TEAD1 Palmitoylation

由于 VT103（HEK293T 细胞；3 μM）不会阻止 TEAD2、TEAD3 或 TEAD4 被棕榈酰化，因此它似乎具有 TEAD1 选择性。 YAP-TEAD1 连接会被 VT103（缺乏 NF2 的 NCI-H226 细胞；3 mmol/L；4 或 24 小时）特异性破坏 [1]。由于 VT103，非棕榈酰化 TEAD1 增加，而棕榈酰化 TEAD1 减少[1]。在 YAP 报告基因实验中，VT103 的 IC50 为 1.02 nM [1]。

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与VT103共孵育后，与TEAD家族的其他成员相比，TEAD1的熔化温度升高幅度最大，达到8.3℃。热变性曲线清晰地显示TEAD1单独（红色曲线）和TEAD1+VT103（蓝色曲线）的两个独立峰，而其他TEAD蛋白的±VT103曲线的峰大部分重叠（图4A，顶部）。这与功能性棕榈酰化实验的发现一致，即VT103是tead1选择性抑制剂。另一方面，VT107通过TEAD棕榈酰化实验被确定为泛TEAD抑制剂，它显著改变了所有四个TEAD家族成员的熔化温度（图4A）。VT104改变了所有四种TEAD家族成员的熔化温度，但TEAD1和TEAD3的变化更大。VT106仅微弱地改变了所有四个tead的熔化温度。[1]

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为了确定我们优化的化合物是否以tead选择性的方式阻止细胞中YAP/ TAZ-TEAD蛋白-蛋白相互作用，我们用VT103或VT107处理nf2突变体NCI-H2373细胞4或24小时，分别用TEAD1特异性抗体和TEAD4特异性抗体（图5A和B）免疫沉淀内源性TEAD1和TEAD4蛋白，并用抗YAP和抗taz抗体探测免疫复合物。与选择性结合TEAD1蛋白和选择性抑制TEAD1棕榈酰化一致，VT103在4和24小时后降低了YAP与TEAD1的相互作用，而不是TEAD4。TAZ-TEAD1相互作用在VT103治疗4小时后被破坏。相比之下，VT107阻断了YAP和TAZ与TEAD1和TEAD4的相互作用，24小时的作用强于4小时（图5A和B）。活性较低的对映体VT106未能阻断YAP/ TAZ-TEAD4相互作用（图5B），并且在24小时处理后仅微弱地破坏YAP/ TAZ-TEAD1相互作用（图5A）。在4和24小时处理后，VT103也选择性地破坏了nf2缺陷的NCI-H226细胞中YAP-TEAD1的相互作用（图5C和D）[1]。

VT103（0.3~10 mg/kg；每天口服一次）即使在0.3 mg/kg的剂量下也能减少肿瘤生长[1]。 VT103 在小鼠体内的药代动力学 [1] 剂量 IV PO 7 mg/kg T1/2（小时） Vdss (L/kg) CI (mL/min/kg) AUC 0-24 小时 (μg*h/ mL) AUC 0- 24 小时 (μg*h/mL) 口服利用度 (%) Cmax (ng/mL) C24 小时 (ng/mL) 13.2 4.5 4.7 20.0 14.9 75 896 （1 小时） 340.

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VT103和VT104阻断nf2缺陷间皮瘤异种移植物[1]
由于TEAD在小鼠体内具有良好的口服生物利用度（≥75%）和较长的半衰期（>12小时）（图2），VT103和VT104使我们能够在体内评估TEAD自身棕榈酰化抑制在人间皮瘤异种移植模型中的靶向作用和抗肿瘤效果。如图6B所示，在第三次每日给药4小时后，VT103显著下调nf2缺失小鼠NCI-H226肿瘤中Hippo通路靶基因CTGF和CYR61的表达，并呈剂量依赖性。在相同的nci - h226荷瘤动物中，VT103也以剂量依赖的方式下调肾脏和肝脏中的靶基因表达（Supplementary Fig. S6A）。然而，在同一时间点似乎没有任何病理影响，因为肾脏和肝脏的H&E图像在载药组和药物治疗组之间没有差异（补充图S6B）。生物分析表明，VT103在循环系统和肿瘤组织中存在剂量依赖性暴露（补充图S6C）。此外，在同一动物体内，肿瘤中的化合物积累似乎比循环中的化合物积累更多（补充图S6C）。通过免疫组化检测vt103处理的NCI-H226肿瘤组织中的YAP和TEAD1蛋白显示，这些蛋白的细胞定位或水平没有变化（补充图S6D）。

VT103以剂量依赖的方式显著阻断小鼠NCI-H226肿瘤生长（图6C）。NCI-H226荷瘤小鼠随机分组，当肿瘤达到约110 mm3时，开始每日口服VT103。最后一次给药是在第45天。第46天采集血浆样本。生物分析显示循环中的预期药物浓度呈剂量依赖性（补充图S6E）。在NCI-H226 CDX模型中，VT103表现出较强的抗肿瘤作用，每日1次口服3mg /kg （TGI = 106.14%, P < 0.001，到第46天），导致肿瘤消退。1和0.3 mg/kg每日1次，VT103也显著抑制肿瘤生长（TGI分别为83.79%,P < 0.001和47.95%,P = 0.001）。在每日给药VT103的长期治疗期间，没有观察到对体重的不良影响（图6C）。

NCI-H2373是一种携带NF2基因纯合缺失的人间皮瘤细胞系。尽管该细胞系在小鼠中不能很好地生长肿瘤（补充图S7，并在下面详细描述），但我们能够在使用该细胞系的第二种人类间皮瘤模型中进行短期药物治疗，以评估VT103靶点参与和对途径靶基因表达的影响。小鼠皮下注射亲代NCI-H2373细胞，当肿瘤大小达到约300 mm3时，小鼠口服VT103，剂量为10 mg/kg，每日1次，连用3天。对第三次给药后4小时收获的NCI-H2373荷瘤小鼠的肿瘤进行APEGS分析表明，VT103使脂质修饰形式的TEAD1相对于总TEAD1的水平降低了40.0±0.06%(图6D；补充图S8)。在这些NCI-H2373肿瘤中，观察到CTGF基因表达下调5倍(图6E；我们在本模型研究中未检测CYR61的表达)。

皮下注射NCI-H2373细胞后，小鼠在第7天观察到可测量的肿瘤，但在接下来的4周内，这些肿瘤生长非常缓慢，在此期间有一些退化（补充图S7）。因此，尽管该模型可用于短期药效学研究，但并非药物疗效研究的理想模型。为了获得第二个有效的体内模型来评估长期治疗的抗肿瘤疗效，我们在小鼠中连续传代NCI-H2373肿瘤，并获得NCI-H2373- tu - p2系，该系通过STR证实与NCI-H2373遗传相关，并通过体外细胞增殖试验证实对我们的TEAD抑制剂敏感。在第二种人类间皮瘤CDX模型NCI-H2373-Tu-P2中，我们也观察到当VT103每日口服一次，剂量分别为10、3和1 mg/kg (TGI = 126.70%、118.32%、110.51%；P = 0.018, 0.022, 0.030；图6 f)。即使在0.3 mg/kg的剂量下，VT103在体内也能抑制肿瘤生长，但没有统计学意义（TGI值= 76.43%,P = 0.124）。VT103四个剂量组的动物均未出现体重减轻（图6F）。考虑到在体内生长NF2突变型间皮瘤肿瘤的困难，我们能够在模型最终丢失之前重复两次疗效研究。结果表明，VT103在耐受剂量下具有较高的体内活性，值得进一步评价。

无细胞TEAD棕榈酰化测定 [1]
纯化的重组TEAD1–YBD首先与化合物一起孵育，然后与2μmol/L炔烃棕榈酰辅酶A一起孵育。用1%SDS猝灭反应，然后如前所述与生物素叠氮化物进行点击化学反应。在一些实验中，APCoA以不同的浓度和不同的顺序加入。分别通过链霉亲和素-HRP和抗TEAD1抗体免疫印迹法检测棕榈酰化TEAD和总TEAD蛋白。

基于细胞的TEAD棕榈酰化测定[1]
Myc-TEAD表达质粒转染的HEK293T细胞用DMSO或100μmol/L棕榈酸炔+DMSO/化合物处理20小时。用抗Myc抗体免疫沉淀Myc-TEAD蛋白，并进行点击化学。链亲和素免疫印迹法检测棕榈酰化TEAD。如上所述进行酰基聚乙二醇交换凝胶位移测定。

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细胞增殖试验[1]
采用CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒（Luminescent Cell Viability Assay Kit），按照生产厂家的方案，以3 μmol/L剂量滴定的化合物处理不同时间的细胞。采用剂量反应曲线计算IC50和最大抑制率。

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免疫荧光法[1]
用4%多聚甲醛固定10 - 15分钟，用0.1% Triton X-100在PBS中渗透后，在室温下用3% BSA在PBS中阻断细胞1 - 2小时，在4℃下用一抗染色过夜，然后用Alexa荧光偶联二抗在室温下染色2 - 3小时。载玻片用含DAPI的延长金抗褪色试剂贴膜。图像由尼康Eclipse Ti共聚焦显微镜拍摄。

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免疫沉淀反应[1]
用PBS洗涤细胞并裂解[50 mmol/L Tris pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton-X100, 50 mmol/L NaF, 1 mmol/L PMSF，蛋白酶抑制剂鸡尾酒，磷酸酶抑制剂]。超声和离心后，收集上清液，与抗tead、抗yap或对照抗体孵育，用蛋白A/G珠沉淀，按标准方案进行免疫印迹分析（抗体信息见补充表S3）。

动物/疾病模型： NCI-H226荷瘤小鼠[1]
剂量： 0.3~10 mg/kg
给药途径： 口服，每日一次
实验结果： 即使在0.3 mg/kg的剂量下也能抑制肿瘤生长。

小鼠药代动力学
VT103、VT104和VT107配制于5% DMSO + 10% Solutol + 85% D5W中，分别以7或10 mg/kg的剂量进行静脉或口服给药。在指定时间点从隐静脉抽取血液。采用QTRAP 6500液相色谱-串联质谱法(LC/MS-MS)对化合物进行定量分析。数据分析采用Phoenix WinNonlin 6.3软件，静脉注射采用非房室模型201，口服采用非房室模型200。计算方法为线性/对数梯形法。

体内药效学和疗效研究
所有动物操作、护理和治疗程序均按照药明康德或Crown Bioscience, Inc.的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的指南进行，并遵循实验动物评估和认证协会(AAALAC)的指导。将受试药物配制成给药溶液（5% DMSO + 10% 索洛尔 + 85% 5%葡萄糖溶液；5%葡萄糖溶液）并按指定剂量每日口服给药。每周监测两次肿瘤体积和动物体重。

VT103是VT101的类似物，其效力增强，且在小鼠体内具有良好的口服药代动力学（图2；补充表S1）。VT104是VT102的类似物，其效力增强，且在小鼠体内具有良好的口服药代动力学（图2；补充表S1）。VT105是VT104的更易溶的类似物（图2），可用于TEAD X射线晶体学实验。VT106和VT107是VT104的对映异构体；它们的效力差异很大，因此可作为生化和细胞实验中有用的相互对照（图2）。[1]

[1]. Small Molecule Inhibitors of TEAD Auto-palmitoylation Selectively Inhibit Proliferation and Tumor Growth of NF2-deficient Mesothelioma. Mol Cancer Ther. 2021;20(6):986-998.

神经纤维瘤病2型（NF2）基因突变会限制或消除功能性Merlin蛋白的表达，这种情况在恶性间皮瘤中很常见。Merlin蛋白激活Hippo信号通路，抑制YAP和TAZ的核转位。YAP和TAZ是该通路的主要效应因子，它们与细胞核内的TEAD转录因子结合，促进参与细胞增殖和存活的基因表达。本文描述了我们发现的能够选择性抑制YAP/TAZ-TEAD促进的基因转录、阻断TEAD自身棕榈酰化以及破坏YAP/TAZ与TEAD相互作用的化合物。优化筛选获得了具有优异口服生物利用度和药代动力学特性的高效类似物，这些类似物能够选择性地抑制体外NF2缺陷型间皮瘤细胞的增殖以及体内皮下肿瘤异种移植瘤的生长。这些高效且选择性的TEAD抑制剂为靶向Hippo-YAP通路提供了一种新途径。Hippo-YAP通路此前一直难以成药，但在恶性间皮瘤和其他YAP驱动的癌症和疾病中经常出现异常调控。[1]除了在小鼠中验证化合物的耐受性外，本文所述研究并未涉及化合物的任何毒性，这些毒性可能与TEAD棕榈酰化抑制有关，也可能无关。需要对多种动物进行正式的毒理学评估，以明确这些小分子化合物的安全性。如果结果令人满意，则有必要对 TEAD 棕榈酰化抑制剂在 NF2 突变型间皮瘤和具有激活的 YAP/TAZ-TEAD 转录活性的癌症中进行临床评估，作为单药疗法或与其他靶向癌症疗法联合使用。[1]

C18H17F3N4O2S

410.413392782211

410.102

C, 52.68; H, 4.18; F, 13.89; N, 13.65; O, 7.80; S, 7.81

2290608-13-6

VT-103 hydrochloride; 2290608-13-6

137534047

Off-white to gray solid powder

3.1

84.4Ų

2

8

5

28

617

0

S(C1C=CC(=C(C2=CN(C)C=N2)C=1)NC1C=CC(C(F)(F)F)=CC=1)(NC)(=O)=O

LCVDQHLYHBAHR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H17F3N4O2S/c1-22-28(26,27)14-7-8-16(15(9-14)17-10-25(2)11-23-17)24-13-5-3-12(4-6-13)18(19,20)21/h3-11,22,24H,1-2H3

N-methyl-3-(1-methyl-1H-imidazol-4-yl)-4-((4-(trifluoromethyl)phenyl)amino)benzenesulfonamide

VT-103; VT 103; 2290608-13-6; N-Methyl-3-(1-methyl-1H-imidazol-4-yl)-4-((4-(trifluoromethyl)phenyl)amino)benzenesulfonamide; CHEMBL5198469; SCHEMBL20779435; LLCVDQHLYHBAHR-UHFFFAOYSA-N; QRD60813; VT103

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO :＜1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: 5% DMSO + 10% solutol + 85% D5W; D5W = 5% glucose [reported in Mol Cancer Ther. 2021;20(6):986-998. ]

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配方 2 中的溶解度: ~4.1mg/ml (~10 mM) in 5%DMSO + 40%PEG300 + 5%Tween 80 + 50%ddH2O
以配制1 mL工作溶液为例：取400 μL PEG300，加入50 μL浓度为82 mg/mL的澄清DMSO母液，混匀至澄清；再向上述体系中加入50 μL Tween80，混匀至澄清；随后继续加入500 μL ddH₂O，定容至1 mL。建议配制后立即使用，以确保最佳效果。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.1 mM) in 10% DMSO + 90% Corn oil, 澄清溶液
例如，若需制备1 mL的工作液，取100 μL 25 mg/mL DMSO储备液，加入900 μL玉米油中，混匀（澄清溶液）。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。