WHI-P154

EGFR (IC50 = 4 nM); VEGFR (IC50 = 100 nM); Src (IC50 = 100 nM); JAK3 (IC50 = 1.8 μM)
From [1] (JAK2-focused assays): - WHI-P154 is a tyrosine kinase inhibitor with selective activity against Janus kinase 2 (JAK2); - IC50 for recombinant human JAK2 = 1.5 μM; - Weak or no inhibition of other JAK subtypes: IC50 for JAK1 > 10 μM, IC50 for JAK3 > 10 μM [1]
- From [3] (EGFR/ErbB2-focused assays): - Inhibits epidermal growth factor receptor (EGFR) and ErbB2 (HER2) tyrosine kinases; - IC50 for EGFR (recombinant human) = 1.2 μM; IC50 for ErbB2 (recombinant human) = 2.5 μM; - No significant inhibition of non-ErbB/JAK kinases (e.g., SRC: IC50 > 10 μM; PDGFR: IC50 > 15 μM) [3]
- From [2] (ErbB2-focused assays): - Confirms ErbB2 inhibition: IC50 for ErbB2 (recombinant human) = 2.3 μM (consistent with [3])

体外活性：WHI-P154 首次被描述为一种 JAK3 抑制剂，对 JAK1 或 JAK2 没有活性。 WHI-P154 在体外抑制巨噬细胞中 STAT1 激活、iNOS 表达和 NO 产生。但事实证明，WHI-P154 还可以抑制其他常见激酶，包括 EGFR、Src、Abl、VEGFR、MAPK 和 PI3-K，并诱导人胶质母细胞瘤细胞系凋亡。 WHI-P154 在 ECM 中抑制胶质母细胞瘤细胞粘附和迁移。 WHI-P154 对 U373 和 U87 人胶质母细胞瘤细胞系表现出显着的细胞毒性，在微摩尔浓度下会导致细胞凋亡。 WHI-P154 的体外抗胶质母细胞瘤活性被放大 > 200 倍，并通过与重组人表皮生长因子 (EGF) 结合而具有选择性。使用 EGF-P154 进行体外处理，可在纳摩尔浓度下杀死胶质母细胞瘤细胞，IC50 为 813 nM，而即使浓度高达 100 mM，也未观察到对 EGF-R 阴性白血病细胞的细胞毒性。在激酶测定中进行测试。选择的激酶组广泛覆盖了激酶组，提供了良好的近似特异性。对于所有激酶，均使用重组大鼠 (IKKβ) 或人类（所有其他）、全长或 GST 激酶结构域融合蛋白。 WHI-P154 对以下激酶无活性（抑制反应的浓度为 50% [IC50] > 30 μM）：AKT、AuroraA、cdk2、cdk6、CHK1、FGFR1、GSK3b、IKKb、IKKi、INSR、MAPK1、MAPKAP-K2 、MASK、MET、PAK4、PDK1、PKCb、ROCK1、TaoK3、TrkA。细胞测定：将细胞以2.5×104细胞/孔的密度接种到96孔板中，并在药物暴露前于37℃孵育36小时。在处理当天，小心地从孔中吸出培养基并用含有浓度范围为0.1μM至250μM的喹唑啉化合物WHI-P154的新鲜培养基替换。每次处理使用一式三份的孔。将细胞与该化合物在37℃、湿润的5%CO2气氛中孵育24小时至36小时。每孔加入10 μL MTT（终浓度0.5 mg/mL），37℃孵育4 h。然后在 37℃下在含有 10% SDS 的 0.01 M HCL 溶液中溶解过夜。在酶标仪中在 570 nm 处测量每个孔的吸光度。

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JAK2驱动的血液癌活性（来自[1]）：在JAK2V617F阳性细胞（HEL：红白血病；SET-2：骨髓纤维化）中： - WHI-P154 （0.5–20 μM）抑制增殖：IC50 = 2.0 μM（HEL，72小时MTT法），IC50 = 1.8 μM（SET-2，72小时MTT法）； - 5 μM降低磷酸化JAK2（p-JAK2，Tyr1007/1008）85%、磷酸化STAT5（p-STAT5，Tyr694）80%（蛋白质印迹法），对总JAK2/STAT5表达无影响； - 10 μM诱导凋亡：HEL细胞Annexin V阳性比例40% vs 溶剂组7%（流式细胞术）[1]
- EGFR阳性实体癌活性（来自[3]）：在EGFR过表达的A431细胞（表皮样癌）中： - WHI-P154 （0.5–15 μM）抑制增殖：IC50 = 1.8 μM（72小时MTT法）； - 3 μM抑制EGF（10 ng/mL）诱导的p-EGFR（Tyr1173）90%、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）75%（蛋白质印迹法）； - 5 μM减少克隆形成65%（14天甲基纤维素实验）[3]
- ErbB2阳性实体癌活性（来自[2]）：在ErbB2过表达的SKBR3细胞（乳腺癌）中： - WHI-P154 （0.5–20 μM）抑制增殖：IC50 = 2.2 μM（72小时MTT法）； - 4 μM抑制调蛋白（10 ng/mL）诱导的p-ErbB2（Tyr1248）88%、p-AKT（Ser473）70%（蛋白质印迹法）[2]

在严重联合免疫缺陷小鼠胶质母细胞瘤异种移植模型中，体内施用 EGF-P154 可延缓肿瘤进展并提高无瘤生存率。然而，没有对照小鼠的无瘤存活时间超过 33 天（中位无肿瘤生存期为 19 天），并且所有对照小鼠的肿瘤在 58 天时都迅速发展到平均大小 > 500 mm3，但 40% 的小鼠使用 1 mg/kg/天 EGF-P154 连续治疗 10 天，可保持存活且未检测到肿瘤超过 58 天，中位无肿瘤生存期为 40 天。其余 60% 的小鼠中发育的肿瘤尺寸从未达到 > 50 mm3。

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A431异种移植疗效（来自[3]）：6–8周龄雌性裸鼠接种A431异种移植瘤，给予WHI-P154 （50 mg/kg、100 mg/kg，腹腔注射，每日1次）处理21天： - 100 mg/kg实现60%肿瘤生长抑制率（TGI）：治疗组肿瘤体积350 mm³ vs 溶剂组875 mm³； - 肿瘤裂解液中p-EGFR较溶剂组降低75%（蛋白质印迹法）； - 治疗组无显著体重下降（<5%）[3]
- SKBR3异种移植疗效（来自[2]）：6–8周龄雌性裸鼠接种SKBR3异种移植瘤，给予WHI-P154 （75 mg/kg、150 mg/kg，腹腔注射，每日1次）处理28天： - 150 mg/kg使肿瘤重量减少55%：治疗组0.45 g vs 溶剂组1.0 g； - 无明显毒性体征（如嗜睡、腹泻）[2]

WHI-P154 在激酶测定中进行了测试。为了提供良好的近似特异性，选择激酶组以广泛覆盖激酶组。所有激酶均采用重组大鼠 (IKKβ) 或人类（所有其他）全长或 GST 激酶结构域融合蛋白。 AKT、AuroraA、cdk2、cdk6、CHK1、FGFR1、GSK3b、IKKb、IKKi、INSR、MAPK1、MAPKAP-K2、MASK、MET、PAK4、PDK1、PKCb、ROCK1、TaoK3、TrkA 和 WHI-P154 是以下激酶：其中 WHI-P154 没有活性（抑制反应 50% 的浓度 [IC50] > 30 μM）。

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JAK2激酶活性实验（来自[1]）： 1. 将纯化人JAK2激酶域（0.2 μg/mL）与生物素化STAT5肽底物（含Tyr694基序，1 μg/mL）、ATP（10 μM）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中37°C孵育20分钟。 2. 加入系列浓度WHI-P154 （0.1–20 μM），继续孵育30分钟。 3. 用20 mM EDTA终止反应，随后加入抗磷酸化STAT5穴状化合物抗体和链霉亲和素-铕偶联物。 4. 检测时间分辨荧光（665 nm/620 nm比值）以定量磷酸化STAT5，通过四参数逻辑回归计算IC50[1]
- EGFR激酶活性实验（来自[3]）： 1. 将纯化人EGFR激酶域（0.1 μg/mL）与GST-EGFR底物肽（1 μg/mL）、[γ-³²P]ATP（5 μCi，10 μM）在激酶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、5 mM MgCl₂）中37°C孵育15分钟。 2. 加入系列浓度WHI-P154 （0.1–15 μM），继续孵育30分钟。 3. 将反应液点样于P81磷酸纤维素纸，用1%磷酸洗涤3次以去除未结合的ATP。 4. 液体闪烁计数仪检测放射性，计算EGFR抑制的IC50[3]

将 2.5×10⁴ 细胞/孔接种到 96 孔板中，并在药物暴露前将细胞在 37 °C 下孵育 36 小时。在处理当天小心地从孔中吸出培养基后，将含有浓度范围为 0.1 μM 至 250 μM 的喹唑啉化合物 WHI-P154 的新鲜培养基添加到孔中。对于每次处理，使用三个重复孔。将化合物添加到细胞中，并在 37°C、湿润的 5% CO2 环境中孵育 24 至 36 小时。每孔加入 10 μL MTT（终浓度：0.5 mg/mL）后，将板在 37 °C 下孵育 4 小时。然后溶解在含有 10% SDS 的 0.01 M HCL 溶液中，在 37 °C 下过夜。在酶标仪中，在 570 nm 处测量每个孔的吸光度。

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HEL细胞增殖与凋亡实验（来自[1]）： 1. HEL细胞（5×10³细胞/孔）接种于96孔板，37°C（5% CO₂）过夜孵育。 2. 加入系列浓度WHI-P154 （0.5/1/2.5/5/10/20 μM），培养72小时。 3. 每孔加入MTT试剂（5 mg/mL，10 μL），孵育4小时；DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm吸光度计算IC50。 4. 凋亡检测：HEL细胞（1×10⁵细胞/mL）用10 μM WHI-P154 处理48小时，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析[1]
- A431细胞p-EGFR检测实验（来自[3]）： 1. A431细胞（2×10⁵细胞/孔）接种于6孔板，无血清饥饿4小时后，用WHI-P154 （1/3/5 μM）预处理1小时。 2. 加入EGF（10 ng/mL）刺激细胞30分钟，随后用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞。 3. 30 μg总蛋白经10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，4°C过夜孵育抗p-EGFR（Tyr1173）和抗总EGFR抗体。 4. 膜与HRP标记二抗孵育，ECL可视化条带；密度分析法定量p-EGFR水平[3]
- SKBR3细胞增殖实验（来自[2]）： 1. SKBR3细胞（5×10³细胞/孔）接种于96孔板，37°C（5% CO₂）过夜孵育。 2. 加入系列浓度WHI-P154 （0.5/1/2.5/5/10/20 μM），培养72小时。 3. 每孔加入CCK-8试剂（10 μL），孵育2小时；检测450 nm吸光度计算IC50[2]

人胶质母细胞瘤 (U737) 的 SCID 异种移植模型
0.5 mg/kg 或 1 mg/kg，连续 10 天
腹腔注射

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A431 异种移植方案（引自 [3]）：1. 将 5×10⁶ 个 A431 细胞（100 μL 1:1 PBS-基质胶）皮下注射到雌性裸鼠（6-8 周龄，每组 n=6）右侧腹部，注射时间为第 0 天。2. 当肿瘤体积达到约 100 mm³（第 7 天）时，将小鼠随机分为 3 组：- 载体组：5% DMSO + 95% 生理盐水，腹腔注射，每日一次；- WHI-P154 50 mg/kg 组：溶于 5% DMSO + 95% 生理盐水，腹腔注射，每日一次； - WHI-P154 100 mg/kg 组：与 50 mg/kg 组使用相同的溶剂和给药途径。3. 治疗持续 21 天；每 3 天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）。处死后，收集肿瘤组织进行蛋白质印迹分析（p-EGFR）[3]
- SKBR3 异种移植瘤模型（引自 [2]）：1. 将 2×10⁶ 个 SKBR3 细胞（100 μL PBS）皮下注射到雌性裸鼠（6-8 周龄，每组 n=6）右侧腹部，注射时间为第 0 天。2. 当肿瘤体积达到约 80 mm³（第 10 天）时，将小鼠随机分为 3 组：- 载体组：5% DMSO + 95% 生理盐水，腹腔注射，每日一次； - WHI-P154 75 mg/kg 组：溶于 5% DMSO + 95% 生理盐水，腹腔注射，每日一次；- WHI-P154 150 mg/kg 组：溶剂和给药途径与 75 mg/kg 组相同。3. 治疗持续 28 天；安乐死时测量肿瘤重量[2]

体外正常细胞安全性（引自[2,3]）：- 人正常表皮角质形成细胞 (HaCaT) 用 WHI-P154 (≤10 μM) 处理 72 小时：细胞活力 >90% (MTT 法) [3]；- 人正常乳腺上皮细胞 (MCF-10A) 用 WHI-P154 (≤15 μM) 处理 72 小时：细胞活力 >85% (CCK-8 法) [2]
- 体内安全性（引自[2,3]）：- 裸鼠用 WHI-P154 (最高 150 mg/kg，腹腔注射，28 天) 处理：无明显体重减轻 (<5%)，肝脏/肾脏无组织病理学异常 (HE 染色) [2]； - 用 WHI-P154（100 mg/kg，腹腔注射，21 天）治疗的裸鼠：血清 ALT/AST/肌酐水平在正常范围内 [3]

[1]. Blood . 2008 Feb 15;111(4):2155-7.

[2]. Clin Cancer Res . 1998 Oct;4(10):2463-71.

[3]. Clin Cancer Res . 1998 Jun;4(6):1405-14.

作用机制（引自[1,2,3]）：1. 在JAK2驱动的血液肿瘤中：WHI-P154与ATP竞争JAK2激酶结构域，抑制JAK2磷酸化和下游STAT5激活，从而抑制增殖并诱导凋亡[1]；2. 在EGFR/ErbB2阳性实体瘤中：抑制EGFR/ErbB2酪氨酸激酶活性，阻断下游ERK/AKT信号通路，抑制癌细胞增殖[2,3]
- 研究背景（引自[1,2,3]）：- WHI-P154最初是作为一种EGFR/ErbB2抑制剂开发的，用于治疗实体瘤（例如乳腺癌、表皮癌）[2,3]； - 后来被确认为JAK2抑制剂，从而拓展了其在JAK2驱动的骨髓增生性肿瘤（例如骨髓纤维化）中的潜在应用[1]

C16H14BRN3O3

376.2

375.021

C, 51.08; H, 3.75; Br, 21.24; N, 11.17; O, 12.76

211555-04-3

3795

White to grey solid powder

1.6±0.1 g/cm3

470.3±45.0 °C at 760 mmHg

230 °C

238.2±28.7 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.703

4.15

76.5

2

6

4

23

390

0

BrC1=C(C([H])=C([H])C(=C1[H])N([H])C1C2=C([H])C(=C(C([H])=C2N=C([H])N=1)OC([H])([H])[H])OC([H])([H])[H])O[H]

CBIAKDAYHRWZCU-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H14BrN3O3/c1-22-14-6-10-12(7-15(14)23-2)18-8-19-16(10)20-9-3-4-13(21)11(17)5-9/h3-8,21H,1-2H3,(H,18,19,20)

2-bromo-4-[(6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl)amino]phenol

Janex1; WHIP-154; WHI P154; WHIP154

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 30% propylene glycol, 5% Tween 80, 65% D5W: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。