Denifanstat (TVB-2640)

Fatty Acid Synthase (FASN)(IC50 = 0.052 μM)
- Fatty Acid Synthase (FASN)：Denifanstat (TVB-2640) is an orally active, selective FASN inhibitor that competitively binds to the active site of FASN, inhibiting its catalytic function. In vitro enzyme activity assays show that it has an IC₅₀ value of 2.3 nM for human FASN.
Denifanstat targets fatty acid synthase (FASN). It is a potent and selective inhibitor that binds to and blocks the enzymatic activity of FASN. This prevents the synthesis of palmitate, which is a critical component for the production of lipids required for membrane formation and cell signaling. The compound's selectivity and oral bioavailability make it a promising therapeutic candidate for cancers and metabolic diseases.

FASN酶活性抑制：在重组人FASN酶活性测定中，Denifanstat以剂量依赖的方式抑制FASN的β-酮酰还原酶活性，IC₅₀为2.3 nM，显著优于对照化合物（IC₅₀ > 100 nM）。[2]
- 棕榈酰化抑制：在表达SARS-CoV-2刺突蛋白的HEK293细胞中，Denifanstat（10 nM）可降低刺突蛋白的棕榈酰化修饰。酰基-生物素交换（ABE）法检测显示，修饰水平降低了约60%。 [1]
- 抑制细胞内脂质合成：在HepG2肝细胞中，用Denifanstat (50 nM) 处理24小时后，细胞内甘油三酯含量下降45%，与从头脂肪酸合成相关的基因（例如SREBP-1c）的表达也受到抑制。[2]

---

Denifanstat（化合物152）是FASN的强效抑制剂[2]。脂肪酸合成酶（FASN）抑制SARS-CoV-2刺突蛋白的棕榈酰化[1]。
脂肪酸合成酶（FASN）是治疗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的一个有吸引力的靶点，因为它驱动从头脂肪生成并介导促炎和促纤维化信号传导。因此，我们在人细胞培养和三种饮食诱导的NASH小鼠模型中测试了FASN的药理学抑制作用。使用了三种相关的FASN抑制剂； TVB-3664、TVB-3166 和临床阶段的 TVB-2640（denifanstat）。在人原代肝微组织中，FASN 抑制剂（FASNi）降低了甘油三酯（TG）含量，这与直接抗脂肪变性活性相符。在人肝星状细胞中，FASNi 降低了纤维化标志物，包括胶原蛋白 1α (COL1α1) 和 α-平滑肌肌动蛋白 (αSMA)。在暴露于 NASH 相关细胞因子的 CD4+ T 细胞中，FASNi 降低了 Th17 细胞的生成，并减少了 LPS 刺激的 PBMC 中 IL-1β 的释放[2]。体外研究表明，denifanstat 是一种强效的 FASN 抑制剂，IC50 为 0.052 µM，EC50 为 0.072 µM。它能有效抑制癌细胞中的脂肪生成。这种抑制作用可降低细胞增殖，并诱导易感肿瘤细胞系发生凋亡。该化合物对脂肪酸合成酶（FASN）具有选择性，从而最大限度地减少了脱靶效应。

病毒感染模型中的疗效：在小鼠肝炎病毒 (MHV) 感染的 BALB/c 小鼠模型中，口服 Denifanstat（10 mg/kg，每日一次）7 天，可将存活率从安慰剂组的 30% 提高至 65%，并显著降低肺组织中的病毒载量 (p < 0.01)。[1]
- 非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 模型中的改善作用：在饮食诱导的 NASH 小鼠模型中，连续 12 周口服 Denifanstat（50 mg/kg）可使肝脏脂肪含量降低 58%，纤维化评分改善 40%，同时 ALT 水平降低 35%。[2]

---

在饮食诱导的 NASH 小鼠中，FASNi 可预防肝脂肪变性和纤维化的发展，并降低循环 IL-1β 水平。在已建立饮食诱导型非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的小鼠模型中，FASNi 可降低非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）活动评分、纤维化评分、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和甘油三酯（TG）水平。在四氯化碳（CCl4）诱导的脂肪型NASH小鼠模型中，FASN 抑制剂可使肝纤维化及其标志物减少85%，并抑制肝细胞癌（HCC）肿瘤的发生。这些结果表明，FASN 抑制剂除了减少肝细胞中的脂肪积累外，还通过直接抑制免疫细胞和星状细胞来减弱 NASH 的炎症和纤维化驱动因素。因此，FASN 抑制剂为靶向 NASH 的三个关键特征提供了契机[3]。
在体内，denifanstat 已在临床前模型中显示出疗效。它已显示出治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和 KRAS 突变实体瘤的潜力。在癌症动物模型中，口服该化合物可抑制肿瘤生长。这些效果归因于其阻断 FASN 介导的脂肪生成的能力。

生化和细胞效力测定[3]
FASN酶活性采用Chung等人³⁷描述的基于荧光的硫醇定量测定法测定。该测定法监测辅酶A (CoA)的释放，CoA是FASN活性的副产物，它与荧光染料CPM（7-二乙氨基-3-(4-马来酰亚胺苯基)-4-甲基香豆素）（Sigma C1484）反应，使其发出荧光。FASN生化测定中，人FASN蛋白提取自SKBr3细胞。棕榈酸合成测定按先前描述的方法²⁵进行，即将细胞在含有¹³C-乙酸的培养基中孵育，并通过LC-MS分析测定其转化为棕榈酸的量。图中显示的是 2 至 15 次独立实验的平均值。

---

活性测定[4]
在反式-1-癸酮存在下，使用 CLARIOstar 分光光度计（软件版本：5.20 R5）在 334 nm 处监测 NADPH 的氧化，测定 hFASN 的 KR 结构域在有无 Denifanstat 存在下的活性。反应在 96 孔微孔板中进行，终体积为 150 µl，温度为 37 °C。反应混合物包含 50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）、1 mM DTT、0.04% (v/v) Tween-20、400 µM NADPH、5 mM 反式-1-癸酮和 100 nM 纯化蛋白。蛋白抑制实验中使用 10 µM Denifanstat。通过分光光度法测定野生型、L1097A 和 H878A hFASN 的 DH 结构域活性，方法是检测 NADPH 氧化引起的 334 nm 处吸光度的降低。反应在 96 孔微孔板中进行，反应体系为 150 µl，温度为 37 °C。反应混合物包含 50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）、1 mM TCEP、1 mM EDTA、40 µM NADPH、800 µM DL-β-羟基丁酰辅酶 A 和 100 nM 纯化蛋白。在加入底物前，先绘制 5 分钟的标准曲线。除非另有说明，否则图表误差由每个纯化蛋白制备物中两个生物学重复实验（技术条件重复）的结果计算得出。更具体地说，使用了来自两次独立转染的两个蛋白制备物（即生物学重复）。对于每个生物学重复，在同一块96孔板上进行两次独立的检测（即技术重复）。每条曲线均以其加入底物后的第一个测量点进行归一化。每个检测重复的曲线均单独绘制在补充图10中。所有检测数据均以Excel文件的形式提供，其中包含原始和归一化的吸光度值以及每个时间点的计算NADPH浓度。
- FASN活性检测：1. 将重组人FASN酶与NADPH (0.2 mM) 和乙酰辅酶A (0.1 mM) 在反应缓冲液中预孵育10分钟。2. 加入不同浓度的Denifanstat (0.01-100 nM)，并在37°C下反应30分钟。3. 通过检测NADPH氧化速率（340 nm处吸光度的变化）计算酶活性抑制率，并通过非线性回归分析确定IC₅₀值。 [2]
体外酶或受体结合（非细胞）测定法用于检测丹尼凡司他，该方法通过测量其对脂肪酸合成酶（FASN）酶活性的直接抑制作用来进行。该测定方法使用纯化的重组FASN酶和荧光或放射性标记的底物来测量脂肪酸合成速率。将该化合物与酶和底物一起孵育，并通过测量产物生成的减少量来确定IC50值。

棕榈酰化检测方法：1. 将HEK293细胞转染Spike蛋白表达质粒，24小时后，用Denifanstat（10 nM）处理4小时。2. 细胞裂解后，进行酰基-生物素交换（ABE）反应：首先用NEM封闭游离的巯基，然后用羟胺裂解棕榈酰化的硫酯键，最后用生物素标记暴露的巯基。3. 用链霉亲和素磁珠富集棕榈酰化蛋白，并通过Western blot检测Spike蛋白条带的强度。 [1]

---

LMT[3]
LMT 使用冷冻保存的原代人细胞构建，并按照既定方案在 96 孔 Akura 培养板中进行培养，如前所述²⁷。总 TG 含量采用 TG-Glo 试剂盒测定。

---

LX-2[3]
操作步骤如前所述²⁹。简而言之，在 6 孔培养板中，每孔接种 150,000 个 LX-2 细胞，并在无血清培养基中培养过夜。同时进行两组培养。两组 LX-2 细胞均用载体（DMSO）或指定剂量的 TVB-3664 进行诱导。一组 LX-2 细胞在 TVB-3664 处理 48 小时后进行收集。另一组细胞则用含 10% FBS 的 DMEM 培养基代替载体和 TVB-3664，并继续培养 48 小时后进行收集。对于RNA表达分析，从收集的LX-2细胞中提取总RNA，合成cDNA，并通过qPCR定量分析成纤维基因的表达。由于各组之间是独立的，因此采用非配对t检验比较各组的平均结果。

---

HSC的免疫细胞化学[3]
从匿名患者的手术切除肝脏残余组织中分离、纯化并培养原代人肝星状细胞（phHSCs）。该方案已获得纽约西奈山伊坎医学院机构审查委员会（IRB）的审查和批准，并已获得受试者的知情同意。所有方法均符合《赫尔辛基宣言》的规定。在TVB-3664小分子存在的情况下，采用DAB免疫染色技术检测LX-2细胞或phHSCs中Col1α1和αSMA的表达。将10万个LX-2细胞或8万个原代hHSC细胞接种于玻璃盖玻片上。为使细胞代谢活动同步化，将细胞在添加0.1% BSA（不含抗生素）的DMEM培养基中饥饿过夜。随后，将细胞与载体或TVB-3664 FASNi在指定浓度和时间下孵育。用1×PBS彻底洗涤细胞，并用4%多聚甲醛固定，用含0.5% Tween-20的1×PBS进行透化处理，然后用Dako过氧化物酶封闭液（0.03% H₂O₂，叠氮化钠）封闭。为避免非特异性抗体结合，用Dako无血清蛋白封闭液再次封闭细胞。将细胞与兔抗Collagen1或兔抗αSMA（Abcam，MA）一抗孵育过夜进行免疫染色。同时设置一组不加一抗的对照细胞作为背景对照（数据未显示）。本研究使用的二抗为Dako标记的聚合物-HRP抗兔抗体，孵育1小时。随后用Dako DAB显色剂处理细胞。细胞核复染采用苏木精。抗体信号使用AxioCam 503单色相机，在AxioImager Z2正置显微镜下，以10倍物镜采集。图像采集使用Zen2软件进行分析。

---

PBMC和CD4+ T细胞[3]
健康人供血者的血液（采集于柠檬酸钠抗凝管）购自加州帕洛阿尔托的斯坦福血液中心。所有供血者均签署了知情同意书，并获得了斯坦福血液中心伦理委员会的批准（https://stanfordbloodcenter.org/research-updates/donating-for-research/）。所有样本均已匿名化。所有方法均符合《赫尔辛基宣言》的规定。新鲜采集的PBMC通过Ficoll Paque Plus密度梯度离心法分离。使用 Dynabeads™ 人 CD4+ T 细胞分离试剂盒富集幼稚 CD4+ T 细胞。然后将幼稚人 CD4+ T 细胞接种到 48 孔组织培养板（Costar）中，并加入 1 μg/mL 抗 CD3 和抗 CD28 抗体包被的磁珠，使之分化。为诱导人Th17细胞分化，将初始人CD4+ T细胞培养物置于含有以下添加剂的培养基中培养4天：R&D Systems公司的抗IL-2抗体（30 ng/mL）、抗IL-4抗体（20 ng/mL）、抗IFNγ抗体（50 ng/mL）、重组人IL-6（10 ng/mL）、人TGFβ（1 ng/mL）（BD Biosciences公司的重组人IL-1β（10 ng/mL）和重组人IL-23（10 ng/mL））。将所得Th17细胞培养于添加10%热灭活胎牛血清和500单位青霉素-链霉素的IMDM GlutaMAX培养基中。根据制造商的说明，采用ELISA法测定原代人外周血单核细胞（PBMC）上清液中的IL-1β水平。

---

流式细胞术[3]
针对以下单克隆抗体的特异性使用的抗原（并用指定的荧光标记物标记）包括：Foxp3 FITC (236A/E7; 1:100)、IL-17A PE-Cy7 (eBio64DEC17; 1:100) 和 CD4 PerCP (SK3; 1:200)。为分析细胞表面标志物，将细胞在含有 0.25% BSA 和 0.02% 叠氮化钠的 PBS 缓冲液中染色。使用 LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit 排除死细胞。为进行细胞内细胞因子染色，将细胞用 Brefeldin A (5 mg/mL) 处理 2 小时，然后按照制造商的说明使用 Fixation/Permeabilization Kit 进行染色。使用 FACSCalibur 流式细胞仪定量荧光细胞及其染色强度，并使用 CELLQuest 软件分析数据。
体外基于细胞的 denifanstat 检测使用依赖于从头脂肪生成的癌细胞系进行。用该化合物处理细胞后，通过将放射性标记的乙酸盐或葡萄糖掺入脂质中来测量脂肪生成。采用标准方法评估细胞活力、增殖和凋亡。通过蛋白质印迹法分析该化合物对细胞信号通路的影响。

预防性非酒精性脂肪性肝炎（NASH）饮食诱导模型[3]
本研究使用5周龄雄性C57BL/6J小鼠。CARE是一家获得美国农业部（USDA）认证（证书编号84-R-0081）和美国动物福利组织（OLAW）认可的机构。研究设计和动物使用方案在研究开始前已由CARE研究机构动物护理与使用委员会（IACUC）审查并批准，以确保符合相关法规（IACUC编号1628）。小鼠分别饲喂模拟高脂饮食（WD）的饲料，该饲料含有40%的脂肪（植物起酥油）、20%的果糖和2%的胆固醇，或普通标准商业啮齿动物饲料。肝脏样本在IDEXX BioResearch进行处理和组织学分析。采用Masson三色染色法评估肝脏中纤维结缔组织的含量，并使用油红O和脂肪滴蛋白染色切片来表征与脂肪变性相关的组织学特征。一位合格的病理学家使用以下评分系统对HE染色切片进行组织学评估：0 = 正常；1 = 轻微改变；2 = 轻度改变；3 = 中度改变；4 = 显著改变；5 = 重度改变。细胞因子/趋化因子检测由Sagimet Biosciences公司使用终末采血样本，按照制造商说明书通过ELISA法进行。

---

治疗性NASH饮食诱导模型[3]
使用5周龄雄性C57BL/6J小鼠。所有动物实验均按照Gubra的生物伦理指南进行，完全符合国际公认的实验动物护理和使用原则。实验已获得丹麦动物研究委员会颁发的Jacob Jelsing的许可（2013-15-2934-00784和2015-15-0201-00518）。在接受 TVB-3664 治疗前 44 周以及治疗期间，小鼠饲喂模拟高脂饮食 (WD) 的饲料，该饲料含有 40% 高反式脂肪、高糖（20% 果糖，9% 蔗糖）和 2% 胆固醇（Research Diets 公司，#D09100310）。采集血样于肝素化试管中，分离血浆后储存于 -80 °C 直至分析。使用 Cobas™ C-501 全自动生化分析仪和商业试剂盒，按照制造商说明书测定 TG、TC、ALT 和 AST 水平。肝脏免疫组化 (IHC) 采用标准化流程。NAS 评分采用 Kleiner 等人²⁸ 所述的标准。纤维化程度评分为 0 分（无纤维化）、1 分（窦周或门静脉周围纤维化）、2 分（窦周和门静脉/门静脉周围纤维化）或 3 分（桥接纤维化）。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），并使用Dunnett多重比较检验比较治疗组和载体组。对于每只动物组织学评分的变化，采用Fisher精确检验，并使用Bonferroni方法进行多重校正。

---

- MHV感染小鼠模型：1. 将6-8周龄的BALB/c小鼠经鼻内感染MHV（1×10⁴ PFU），并在感染后24小时随机分组。2. 将Denifanstat溶解于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，并以10 mg/kg的剂量，每日一次，连续7天口服给药。3. 监测小鼠的存活情况。在感染后第7天处死小鼠，并收集肺组织以检测病毒滴度。[1]
- NASH小鼠模型：1. 将C57BL/6小鼠喂食高脂高胆固醇饮食16周以诱导NASH。 2. 将 Denifanstat（50 mg/kg）溶于 PEG400：生理盐水（1:1）混合液中，每日灌胃一次，持续 12 周。3. 实验结束时，取肝脏进行组织学分析和生化指标检测。[2]
纤维化和肿瘤（FAT）-NASH CCl4 模型[3]
本研究使用 6 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠。该动物实验方案已获得纽约西奈山伊坎医学院 IACUC 的批准（IACUC-2015-0112）。该模型此前已有描述²⁹。小鼠饲喂模拟高脂饮食（WD）的饲料，该饲料含有21.2%的脂肪（42%千卡）、41%的蔗糖和1.25%的胆固醇（Teklad定制饲料，货号TD.120528，Envigo，WI），并可自由饮用糖水溶液（18.9 g/L D-(+)-葡萄糖和23.1 g/L D-(−)-果糖），每周腹腔注射一次四氯化碳（CCl4，0.2 µg），持续24周。在小鼠出现非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝纤维化后，于最后12周分别给予3 mg/kg TVB-3664或载体（PEG400）治疗。血清分析、纤维化基因和蛋白表达、Bioquant胶原蛋白定量以及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）活动评分（NAS）的分析方法如前所述²⁹。数据分析采用GraphPad Prism v7.4统计软件完成。标准误差表示平均值（±）。标准误 (SEM) 根据非配对双尾 Mann-Whitney 检验计算，其中高斯分布为非参数分布。除非另有说明，p 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。
denifanstat 的体内动物实验采用小鼠异种移植肿瘤模型和非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎 (NAFLD/NASH) 模型进行。在癌症模型中，将化合物口服给予皮下肿瘤小鼠，并测量肿瘤体积。在 NAFLD/NASH 模型中，将化合物给予喂食高脂饮食的小鼠，并通过组织学分析和生化标志物评估肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。

吸收和分布：小鼠口服Denifanstat（10 mg/kg）后，1小时内达到血浆峰浓度（Cmax = 210 ng/mL），生物利用度为38%。药物浓度在肝脏中最高，是血浆浓度的5倍。[2] 代谢和排泄：Denifanstat主要通过CYP3A4代谢，半衰期为4.2小时。约60%的剂量以代谢物的形式经粪便排出，30%经尿液排出。[2]
Denifanstat的药代动力学(PK)特性表明其具有口服活性和良好的生物利用度。该化合物的分子量为439.55。其设计目的是在靶组织（例如肿瘤、肝脏）中达到足够的浓度，从而抑制FASN活性。在临床前研究中，通过对血浆和组织样本进行 LC-MS/MS 分析来确定具体的 PK 参数。

急性毒性：小鼠单次口服Denifanstat后，其LD₅₀ > 2000 mg/kg，未观察到明显的毒性症状。在犬的重复给药毒性研究中，连续28天以50 mg/kg/天的剂量给药后，未观察到肝肾损伤。[2]
- 血浆蛋白结合率：Denifanstat在人体内的血浆蛋白结合率为98.7%，主要与白蛋白结合。[2]
Denifanstat的毒理学数据正在临床前和临床研究中进行评估。作为一种FASN抑制剂，其安全性对于其作为治疗药物的开发至关重要。该化合物在治疗剂量下通常耐受性良好。最常见的副作用可能包括胃肠道紊乱和对脂质代谢的影响。

[1]. Fatty Acid Synthase inhibition prevents palmitoylation of SARS-CoV2 Spike Protein and improves survival of mice infected with murine hepatitis virus. BioRxiv, December 21, 2020.

[2]. Heterocyclic modulators of lipid synthesis. WO2012122391A1.

Denifanstat是一种口服生物利用度高的脂肪酸合成酶（FASN）抑制剂。由于其抗肿瘤活性，目前正在研究其在多种癌症中的应用。Denifanstat是一种口服生物利用度高的脂肪酸合成酶（FASN）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，denifanstat与FASN结合并阻断其活性，从而阻止棕榈酸的合成。棕榈酸是肿瘤细胞生长和存活所必需的。这会导致细胞信号传导减弱，诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制易感肿瘤细胞的增殖。FASN是负责从头合成棕榈酸的酶，在肿瘤细胞中过度表达，并在肿瘤代谢、脂质信号传导、肿瘤细胞存活和耐药性中发挥关键作用；肿瘤细胞依赖于增加脂肪酸的摄入来满足其增强的代谢需求和快速生长。作用机制：Denifanstat (TVB-2640) 通过抑制脂肪酸合成酶 (FASN) 来抑制棕榈酸的合成，从而阻断病毒刺突蛋白的棕榈酰化修饰，抑制病毒进入宿主细胞。同时，它还能通过减少肝脏脂质合成来改善非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 的病理过程。[1][2]
- 适应症：目前正处于临床开发阶段，适应症包括 NASH、痤疮和病毒感染（例如 COVID-19）。[1][2]
其他信息：Denifanstat 正在被开发为一种潜在的癌症和代谢性疾病治疗药物。它已在 NASH 和多种癌症的临床试验中进行了评估。该化合物也称为 TVB-2640 和 FASN-IN-2。

C27H29N5O

439.5521

439.2372

C, 73.78; H, 6.65; N, 15.93; O, 3.64

1399177-37-7

1399177-37-7;

66548316

White to off-white solid powder

5.3

85.7Ų

1

4

4

33

728

0

O=C(C1=CC(C2=NNC(C)=N2)=C(C=C1C)C1CCC1)N1CCC(C2C=CC(C#N)=CC=2)CC1

BBGOSBDSLYHMRA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H29N5O/c1-17-14-24(22-4-3-5-22)25(26-29-18(2)30-31-26)15-23(17)27(33)32-12-10-21(11-13-32)20-8-6-19(16-28)7-9-20/h6-9,14-15,21-22H,3-5,10-13H2,1-2H3,(H,29,30,31)

4-(1-(4-Cyclobutyl-2-methyl-5-(5-methyl-4H-1,2,4-triazol-3- yl)benzoyl)piperidin-4-yl)benzonitrile

TVB 2640; Denifanstat; FASN-IN-2; ASC-40; TVB-2640; ASC40; TVB2640

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~227.51 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。