋亡实验表明，需要较长时间维持较高的药物浓度才能完全抑制肿瘤细胞。因此，为了确定BTK抑制剂治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）的可行性，我们测试了它们是否能够在脑内维持有效抑制肿瘤的药物浓度。SD大鼠单次口服BTK抑制剂。在指定时间点采集血浆和脑组织样本以检测药物浓度（图4）。如图4所示，所有三种BTK抑制剂均能迅速被血浆和脑组织吸收。游离的伊布替尼和替拉替尼在给药后2小时均达到血药浓度峰值（Cmax），并在血液和脑组织中维持在相对稳定的水平（伊布替尼：血药浓度Cmax = 412.7 ng/mL，脑组织浓度Cmax = 40.4 ng/mL，n=3；替拉替尼：血药浓度Cmax = 339.53 ng/mL，脑组织浓度Cmax = 28.9 ng/mL，n=3）。而游离的泽布替尼在给药后0.5小时迅速达到血药和脑组织中的最大浓度，其血药浓度下降速度略快于其他BTK抑制剂。另一方面，在脑组织中，游离的泽布替尼浓度急剧下降，并在给药后4小时低于检测限。
由于每种BTK抑制剂在血液和脑组织中的Cmax均同时达到（伊布替尼和替拉替尼：口服给药后2小时；泽布替尼：口服给药后0.5小时），因此在达到Cmax时计算了游离脑组织与血浆的浓度比。泽布替尼、替拉替尼和伊布替尼的游离脑组织与血浆的浓度比分别为3.5%、8.5%和9.8%（表2）。伊布替尼的该比值略高于替拉替尼。然而，zanubrutinib 的这一比例远低于 ibrutinib 和 Tirabrutinib，表明其穿过血脑屏障的能力不如 ibrutinib 和 Tirabrutinib。
综上所述，这些数据表明，口服 ibrutinib、Tirabrutinib 和 zanubrutinib 后可以迅速被血液吸收并分布到大脑中。与泽布替尼相比，伊布替尼和替拉替尼在穿过血脑屏障和维持脑内高而稳定的浓度方面表现出更好的能力，这使得这些抑制剂能够在脑内发挥抗肿瘤作用，使其成为治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤更有希望的候选药物。

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在SD大鼠中，单次口服10 mg/kg替拉替尼后，药物被迅速吸收和分布。
血浆最大浓度（Cmax，血浆）为339.53 ng/mL。
脑内最大浓度（Cmax，脑）为28.9 ng/mL。
血浆和脑内达到Cmax的时间（Tmax）均为给药后2小时。
脑/血浆游离药物浓度比（计算方法为Tmax时脑内Cmax/血浆Cmax）为8.5%。
该比值表明……本研究中，tirabrutinib穿过血脑屏障的能力高于zanubrutinib（3.5%），但略低于ibrutinib（9.8%）。[1]

ONO-4059耐受性良好，未观察到剂量限制性毒性（DLT）。14例患者中有6例报告了18例与ONO-4059相关的不良事件；其中CTCAE-V4.0 G1级10例（1例患者共6例），G2级5例。2例患者报告了3例与ONO-4059相关的G3级血液学毒性：血小板减少症（2例）和贫血。未报告与ONO-4059相关的G4级不良事件、严重不良事件（SAE）或感染。ONO-4059的药代动力学特征为吸收和消除迅速，半衰期约为6小时，暴露量随剂量增加而增加，无ONO-4059蓄积，且患者间和患者内变异性较低。在所有剂量水平下，外周血中 Btk 的占有率（以磷酸化 Btk 衡量）至少维持 24 小时。

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在 SCID 小鼠异种移植研究中，在为期 2-3 周的时间内，所有接受 tirabrutinib 治疗的组均未观察到体重下降，膳食浓度最高达 0.037%（相当于约 60 mg/kg/天），表明在该模型中，这些有效剂量具有良好的耐受性。[2]

[1]. Bruton's tyrosine kinase inhibitors in primary central nervous system lymphoma-evaluation of anti-tumor efficacy and brain distribution. Transl Cancer Res. 2021 May;10(5):1975-1983.

[2]. Responses to the Selective Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) Inhibitor Tirabrutinib (ONO/GS-4059) in Diffuse Large B-cell Lymphoma Cell Lines. Cancers (Basel). 2018 Apr 23;10(4):127.

[3]. Biochemical characterization of tirabrutinib and other irreversible inhibitors of Bruton's tyrosine kinase reveals differences in on - and off - target inhibition. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2020 Apr;1864(4):129531.

[4]. Tirabrutinib: First Approval. Drugs. 2020 Jun;80(8):835-840.

替拉替尼（Tirabrutinib）正在临床试验NCT02626026（GS-4059在健康志愿者和类风湿性关节炎（RA）患者中的安全性和药代动力学研究）中进行研究。
替拉替尼是一种口服制剂，含有布鲁顿无丙种球蛋白血症酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，替拉替尼与B细胞内的BTK共价结合，从而阻断B细胞受体信号传导并抑制B细胞发育。因此，该药物可能抑制B细胞恶性肿瘤的增殖。 BTK 是一种胞质酪氨酸激酶，属于 Tec 激酶家族，在 B 淋巴细胞的发育、活化、信号传导、增殖和存活中发挥重要作用。

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替拉布替尼是第二代布鲁顿酪氨酸激酶 (BTK) 抑制剂。
原发性中枢神经系统淋巴瘤 (PCNSL) 是一种局限于中枢神经系统的侵袭性淋巴瘤，大多数病例属于弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL) 亚型，该亚型通常涉及 B 细胞受体通路和 NF-κB 信号通路的组成型激活。 BTK是该通路中的关键激酶。
本研究比较了tirabrutinib与另外两种BTK抑制剂（ibrutinib和zanubrutinib）在原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）治疗中的潜在应用。
虽然tirabrutinib的体外抗增殖活性弱于ibrutinib和zanubrutinib，但它表现出良好的药代动力学特性，可用于靶向脑肿瘤。具体而言，该药物在大鼠脑实质中实现了持续且可测量的浓度，其脑血浆比值支持其能够穿透血脑屏障。
该研究表明，尽管其体外效力较低，但tirabrutinib的分布特性使其成为治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）的潜在候选药物，因为在PCNSL中，达到有效的脑内药物浓度至关重要。
该研究还提到，tirabrutinib已在B细胞恶性肿瘤的临床试验中进行评估，并引用了一项针对复发/难治性PCNSL患者的I/II期试验，该试验报告的客观缓解率为64%。[1]

C25H22N6O3

454.490

454.175

C, 66.07; H, 4.88; N, 18.49; O, 10.56

1351636-18-4

Tirabrutinib hydrochloride;1439901-97-9;ONO-4059 analog;1351635-67-0

54755438

White to off white powder

1.4±0.1 g/cm3

672.0±65.0 °C at 760 mmHg

360.2±34.3 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.700

2.31

105Ų

1

6

4

34

825

1

O=C1N(C2C=CC(=CC=2)OC2C=CC=CC=2)C2=C(N)N=CN=C2N1C1CN(C(C#CC)=O)CC1

SEJLPXCPMNSRAM-GOSISDBHSA-N

InChI=1S/C25H22N6O3/c1-2-6-21(32)29-14-13-18(15-29)31-24-22(23(26)27-16-28-24)30(25(31)33)17-9-11-20(12-10-17)34-19-7-4-3-5-8-19/h3-5,7-12,16,18H,13-15H2,1H3,(H2,26,27,28)/t18-/m1/s1

6-amino-9-[(3R)-1-but-2-ynoylpyrrolidin-3-yl]-7-(4-phenoxyphenyl)purin-8-one

ONO-4059; GS4059; ONO-WG-307; ONO4059; GS-4059;ONO 4059; GS-4059; Btk Kinase inhibitor; ONO-4059(Free base); Tirabrutinib [INN]; Tirabrutinib free base; ONO-4059; GS 4059; ONO WG-307

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ≥ 100 mg/mL (~220.0 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。