TOFA (Olumacostat)   中文名称: 5-(十四烷基氧)-2-糠酸

ACCA/acetyl-CoA carboxylase-α; PPARalpha; apoptosis
Acetyl-CoA carboxylase-alpha (ACCA)[1]
Acetyl-CoA carboxylase (ACC) [2]
Acetyl-CoA carboxylase-α (ACCA) [3]

TOFA（5-十四烷氧基-2-糠酸）对 NCI-H460 肺癌细胞以及 HCT-8 和 HCT-15 结肠癌细胞具有细胞毒性，IC50 值约为 5.0、5.0 和 4.5 μg/mL。那个订单。 1.0–20.0 μg/mL 的 TOFA 以剂量依赖性方式有效抑制脂肪酸的合成并导致细胞死亡 [1]。 TOFA 的 IC50 值分别为 26.1 和 11.6 μg/mL，表明它对 COC1 和 COC1/DDP 细胞具有细胞毒性。 TOFA使细胞周期停止在G0/G1期，引发细胞凋亡，并以时间和剂量依赖性方式抑制癌细胞的生长[2]。乙酰辅酶A-羧化酶-α（ACCA）是控制脂肪酸产生的必需酶。在大多数 PCa 细胞系中，TOFA 诱导的 ACCA 抑制会导致脂肪酸产生减少、半胱天冬酶激活和细胞死亡 [3]。

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TOFA(5-四环氧基-2-呋喃酸)是ACCA的一种变构抑制剂，对肺癌细胞NCI-H460和结肠癌细胞HCT-8和HCT-15具有细胞毒性，其IC(50)分别约为5.0、5.0和4.5微克/毫升。1.0 ~ 20.0 μ g/ml的TOFA能有效阻断脂肪酸合成，诱导细胞死亡，并呈剂量依赖性。PARP断裂、DNA断裂、膜联蛋白- v染色均为细胞凋亡的特征。同时补充脂肪酸合成途径的终产物棕榈酸(100微米)，可防止TOFA诱导的细胞凋亡。综上所述，这些数据表明TOFA对肺癌和结肠癌细胞是一种有效的细胞毒剂，通过干扰它们的脂肪酸合成来诱导细胞凋亡。[1]

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本研究旨在探讨ACC变构抑制剂5 -十四环氧基- 2 -呋喃酸(TOFA)对卵巢癌细胞系COC1和COC1/DDP增殖和细胞周期进展的影响。结果表明，TOFA对COC1和COC1/DDP细胞有50%的抑制浓度(IC50)，分别为~26.1和11.6µg/ml。TOFA以时间和剂量依赖的方式抑制癌细胞的增殖，使细胞停留在G0/G1细胞周期，并诱导细胞凋亡。western blot检测细胞周期调节蛋白cyclin D1和cyclin依赖性激酶(CDK) 4的表达，以及凋亡相关蛋白caspase - 3和Bcl - 2的表达。TOFA抑制Cyclin D1、CDK4和Bcl‑2蛋白的表达，而caspase‑3被切割和激活。[2]

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在大多数PCa细胞系中，TOFA(5-十四环氧-2-呋喃酸)抑制ACCA可减少脂肪酸合成，诱导caspase激活和细胞死亡。我们的数据表明，TOFA可以通过线粒体途径杀死细胞，因为我们在雄激素敏感细胞系中发现TOFA处理后细胞色素c释放。结果还表明，TOFA的促凋亡作用可能通过降低神经匹林-1(NRP1)和mcl -1的表达介导。我们之前报道过Mcl-1受AR调控，在前列腺癌细胞耐药诱导凋亡中起重要作用，并且已知NRP1调控Mcl-1的表达。[3]

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1. TOFA对人肺癌NCI-H460细胞、结直肠癌HCT-8和HCT-15细胞具有细胞毒性，IC50值分别约为5.0 μg/ml、5.0 μg/ml和4.5 μg/ml；TOFA（1.0-20.0 μg/ml）可剂量依赖性阻断脂肪酸合成并诱导细胞死亡 [1]
2. TOFA诱导NCI-H460、HCT-8和HCT-15细胞发生凋亡，表现为PARP剪切、DNA片段化以及膜联蛋白V阳性细胞（早期+晚期凋亡细胞）增加；补充100 μM棕榈酸可逆转TOFA诱导的凋亡 [1]
3. 采用siRNA（50 nM）沉默ACCA可诱导癌细胞凋亡，与TOFA（10 μg/ml）联合处理可进一步增强凋亡效应 [1]
4. TOFA对卵巢癌细胞COC1和COC1/DDP具有细胞毒性，IC50值分别约为26.1 μg/ml和11.6 μg/ml；其可时间和剂量依赖性抑制细胞增殖，将细胞周期阻滞在G0/G1期，并诱导凋亡 [2]
5. TOFA可下调卵巢癌细胞COC1和COC1/DDP中cyclin D1、CDK4和Bcl-2蛋白的表达，并剪切/激活caspase-3 [2]
6. TOFA可降低前列腺癌细胞的脂肪酸合成，诱导大多数前列腺癌细胞系发生caspase活化和细胞死亡（与p53状态无关）；其可诱导雄激素敏感型前列腺癌细胞释放细胞色素c（通过线粒体途径介导凋亡）[3]
7. TOFA可降低前列腺癌细胞中神经纤毛蛋白-1（NRP1）和Mcl-1的表达；NRP1的表达受雄激素受体（AR）调控，而Mcl-1受AR调控且与药物耐药相关 [3]
8. 二氢睾酮（DHT）处理可增加LNCaP细胞中ACCA的表达和脂肪酸合成，而TOFA可逆转DHT诱导的脂肪酸合成升高 [3]

TOFA对小鼠卵巢癌异种移植物生长的抑制作用[2]
为了研究TOFA是否在体内抑制肿瘤生长，我们使用人卵巢癌小鼠异种移植模型研究了TOFA的作用。将COC1/DDP细胞注射到雌性裸鼠体内，测定TOFA处理后的肿瘤大小。与dmso处理的对照组小鼠相比，TOFA显著抑制肿瘤生长速度(1649±356.3比5128±390.4 mm3;图4)。为了检测TOFA的毒性，我们用H&E染色法检测了TOFA对小鼠多个器官的影响(图4B)。在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和肠组织中未观察到毒性(数据未显示)。[2]

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TOFA 抑制小鼠卵巢肿瘤异种移植物中 COC1/DDP 细胞的生长。与用 DMSO 处理的对照小鼠相比，TOFA 显着抑制肿瘤生长速率（1649±356.3 对比 5128±390.4 mm）3。肺、肾、脾、心和肠组织没有表现出任何毒性。 TOFA可能会发展成为一种有前途的小分子药物，通过阻断ACC来治疗卵巢癌[2]。

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1. TOFA可抑制小鼠体内COC1/DDP卵巢癌细胞异种移植瘤的生长[2]

细胞凋亡[1]< br > 细胞凋亡通过PARP切割、DNA断裂、膜联蛋白- v染色和FACScan分析进行评估。如上所述，采用Western blot检测PARP裂解;如前所述，检查DNA片段;如前所述进行annexin-V染色和FACScan。

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脂肪酸合成[1]
细胞在12孔板上每孔用1 μCi 2- 14c标记的乙酸(53 mCi/mmol)在37℃，5% CO2下脉冲4小时，然后进行脂质合成分析，如前所述。

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1. 脂肪酸合成实验：将癌细胞（NCI-H460、HCT-8、HCT-15）暴露于不同浓度的TOFA中24小时；收获细胞前4小时，每孔12孔板的细胞加入1 μCi 2-¹⁴C标记的乙酸，随后分析脂肪酸合成情况，以评估TOFA对脂肪酸合成的抑制作用（间接反映ACCA活性）[1]

细胞增殖试验[2]
将TOFA溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，制成50 mg/ml的原液。细胞(1×104 cells/孔)接种于96孔板，用不同浓度(0、1、5、10、20、50 μg/ml)的TOFA孵育。使用从Dojindo购买的细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)，根据制造商的说明，通过测量四氮唑盐WST-8对甲醛的还原，评估TOFA处理后24、48和72 h的细胞增殖。在每个时间点，每孔中加入10 μl CCK-8溶液，37℃培养2 h，收集每板上清，在450 nm处测定吸光度。细胞增殖抑制率和50%抑制浓度(IC50;抑制率(%)= [(Ac−Ae)/(Ac−Ab)] × 100%，其中Ae为实验孔中培养基的吸光度;Ac为对照孔中培养基的吸光度，Ab为空白孔中培养基的吸光度。

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细胞周期分析[2]
将COC1和COC1/DDP细胞以2×105细胞/孔的密度接种于6孔板中，分别加或不加TOFA(5或10 μg/ml)处理24、48和72 h。细胞周期分析，466 × g离心5 min，并用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次。细胞用70%的冰镇乙醇固定，保存于- 20℃。24 h后用PBS洗涤细胞，用RNase A处理，并根据制造商的方案在37°C下孵育30分钟。加入碘化丙啶(PI) 400 μl (20 μg/ml溶液)，黑暗孵育30 min，在488nm处测定吸光度。

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细胞凋亡分析[2]
分别用TOFA(0、1、5、10、20、50 μg/ml)处理卵巢癌细胞COC1和COC1/DDP (2×105 cells/well) 24、48、72 h，按说明书使用凋亡检测试剂盒。收集细胞，466 × g离心5 min，冷PBS洗涤2次，悬浮于100 μl结合缓冲液中。在细胞培养液中加入Annexin V-FITC (5 μl)和PI (5 μl)，室温暗室培养15 min。加入400 μl的结合缓冲液，流式细胞术检测488nm 的荧光强度。

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TOFA抑制卵巢癌细胞增殖[2]
为研究TOFA对卵巢癌细胞的影响，采用不同浓度TOFA (1 ~ 50 μg/ml)处理COC1和COC1/DDP细胞株24 ~ 72 h，观察细胞增殖情况。发现不同浓度的TOFA以浓度和时间依赖的方式抑制COC1和COC1/DDP细胞的生长(图1)。TOFA还被证明对卵巢癌细胞具有高度的细胞毒性。处理48 h后，COC1和COC1/DDP细胞对TOFA的IC50值分别为~26.1和~11.2 μg/ml。这些数据表明脂肪酸合成在卵巢癌细胞系COC1和COC1/DDP的增殖中起重要作用。

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TOFA诱导细胞周期阻滞[2]
为了研究TOFA是否诱导卵巢癌细胞周期阻滞，我们将COC1和COC1/DDP细胞与TOFA一起培养24、48和72 h，然后用FACScan分析细胞计数。TOFA处理的COC1细胞停留在G0/G1期。特别是，5 μg/ml TOFA处理48和72 h, COC1细胞处于该期的比例分别为50.2%和51.1%，而未处理的对照组分别为28.1%和34.4% (P<0.01)(图2B和C)。10 μg/ml TOFA处理72 h, COC1/DDP细胞处于G0/G1期的比例从38.3%(对照组)增加到43.0% (P<0.05);图2 g)。这些结果表明，细胞周期从G1期到S期的进展与脂肪酸合成有关。为了研究细胞周期阻滞的机制，使用western blot分析检测了周期蛋白D1和周期蛋白依赖性激酶(CDK) 4的蛋白水平，这两种蛋白调节从G1期到S期的进展(图2D和H)。COC1和COC1/DDP细胞的TOFA处理以剂量依赖的方式降低了周期蛋白D1蛋白水平。然而，在TOFA处理的COC1细胞(1-20 μg/ml)中，CDK4蛋白水平升高，随后当使用50 μg/ml TOFA时，CDK4蛋白水平下降(图2D)。

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将 NCI-H460、人肺癌细胞以及 HCT-8 和 HCT-15 细胞（5,000 个/孔）接种在 96 孔板中过夜，然后暴露于指定浓度（0、1、5、10、20、 50 µg/mL）72 小时。使用MTT测定法检测活细胞。

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1. MTT细胞毒性/增殖实验（NCI-H460、HCT-8、HCT-15细胞）：将细胞以5000个/孔接种于96孔板，过夜培养；加入含不同浓度TOFA的新鲜培养基，继续培养72小时；采用MTT细胞增殖试剂盒检测活细胞数量 [1]
2. ACCA表达Western blot实验：提取NCI-H460、HCT-8和HCT-15细胞的可溶性蛋白（每样本100 μg），通过Western blot检测ACCA蛋白水平，以β-肌动蛋白为内参 [1]
3. PARP剪切检测（凋亡）：将NCI-H460、HCT-8、HCT-15细胞（2×10⁶个）过夜培养，随后用不同浓度TOFA处理24小时；提取可溶性蛋白（每样本100 μg），通过Western blot检测PARP剪切，以β-肌动蛋白为内参 [1]
4. DNA片段化实验：收集TOFA处理细胞的培养基、PBS洗涤液及收获的细胞；制备DNA梯带并可视化，以检测凋亡 [1]
5. 膜联蛋白V染色及流式细胞术分析：收集TOFA处理细胞的PBS洗涤液和胰酶消化的细胞悬液；进行膜联蛋白V染色，通过流式细胞术定量总凋亡细胞（早期+晚期凋亡细胞）[1]
6. siRNA转染及凋亡实验：将化学合成的ACCA siRNA（50 nM）转染至癌细胞（1×10⁵个）；细胞经TOFA（10 μg/ml）处理/未处理后，通过膜联蛋白染色和流式细胞术评估凋亡细胞（以乱序siRNA为对照）[1]
7. 棕榈酸挽救实验：将NCI-H460、HCT-8、HCT-15细胞（2×10⁶个）过夜培养，随后同时加入TOFA（10 μg/ml）和100 μM棕榈酸处理24小时；通过膜联蛋白V染色和流式细胞术检测凋亡 [1]
8. 卵巢癌细胞MTT实验（COC1、COC1/DDP）：将细胞用不同浓度TOFA处理特定时间；通过MTT实验检测细胞增殖/活力，以确定IC50及时间/剂量依赖性抑制效应 [2]
9. 细胞周期分析：将COC1和COC1/DDP细胞用TOFA处理后，分析细胞周期分布（G0/G1期阻滞）[2]
10. 卵巢癌细胞Western blot实验：将COC1和COC1/DDP细胞用TOFA处理；通过Western blot检测cyclin D1、CDK4、Bcl-2和剪切型caspase-3的蛋白表达 [2]
11. 前列腺癌细胞脂肪酸合成实验：将LNCaP细胞用DHT和/或TOFA处理；检测脂肪酸合成水平以评估TOFA的作用[3]
12. 前列腺癌细胞caspase活化实验：将前列腺癌细胞用TOFA处理；检测caspase活化以评估凋亡效应[3]
13. 细胞色素c释放实验：将雄激素敏感型前列腺癌细胞用TOFA处理；检测线粒体细胞色素c释放以评估线粒体凋亡途径（具体方法未详述）[3]
14. 前列腺癌细胞Western blot实验：将LNCaP细胞用DHT和/或TOFA处理；通过Western blot检测ACCA、AR、NRP1和Mcl-1的蛋白表达水平[3]

50 mg/kg; i.p.
Mice COC1/DDP tumor xenografts in mice[2]
Female athymic BALB/c nude mice, 4–5 weeks old, weighing 17–20 g were used. COC1/DDP cells were collected by centrifugation at 300 × g for 5 min and suspended in RPMI-1640 medium at a density of 2×106 cells/100 μl. The cells were subcutaneously injected into both right and left flanks of each mouse. Twenty days later, mice were randomly allocated into one of the 2 groups (n=5 mice/group): i) mice treated with 50 μl DMSO (control group) or ii) mice treated with TOFA (50 mg/kg). The drugs were injected intraperitoneally daily for two weeks. Tumor volumes were recorded every two days by measuring dimensions (length and width) with Vernier calipers. The mice were sacrificed four weeks after the final treatment. Tumor weights were measured by a scale. The formula used to determine tumor sizes was A × B2 × 0.5236 (A, length; B, width; all measured in mm). For histopathological examination, tumors and multiple organs were fixed in 10% neutral-buffered formalin and wax embedded. The tissues were cut into 4-mm sections and stained with hematoxylin and eosin (H&E).

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1. Ovarian cancer xenograft model: COC1/DDP ovarian cancer cells were implanted into mice to establish xenograft tumors; TOFA was administered (specific dose, route, frequency and formulation not described), and tumor growth was monitored to evaluate the inhibitory effect of TOFA [2]

[1]. Acetyl-CoA carboxylase-alpha inhibitor TOFA induces human cancer cell apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Jul 31;385(3):302-6.

[2]. TOFA suppresses ovarian cancer cell growth in vitro and in vivo. Mol Med Rep. 2013 Aug;8(2):373-8.

[3]. TOFA (5-tetradecyl-oxy-2-furoic acid) reduces fatty acid synthesis, inhibits expression of AR, neuropilin-1 and Mcl-1 and kills prostate cancer cells independent of p53 status. Cancer Biol Ther. 2011 Jul 1;12(1):80-5.

5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid is a member of the class of furans that is 2-furoic acid in which the hydrogen at position 5 is replaced by a tetradecyloxy group. It has a role as an EC 6.4.1.2 (acetyl-CoA carboxylase) inhibitor, a PPARalpha agonist, an antineoplastic agent and an apoptosis inducer. It is a furoic acid and an aromatic ether. It is functionally related to a 2-furoic acid.

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1. TOFA (5-tetradecyloxy-2-furoic acid) is an allosteric inhibitor of ACCA; ACCA is a rate-limiting enzyme in long chain fatty acid synthesis, upregulated in multiple human cancers [1]
2. TOFA induces cancer cell apoptosis by disturbing fatty acid synthesis; palmitic acid (end-product of fatty acid synthesis) rescues TOFA-induced apoptosis [1]
3. TOFA is an allosteric inhibitor of ACC; ACC is a key enzyme in fatty acid synthesis, highly expressed in several human cancers and important for cancer cell growth [2]
4. TOFA is a promising small molecule agent for ovarian cancer therapy via inhibiting ACC [2]
5. AR binds in vivo to intron regions of human ACCA gene; ACCA protein level in LNCaP cells depends on AR expression [3]
6. Tumor-associated lipogenesis protects cancer cells from carcinogenic and therapeutic treatments; increased fatty acid/cholesterol synthesis is regulated by androgens in androgen-responsive cancer cells [3]
7. TOFA is a potent cell death-inducing agent in prostate cancer cells, and its pro-apoptotic effect may be mediated via decreasing NRP1 and Mcl-1 expression [3]

C19H32O4

324.45

324.23

C, 70.33; H, 9.94; O, 19.72

54857-86-2

115175

White to off-white solid powder

1.0±0.1 g/cm3

441.7±25.0 °C at 760 mmHg

112-115ºC

220.9±23.2 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.483

7.82

59.67

1

4

15

23

293

0

CZRCFAOMWRAFIC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H32O4/c1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-16-22-18-15-14-17(23-18)19(20)21/h14-15H,2-13,16H2,1H3,(H,20,21)

5-tetradecoxyfuran-2-carboxylic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~4 mg/mL ( 12.32 mM）
Water: Insoluble
Ethanol: Insoluble

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.08 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: 5%DMSO+ 40%PEG300+ 5%Tween 80+ 50%ddH2O : 3mg/ml (9.25mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。