Millepachine

Natural chalcone; tubulin/microtubule; anticancer

Millepachine（1.25–20 μM；48 小时）显着减少对顺铂耐药的 A2780CP 细胞的生长[1]。米帕钦 (2–8 μM) 在 24 或 48 小时内诱导顺铂敏感的 A2780S 和顺铂耐药的 A2780CP 细胞凋亡和 G2/M 期停滞[1]。在 A2780S 和 A2780CP 细胞中，millepachine（2–8 μM；24 小时）可降低拓扑异构酶 II 水平[1]。在 A2780CP 细胞中，millepachine（2–8 μM；24 小时）抑制 ATP 结合盒转运蛋白的活性 [1]。

暴露于米勒巴辛（20 mg/kg；每两天静脉注射一次，持续 14 天）的小鼠不会产生肿瘤[1]。在切除的 A2780S 异种移植模型中，米帕欣（20 mg/kg；每两天静脉注射一次，持续 14 天）不会导致获得性耐药性[1]。

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米帕辛（MIL）抑制顺铂耐药A2780CP异种移植物模型中的肿瘤生长[1]
铂类化疗是临床治疗癌症的一线化疗方案。体内检测结果显示，在A2780S异种移植物模型中，5 mg/kg DDP在两次注射后可显著抑制肿瘤生长（p<0.001；图5a），与载体对照治疗相比，它显著降低了肿瘤体积（995.83±160.75 vs.2805.02±354.95 mm3；p<0.001；图5b）和重量（0.965±0.276 vs.3.10±0.152 g；p<0.001；见图5a），抑制率为68.92%。与赋形剂对照组相比，经过七次注射后，Millepachine (MIL)（20mg/kg）也显著降低了肿瘤体积（896.26±226.27mm3；p<0.001）和肿瘤重量（0.832±0.097g；p<0.001）（图5a），抑制率为73.21%，显示出与5mg/kg DDP相当的抗肿瘤活性。

在顺铂耐药A2780CP异种移植物模型中，5mg/kg DDP在两次治疗后对肿瘤生长的抑制作用最小，但20mg/kg的Millepachine (MIL)/米帕辛（MIL）在六次治疗后仍能显著抑制肿瘤生长。与溶媒对照组（3481.94±277.71 mm3）和5 mg/kg DDP治疗组（2452.90±386.52 mm3）的肿瘤体积相比，20 mg/kgMillepachine (MIL)治疗组的肿瘤体积显著减少（1069.09±213.70 mm3；MIL与对照组相比，p<0.001；MIL相对于DDP，p<0.01；图5b）。载体对照组的肿瘤重量为3.448±0.230 g，5 mg/kg DDP治疗组为2.246±0.101 g，20 mg/kg MIL治疗组为1.213±0.094 g（MIL与对照组，p<0.001；MIL与DDP，p<0.001；图5b）。20mg/kg MIL治疗的抑制率为65.58%，与A2780S异种移植模型的抑制率相似，表明MIL在体内对人卵巢癌症具有良好的抗肿瘤活性。

耐药性可能是预先存在的（内在耐药性）或由药物引起的（获得性耐药性；Lippert、Ruoff和Volm，2008）。许多抗癌候选药物遇到了与发展获得性耐药性相关的问题（Hambley&Hait，2009；Heddleston等人，2010）。在这项研究中，我们研究了在切除的A2780S异种移植物模型中，Millepachine (MIL)是否会产生获得性耐药性。在第二轮七次治疗后，与溶媒对照组相比，MIL显著降低了肿瘤体积（895.93±1660.15 vs.2129.51±312.70 mm3；p<0.001）和肿瘤重量（0.85±0.99 vs.2.12±0.15 g；p<0.001；图5c），肿瘤抑制率为60.03%，表明MIL在非连续28天的治疗后（肿瘤生长约1周）没有诱导A2780S肿瘤的获得性耐药性。

此外，与赋形剂对照组相比，用5 mg/kg DDP治疗的BALB/c nu/nu小鼠的体重明显减轻，而不是用20 mg/kg Millepachine (MIL)治疗的小鼠（DDP与对照组，p<0.001；DDP与MIL，p<0.001；图5d）。这些结果表明，20 mg/kg的Millepachine (MIL)在体内比5 mg/kg的DDP具有更高的安全性。

这些结果表明，Millepachine (MIL)是一种高效的体内低毒抗肿瘤候选药物。

细胞增殖测定[1]
细胞类型： A2780CP 细胞
测试浓度： 0、1.25、2.5、5、10、20 μM
孵育时间：48小时
实验结果：抑制细胞增殖，IC50为4μM。

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细胞周期分析[1]
细胞类型： A2780S 和 A2780CP 细胞
测试浓度： 2、4、8 μM
孵育持续时间：24 或 48 小时
实验结果：在两种细胞中均诱导显着的 G2/M 停滞。在 A2780S 细胞中，剂量为 2、4 和 8 μM 时，G2/M 部分的细胞百分比从媒介细胞中的 15.99% 增加到 24.93%、60.67% 和 77.31%。

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细胞凋亡分析[1]
细胞类型： A2780S 和 A2780CP 细胞
测试浓度： 2、4、8 μM
孵育时间：24或48小时
实验结果：凋亡细胞百分比从载体细胞中的1.49%分别增加到10.98%、20.60% 。在 A2780S 细胞中，剂量为 2、4 和 8 μM 时，分别为 39.43% 和 39.43%。 A2780CP细胞中凋亡细胞比例分别从0.87%增加至10.97%、25.28%和37.59%。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： A2780S 和 A2780CP 细胞浓度

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细胞增殖试验[1]
将细胞接种在96孔板中并培养过夜。然后，用不同浓度的Millepachine (MIL)或DDP（0、1.25、2.5、5、10和20μM）处理细胞48小时。使用XTT测定细胞存活率。使用Spectramax M5微量滴定板光度计在每个孔中测定450nm处的吸光度。

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流式细胞术[1]
在不同的治疗方式后，用PI对细胞进行染色以分析细胞周期分布，或用流式细胞仪对Annexin V-FITC和PI进行染色以测量凋亡细胞（Annexin V+/PI-）。

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蛋白质印迹[1]
用不同浓度（0、2、4和8μM）的Millepachine (MIL)或DDP（2.5或10μM）处理24小时后，在冰上的细胞裂解缓冲液中裂解细胞。通过Bio-Rad蛋白质测定法测定蛋白质浓度。简而言之，每个样品的30μg通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分级，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在4°C下过夜，用抗拓扑异构酶IIα（TOPO II）、Pgp、MRP1和MRP2（Abcam，UK）的抗体探测蛋白质条带。印迹在室温下在二抗中孵育1小时。蛋白质通过增强化学发光进行可视化。

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免疫荧光成像[1]
细胞在涂有聚赖氨酸的玻璃盖玻片上培养。暴露于不同处理后，细胞用4%甲醛聚合物固定10分钟，随后在4°C下与初级Pgp或MRP2抗体孵育过夜。将第二抗体在室温下孵育1小时。细胞核用Hoechst 33258染色。使用倒置荧光显微镜检测图像。

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罗丹明123染色[1]
A2780CP细胞用不同浓度（0、2、4和8μM）的Millepachine (MIL)或10μM DDP处理24小时。然后，在37°C的黑暗中用Rh123（10μl/1×106个细胞）染色20分钟。使用蓝色激光（488 nm）激发的荧光流式细胞仪分析细胞荧光。在530±20nm处测量绿色荧光。

动物/疾病模型：将A2780S或A2780CP细胞注射到6周龄雌性BALB/c裸鼠体内[1]。
剂量：20 mg/kg。
给药途径：每两天静脉注射一次，持续2-14天。
实验结果：在A2780S（注射7次后）和A2780CP（注射6次后）异种移植瘤模型中，肿瘤体积和重量均显著降低，抑制率分别为73.21%和65.58%。体内毒性较低。

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体内肿瘤异种移植[1]
为了确定Millepachine (MIL)在体内克服人卵巢癌顺铂耐药性的效果，将A2780S或A2780CP细胞（5 × 10⁶个细胞溶于100 μl生理盐水中）分别皮下注射到雌性裸鼠（6周龄BALB/c (nu/nu)小鼠）右侧腹部，建立两种人卵巢肿瘤异种移植模型。2周后，肿瘤生长至约1000 mm³，无菌分离肿瘤组织，并将2-3 mm³大小的肿瘤组织块通过套管针皮下移植到小鼠体内。当肿瘤体积达到100 mm³（约培养一周）时，将小鼠随机分为三组：（a）对照组（n = 6）：每2天注射100 μl生理盐水； (b) MIL 治疗组 (n = 6)：小鼠每 2 天静脉注射 (iv) 20 mg/kg MIL；(c) DDP 治疗组 (n = 6)：小鼠每 5 天腹腔注射 (ip) 5 mg/kg DDP。每 2 天用游标卡尺测量小鼠的肿瘤负荷（计算体积 [mm³] = π/6 × 长 × 宽 × 厚）。
我们还构建了切除的 A2780S 异种移植瘤模型，以研究 Millepachine (MIL) 对获得性耐药肿瘤的抗肿瘤作用。在用 20 mg/kg MIL 治疗 14 天后，当肿瘤生长至 800 mm³ 时，我们从裸鼠体内切除 A2780S 肿瘤，将其切成小块 (2–3 mm³)，然后重新移植到裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到 100 mm3（大约培养一周）时，开始第二轮治疗，每 2 天静脉注射 20 mg/kg MIL。

[1]. Millepachine showed novel antitumor effects in cisplatin-resistant human ovarian cancer through inhibiting drug efflux function of ATP-binding cassette transporters. Phytother Res. 2018 Dec; 32(12):2428-2435.

千叶木酚素（MIL）是一种源自中药千叶木酚素（Millettia pachycarpa Benth）的生物活性天然查尔酮，在体外和体内均对多种人类癌细胞表现出显著的抗肿瘤活性。本研究发现，MIL可通过诱导明显的G2/M期阻滞和细胞凋亡，并下调拓扑异构酶II的活性，显著抑制顺铂耐药A2780CP细胞的增殖。我们进一步发现，MIL在顺铂耐药人卵巢癌中发挥良好抗肿瘤作用的机制与其抑制顺铂耐药A2780CP细胞中ATP结合盒转运蛋白的表达有关。重要的是，MIL不仅在顺铂敏感的A2780S异种移植瘤模型中显著抑制了肿瘤生长（抑制率达73.21%），而且在顺铂耐药的A2780CP异种移植瘤模型中也抑制了肿瘤生长（抑制率达65.68%）（与对照组相比，p < 0.001；与DDP组相比，p < 0.001）。此外，MIL在A2780S荷瘤小鼠中未诱导获得性耐药，抑制率为60.03%。这些令人鼓舞的体外和体内实验结果表明，MIL在药物研发方面具有潜在的应用价值。[1]顺铂（DDP）是一种经典的抗癌化疗药物，广泛用于治疗多种实体瘤（Florea & Büsselberg, 2011），其作用机制是通过靶向DNA诱导DNA损伤（Basu & Krishnamurthy, 2010; Loehrer & Einhorn, 1984）。然而，其在癌症治疗中的疗效常常受到毒副作用和肿瘤耐药性的限制（Loehrer & Einhorn, 1984; Stordal, Pavlakis, & Davey, 2007）。MIL是一种天然查尔酮，也能通过抑制TOPO II活性来诱导DNA损伤，从而对抗多种肿瘤细胞（Wu et al., 2016）。本研究表明，MIL不仅对人卵巢癌和顺铂耐药的人卵巢癌表现出比DDP更好的抗肿瘤活性，而且在体内也显示出更好的安全性（图5）。此外，MIL并未在A2780S肿瘤中诱导获得性耐药性（图5c）。这些结果表明，MIL具有作为新型抗癌候选药物的巨大开发潜力。
我们还探讨了MIL抑制顺铂耐药人卵巢癌细胞增殖的机制。顺铂耐药肿瘤细胞最常见的特征是细胞内顺铂（DDP）积累减少（Gately & Howell, 1993; Loh, Mistry, Kelland, Abel, & Harrap, 1992）。ABC转运蛋白是现存所有生物（从原核生物到人类）中最大、最古老的膜蛋白家族之一，它们主要利用ATP水解产生的能量将有毒化合物和其他各种底物转运过膜（Gottesman et al., 2002; Kathawala et al., 2015; Li et al., 2016）。 Pgp和MRP家族蛋白作为两种重要的ABC转运蛋白，在某些肿瘤中表达，从而赋予肿瘤细胞化疗耐药性（Dean, Fojo, & Bates, 2005; Szakács et al., 2006）。一些研究报道，在多种顺铂耐药癌细胞中ABC转运蛋白过表达，表明ABC转运蛋白与顺铂耐药性密切相关（Sun et al., 2016; Tang et al., 2014; Tonigold et al., 2014; Yamasaki et al., 2011）。在本研究中，我们发现顺铂耐药的A2780CP细胞中Pgp、MRP1和MRP2蛋白的表达水平较高（图4a）。然而，MIL处理降低了顺铂耐药的A2780CP细胞中Pgp、MRP1和MRP2蛋白的表达水平（图4）。 ABC转运蛋白的过度表达是多药耐药（MDR）的主要机制，也是癌症化疗失败的关键决定因素（Gottesman等，2002；Szakács等，2006）。MIL对ABC转运蛋白活性的抑制表明，MIL具有逆转肿瘤细胞MDR的潜力。[1]

C22H22O4

350.41

350.151

1393922-01-4

66573474

Light yellow to yellow solid powder

1.139±0.06 g/cm3(Predicted)

528.2±50.0 °C(Predicted)

4.6

44.8

0

4

5

26

542

0

CC1(C=CC2=C(C=CC(=C2O1)C(=O)/C=C/C3=CC=C(C=C3)OC)OC)C

GZUOKKIDYHPTAZ-YRNVUSSQSA-N

InChI=1S/C22H22O4/c1-22(2)14-13-18-20(25-4)12-10-17(21(18)26-22)19(23)11-7-15-5-8-16(24-3)9-6-15/h5-14H,1-4H3/b11-7+

(E)-1-(5-methoxy-2,2-dimethylchromen-8-yl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one

Millepachine; 1393922-01-4; (E)-1-(5-methoxy-2,2-dimethylchromen-8-yl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one; (E)-1-(5-Methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one; 1-(5-Methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one; 1579976-20-7; CHEMBL2041121; SCHEMBL16697961;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 100 mg/mL (285.38 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (7.13 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.13 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。