TOFA (Olumacostat)   中文名称: 5-(十四烷基氧)-2-糠酸

ACCA/acetyl-CoA carboxylase-α; PPARalpha; apoptosis
Acetyl-CoA carboxylase-alpha (ACCA)[1]
Acetyl-CoA carboxylase (ACC) [2]
Acetyl-CoA carboxylase-α (ACCA) [3]

TOFA（5-十四烷氧基-2-糠酸）对 NCI-H460 肺癌细胞以及 HCT-8 和 HCT-15 结肠癌细胞具有细胞毒性，IC50 值约为 5.0、5.0 和 4.5 μg/mL。那个订单。 1.0–20.0 μg/mL 的 TOFA 以剂量依赖性方式有效抑制脂肪酸的合成并导致细胞死亡 [1]。 TOFA 的 IC50 值分别为 26.1 和 11.6 μg/mL，表明它对 COC1 和 COC1/DDP 细胞具有细胞毒性。 TOFA使细胞周期停止在G0/G1期，引发细胞凋亡，并以时间和剂量依赖性方式抑制癌细胞的生长[2]。乙酰辅酶A-羧化酶-α（ACCA）是控制脂肪酸产生的必需酶。在大多数 PCa 细胞系中，TOFA 诱导的 ACCA 抑制会导致脂肪酸产生减少、半胱天冬酶激活和细胞死亡 [3]。

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TOFA(5-四环氧基-2-呋喃酸)是ACCA的一种变构抑制剂，对肺癌细胞NCI-H460和结肠癌细胞HCT-8和HCT-15具有细胞毒性，其IC(50)分别约为5.0、5.0和4.5微克/毫升。1.0 ~ 20.0 μ g/ml的TOFA能有效阻断脂肪酸合成，诱导细胞死亡，并呈剂量依赖性。PARP断裂、DNA断裂、膜联蛋白- v染色均为细胞凋亡的特征。同时补充脂肪酸合成途径的终产物棕榈酸(100微米)，可防止TOFA诱导的细胞凋亡。综上所述，这些数据表明TOFA对肺癌和结肠癌细胞是一种有效的细胞毒剂，通过干扰它们的脂肪酸合成来诱导细胞凋亡。[1]

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本研究旨在探讨ACC变构抑制剂5 -十四环氧基- 2 -呋喃酸(TOFA)对卵巢癌细胞系COC1和COC1/DDP增殖和细胞周期进展的影响。结果表明，TOFA对COC1和COC1/DDP细胞有50%的抑制浓度(IC50)，分别为~26.1和11.6µg/ml。TOFA以时间和剂量依赖的方式抑制癌细胞的增殖，使细胞停留在G0/G1细胞周期，并诱导细胞凋亡。western blot检测细胞周期调节蛋白cyclin D1和cyclin依赖性激酶(CDK) 4的表达，以及凋亡相关蛋白caspase - 3和Bcl - 2的表达。TOFA抑制Cyclin D1、CDK4和Bcl‑2蛋白的表达，而caspase‑3被切割和激活。[2]

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在大多数PCa细胞系中，TOFA(5-十四环氧-2-呋喃酸)抑制ACCA可减少脂肪酸合成，诱导caspase激活和细胞死亡。我们的数据表明，TOFA可以通过线粒体途径杀死细胞，因为我们在雄激素敏感细胞系中发现TOFA处理后细胞色素c释放。结果还表明，TOFA的促凋亡作用可能通过降低神经匹林-1(NRP1)和mcl -1的表达介导。我们之前报道过Mcl-1受AR调控，在前列腺癌细胞耐药诱导凋亡中起重要作用，并且已知NRP1调控Mcl-1的表达。[3]

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1. TOFA对人肺癌NCI-H460细胞、结直肠癌HCT-8和HCT-15细胞具有细胞毒性，IC50值分别约为5.0 μg/ml、5.0 μg/ml和4.5 μg/ml；TOFA（1.0-20.0 μg/ml）可剂量依赖性阻断脂肪酸合成并诱导细胞死亡 [1]
2. TOFA诱导NCI-H460、HCT-8和HCT-15细胞发生凋亡，表现为PARP剪切、DNA片段化以及膜联蛋白V阳性细胞（早期+晚期凋亡细胞）增加；补充100 μM棕榈酸可逆转TOFA诱导的凋亡 [1]
3. 采用siRNA（50 nM）沉默ACCA可诱导癌细胞凋亡，与TOFA（10 μg/ml）联合处理可进一步增强凋亡效应 [1]
4. TOFA对卵巢癌细胞COC1和COC1/DDP具有细胞毒性，IC50值分别约为26.1 μg/ml和11.6 μg/ml；其可时间和剂量依赖性抑制细胞增殖，将细胞周期阻滞在G0/G1期，并诱导凋亡 [2]
5. TOFA可下调卵巢癌细胞COC1和COC1/DDP中cyclin D1、CDK4和Bcl-2蛋白的表达，并剪切/激活caspase-3 [2]
6. TOFA可降低前列腺癌细胞的脂肪酸合成，诱导大多数前列腺癌细胞系发生caspase活化和细胞死亡（与p53状态无关）；其可诱导雄激素敏感型前列腺癌细胞释放细胞色素c（通过线粒体途径介导凋亡）[3]
7. TOFA可降低前列腺癌细胞中神经纤毛蛋白-1（NRP1）和Mcl-1的表达；NRP1的表达受雄激素受体（AR）调控，而Mcl-1受AR调控且与药物耐药相关 [3]
8. 二氢睾酮（DHT）处理可增加LNCaP细胞中ACCA的表达和脂肪酸合成，而TOFA可逆转DHT诱导的脂肪酸合成升高 [3]

TOFA对小鼠卵巢癌异种移植物生长的抑制作用[2]
为了研究TOFA是否在体内抑制肿瘤生长，我们使用人卵巢癌小鼠异种移植模型研究了TOFA的作用。将COC1/DDP细胞注射到雌性裸鼠体内，测定TOFA处理后的肿瘤大小。与dmso处理的对照组小鼠相比，TOFA显著抑制肿瘤生长速度(1649±356.3比5128±390.4 mm3;图4)。为了检测TOFA的毒性，我们用H&E染色法检测了TOFA对小鼠多个器官的影响(图4B)。在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和肠组织中未观察到毒性(数据未显示)。[2]

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TOFA 抑制小鼠卵巢肿瘤异种移植物中 COC1/DDP 细胞的生长。与用 DMSO 处理的对照小鼠相比，TOFA 显着抑制肿瘤生长速率（1649±356.3 对比 5128±390.4 mm）3。肺、肾、脾、心和肠组织没有表现出任何毒性。 TOFA可能会发展成为一种有前途的小分子药物，通过阻断ACC来治疗卵巢癌[2]。

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1. TOFA可抑制小鼠体内COC1/DDP卵巢癌细胞异种移植瘤的生长[2]

细胞凋亡[1]< br > 细胞凋亡通过PARP切割、DNA断裂、膜联蛋白- v染色和FACScan分析进行评估。如上所述，采用Western blot检测PARP裂解;如前所述，检查DNA片段;如前所述进行annexin-V染色和FACScan。

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脂肪酸合成[1]
细胞在12孔板上每孔用1 μCi 2- 14c标记的乙酸(53 mCi/mmol)在37℃，5% CO2下脉冲4小时，然后进行脂质合成分析，如前所述。

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1. 脂肪酸合成实验：将癌细胞（NCI-H460、HCT-8、HCT-15）暴露于不同浓度的TOFA中24小时；收获细胞前4小时，每孔12孔板的细胞加入1 μCi 2-¹⁴C标记的乙酸，随后分析脂肪酸合成情况，以评估TOFA对脂肪酸合成的抑制作用（间接反映ACCA活性）[1]

细胞增殖试验[2]
将TOFA溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，制成50 mg/ml的原液。细胞(1×104 cells/孔)接种于96孔板，用不同浓度(0、1、5、10、20、50 μg/ml)的TOFA孵育。使用从Dojindo购买的细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)，根据制造商的说明，通过测量四氮唑盐WST-8对甲醛的还原，评估TOFA处理后24、48和72 h的细胞增殖。在每个时间点，每孔中加入10 μl CCK-8溶液，37℃培养2 h，收集每板上清，在450 nm处测定吸光度。细胞增殖抑制率和50%抑制浓度(IC50;抑制率(%)= [(Ac−Ae)/(Ac−Ab)] × 100%，其中Ae为实验孔中培养基的吸光度;Ac为对照孔中培养基的吸光度，Ab为空白孔中培养基的吸光度。

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细胞周期分析[2]
将COC1和COC1/DDP细胞以2×105细胞/孔的密度接种于6孔板中，分别加或不加TOFA(5或10 μg/ml)处理24、48和72 h。细胞周期分析，466 × g离心5 min，并用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次。细胞用70%的冰镇乙醇固定，保存于- 20℃。24 h后用PBS洗涤细胞，用RNase A处理，并根据制造商的方案在37°C下孵育30分钟。加入碘化丙啶(PI) 400 μl (20 μg/ml溶液)，黑暗孵育30 min，在488nm处测定吸光度。

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细胞凋亡分析[2]
分别用TOFA(0、1、5、10、20、50 μg/ml)处理卵巢癌细胞COC1和COC1/DDP (2×105 cells/well) 24、48、72 h，按说明书使用凋亡检测试剂盒。收集细胞，466 × g离心5 min，冷PBS洗涤2次，悬浮于100 μl结合缓冲液中。在细胞培养液中加入Annexin V-FITC (5 μl)和PI (5 μl)，室温暗室培养15 min。加入400 μl的结合缓冲液，流式细胞术检测488nm 的荧光强度。

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TOFA抑制卵巢癌细胞增殖[2]
为研究TOFA对卵巢癌细胞的影响，采用不同浓度TOFA (1 ~ 50 μg/ml)处理COC1和COC1/DDP细胞株24 ~ 72 h，观察细胞增殖情况。发现不同浓度的TOFA以浓度和时间依赖的方式抑制COC1和COC1/DDP细胞的生长(图1)。TOFA还被证明对卵巢癌细胞具有高度的细胞毒性。处理48 h后，COC1和COC1/DDP细胞对TOFA的IC50值分别为~26.1和~11.2 μg/ml。这些数据表明脂肪酸合成在卵巢癌细胞系COC1和COC1/DDP的增殖中起重要作用。

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TOFA诱导细胞周期阻滞[2]
为了研究TOFA是否诱导卵巢癌细胞周期阻滞，我们将COC1和COC1/DDP细胞与TOFA一起培养24、48和72 h，然后用FACScan分析细胞计数。TOFA处理的COC1细胞停留在G0/G1期。特别是，5 μg/ml TOFA处理48和72 h, COC1细胞处于该期的比例分别为50.2%和51.1%，而未处理的对照组分别为28.1%和34.4% (P<0.01)(图2B和C)。10 μg/ml TOFA处理72 h, COC1/DDP细胞处于G0/G1期的比例从38.3%(对照组)增加到43.0% (P<0.05);图2 g)。这些结果表明，细胞周期从G1期到S期的进展与脂肪酸合成有关。为了研究细胞周期阻滞的机制，使用western blot分析检测了周期蛋白D1和周期蛋白依赖性激酶(CDK) 4的蛋白水平，这两种蛋白调节从G1期到S期的进展(图2D和H)。COC1和COC1/DDP细胞的TOFA处理以剂量依赖的方式降低了周期蛋白D1蛋白水平。然而，在TOFA处理的COC1细胞(1-20 μg/ml)中，CDK4蛋白水平升高，随后当使用50 μg/ml TOFA时，CDK4蛋白水平下降(图2D)。

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将 NCI-H460、人肺癌细胞以及 HCT-8 和 HCT-15 细胞（5,000 个/孔）接种在 96 孔板中过夜，然后暴露于指定浓度（0、1、5、10、20、 50 µg/mL）72 小时。使用MTT测定法检测活细胞。

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1. MTT细胞毒性/增殖实验（NCI-H460、HCT-8、HCT-15细胞）：将细胞以5000个/孔接种于96孔板，过夜培养；加入含不同浓度TOFA的新鲜培养基，继续培养72小时；采用MTT细胞增殖试剂盒检测活细胞数量 [1]
2. ACCA表达Western blot实验：提取NCI-H460、HCT-8和HCT-15细胞的可溶性蛋白（每样本100 μg），通过Western blot检测ACCA蛋白水平，以β-肌动蛋白为内参 [1]
3. PARP剪切检测（凋亡）：将NCI-H460、HCT-8、HCT-15细胞（2×10⁶个）过夜培养，随后用不同浓度TOFA处理24小时；提取可溶性蛋白（每样本100 μg），通过Western blot检测PARP剪切，以β-肌动蛋白为内参 [1]
4. DNA片段化实验：收集TOFA处理细胞的培养基、PBS洗涤液及收获的细胞；制备DNA梯带并可视化，以检测凋亡 [1]
5. 膜联蛋白V染色及流式细胞术分析：收集TOFA处理细胞的PBS洗涤液和胰酶消化的细胞悬液；进行膜联蛋白V染色，通过流式细胞术定量总凋亡细胞（早期+晚期凋亡细胞）[1]
6. siRNA转染及凋亡实验：将化学合成的ACCA siRNA（50 nM）转染至癌细胞（1×10⁵个）；细胞经TOFA（10 μg/ml）处理/未处理后，通过膜联蛋白染色和流式细胞术评估凋亡细胞（以乱序siRNA为对照）[1]
7. 棕榈酸挽救实验：将NCI-H460、HCT-8、HCT-15细胞（2×10⁶个）过夜培养，随后同时加入TOFA（10 μg/ml）和100 μM棕榈酸处理24小时；通过膜联蛋白V染色和流式细胞术检测凋亡 [1]
8. 卵巢癌细胞MTT实验（COC1、COC1/DDP）：将细胞用不同浓度TOFA处理特定时间；通过MTT实验检测细胞增殖/活力，以确定IC50及时间/剂量依赖性抑制效应 [2]
9. 细胞周期分析：将COC1和COC1/DDP细胞用TOFA处理后，分析细胞周期分布（G0/G1期阻滞）[2]
10. 卵巢癌细胞Western blot实验：将COC1和COC1/DDP细胞用TOFA处理；通过Western blot检测cyclin D1、CDK4、Bcl-2和剪切型caspase-3的蛋白表达 [2]
11. 前列腺癌细胞脂肪酸合成实验：将LNCaP细胞用DHT和/或TOFA处理；检测脂肪酸合成水平以评估TOFA的作用[3]
12. 前列腺癌细胞caspase活化实验：将前列腺癌细胞用TOFA处理；检测caspase活化以评估凋亡效应[3]
13. 细胞色素c释放实验：将雄激素敏感型前列腺癌细胞用TOFA处理；检测线粒体细胞色素c释放以评估线粒体凋亡途径（具体方法未详述）[3]
14. 前列腺癌细胞Western blot实验：将LNCaP细胞用DHT和/或TOFA处理；通过Western blot检测ACCA、AR、NRP1和Mcl-1的蛋白表达水平[3]

50 mg/kg；腹腔注射
小鼠COC1/DDP肿瘤异种移植模型[2]
使用4-5周龄、体重17-20 g的雌性无胸腺BALB/c裸鼠。将COC1/DDP细胞以300 × g离心5分钟收集，并以2×10⁶个细胞/100 μl的密度悬浮于RPMI-1640培养基中。将细胞皮下注射到每只小鼠的左右两侧。20天后，将小鼠随机分为两组（每组n=5只）：i）DMSO组（对照组，注射50 μl DMSO）或ii）TOFA组（50 mg/kg TOFA）。药物每日腹腔注射，持续两周。每两天用游标卡尺测量肿瘤的尺寸（长和宽）并记录肿瘤体积。小鼠在最后一次治疗后四周处死。用秤测量肿瘤重量。肿瘤大小的计算公式为 A × B² × 0.5236（A 为长度，B 为宽度，单位均为毫米）。组织病理学检查方面，将肿瘤和多个器官固定于 10% 中性缓冲福尔马林溶液中，并进行石蜡包埋。将组织切成 4 毫米厚的切片，并用苏木精-伊红 (H&E) 染色。

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1. 卵巢癌异种移植模型：将 COC1/DDP 卵巢癌细胞植入小鼠体内建立异种移植瘤；给予 TOFA（具体剂量、途径、频率和制剂未描述），并监测肿瘤生长以评估 TOFA 的抑制作用 [2]

[1]. Acetyl-CoA carboxylase-alpha inhibitor TOFA induces human cancer cell apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Jul 31;385(3):302-6.

[2]. TOFA suppresses ovarian cancer cell growth in vitro and in vivo. Mol Med Rep. 2013 Aug;8(2):373-8.

[3]. TOFA (5-tetradecyl-oxy-2-furoic acid) reduces fatty acid synthesis, inhibits expression of AR, neuropilin-1 and Mcl-1 and kills prostate cancer cells independent of p53 status. Cancer Biol Ther. 2011 Jul 1;12(1):80-5.

5-(十四烷氧基)-2-呋喃甲酸是呋喃类化合物，其结构与2-呋喃甲酸类似，只是5位上的氢被十四烷氧基取代。它具有多种功能，包括作为EC 6.4.1.2（乙酰辅酶A羧化酶）抑制剂、PPARα激动剂、抗肿瘤剂和细胞凋亡诱导剂。它是一种呋喃甲酸，也是一种芳香醚。其功能与2-呋喃甲酸相关。

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1. TOFA（5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸）是ACCA的变构抑制剂；ACCA是长链脂肪酸合成的限速酶，在多种人类癌症中表达上调[1]
2. TOFA通过干扰脂肪酸合成诱导癌细胞凋亡；棕榈酸（脂肪酸合成的终产物）可挽救 TOFA 诱导的细胞凋亡[1]
3. TOFA 是 ACC 的变构抑制剂；ACC 是脂肪酸合成的关键酶，在多种人类癌症中高表达，对癌细胞生长至关重要[2]
4. TOFA 是一种有前景的小分子药物，可通过抑制 ACC 治疗卵巢癌[2]
5. AR 在体内与人 ACCA 基因的内含子区域结合；LNCaP 细胞中 ACCA 蛋白水平取决于 AR 的表达[3]
6. 肿瘤相关脂肪生成可保护癌细胞免受致癌物和治疗剂的损伤；在雄激素反应性癌细胞中，脂肪酸/胆固醇合成增加受雄激素调节[3]
7.TOFA是前列腺癌细胞中一种有效的细胞死亡诱导剂，其促凋亡作用可能通过降低NRP1和Mcl-1的表达来实现[3]

C19H32O4

324.45

324.23

C, 70.33; H, 9.94; O, 19.72

54857-86-2

115175

White to off-white solid powder

1.0±0.1 g/cm3

441.7±25.0 °C at 760 mmHg

112-115ºC

220.9±23.2 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.483

7.82

59.67

1

4

15

23

293

0

CZRCFAOMWRAFIC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H32O4/c1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-16-22-18-15-14-17(23-18)19(20)21/h14-15H,2-13,16H2,1H3,(H,20,21)

5-tetradecoxyfuran-2-carboxylic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~4 mg/mL ( 12.32 mM）
Water: Insoluble
Ethanol: Insoluble

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.08 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: 5%DMSO+ 40%PEG300+ 5%Tween 80+ 50%ddH2O : 3mg/ml (9.25mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。