Millepachine

Natural chalcone; tubulin/microtubule; anticancer
Tubulin (colchicine-binding site).

Millepachine（1.25–20 μM；48 小时）可显著抑制顺铂耐药的 A2780CP 细胞的生长[1]。Millepachine（2–8 μM）可在 24 或 48 小时内诱导顺铂敏感的 A2780S 细胞和顺铂耐药的 A2780CP 细胞发生凋亡和 G2/M 期阻滞[1]。在 A2780S 和 A2780CP 细胞中，Millepachine（2–8 μM；24 小时）可降低拓扑异构酶 II 的水平[1]。在 A2780CP 细胞中，Millepachine（2–8 μM；24 小时）可抑制 ATP 结合盒转运蛋白的活性[1]。

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Millepachine（2-8 uM，24 小时）抑制 ATP 结合盒转运蛋白，通过抑制微管蛋白聚合诱导细胞周期停滞于 G2/M 期；它阻止有丝分裂纺锤体的形成，并通过活性氧（ROS）积累和线粒体膜电位崩溃诱导细胞凋亡；它克服了癌症模型中的多药耐药性。

小鼠接受米勒帕辛（MIL）（20 mg/kg；每两天静脉注射一次，持续14天）治疗后未发生肿瘤[1]。在切除的A2780S异种移植瘤模型中，米勒帕辛（20 mg/kg；每两天静脉注射一次，持续14天）未导致获得性耐药[1]。米勒帕辛（MIL）抑制了顺铂耐药的A2780CP异种移植瘤模型中的肿瘤生长[1]。铂类化疗是人类卵巢癌临床治疗的一线化疗方案。体内试验结果显示，5 mg/kg DDP 在两次注射后可显著抑制 A2780S 异种移植模型中的肿瘤生长（p < 0.001；图 5a），与载体对照治疗相比，显著降低了肿瘤体积（995.83 ± 160.75 vs. 2805.02 ± 354.95 mm3；p < 0.001；图 5a）和重量（0.965 ± 0.276 vs. 3.10 ± 0.152 g；p < 0.001；图 5a），抑制率为 68.92%。与载体对照组相比，注射七次后，米勒帕因（MIL）（20 mg/kg）也显著降低了肿瘤体积（896.26 ± 226.27 mm3；p < 0.001）和肿瘤重量（0.832 ± 0.097 g；p < 0.001）（图 5a），抑制率为 73.21%，表现出与 5 mg/kg DDP 相当的抗肿瘤活性。

在顺铂耐药的 A2780CP 异种移植瘤模型中，5 mg/kg DDP 治疗两次后对肿瘤生长的抑制作用甚微，而 20 mg/kg 米勒帕因（MIL）治疗六次后仍能显著抑制肿瘤生长。与载体对照组（3481.94 ± 277.71 mm3）和 5 mg/kg DDP 治疗组（2452.90 ± 386.52 mm3）的肿瘤体积相比，20 mg/kg Millepachine (MIL) 治疗组的肿瘤体积显著减少（1069.09 ± 213.70 mm3；MIL 与对照组比较，p < 0.001；MIL 与 DDP 比较，p < 0.01；图 5b）。载体对照组肿瘤重量为 3.448 ± 0.230 g，5 mg/kg DDP 治疗组为 2.246 ± 0.101 g，20 mg/kg MIL 治疗组为 1.213 ± 0.094 g（MIL 与对照组比较，p < 0.001；MIL 与 DDP 组比较，p < 0.001；图 5b）。20 mg/kg MIL 治疗的抑制率为 65.58%，与 A2780S 异种移植模型中的结果相似，表明 MIL 在体内对顺铂敏感和顺铂耐药的人卵巢癌均具有良好的抗肿瘤活性。

耐药性可能是预先存在的（固有耐药性），也可能是药物诱导产生的（获得性耐药性；Lippert、Ruoff 和 Volm，2008）。许多抗癌候选药物都会遇到与发育过程中获得的耐药性相关的问题（Hambley & Hait，2009；Heddleston 等，2010）。在本研究中，我们研究了Millepachine (MIL)在切除的 A2780S 异种移植模型中是否会产生获得性耐药性。在第二轮共七次治疗后，MIL 显著降低了肿瘤体积（895.93 ± 1660.15 vs. 2129.51 ± 312.70 mm3；p < 0.001）和肿瘤重量（0.85 ± 0.99 vs. 2.12 ± 0.15 g；p < 0.001；图 5c），肿瘤抑制率为 60.03%，与载体对照组相比，表明 MIL 在非连续 28 天治疗后（约 1 周的停药期，以利于肿瘤生长）并未诱导 A2780S 肿瘤产生获得性耐药性。

此外，与载体对照组相比，接受 5 mg/kg DDP 治疗的 BALB/c nu/nu 小鼠（而非接受 20 mg/kg Millepachine (MIL) 治疗的小鼠）体重明显降低（DDP 组 vs. 对照组，p < 0.001）。 0.001；DDP 与 MIL 相比，p < 0.001；图 5d）。这些结果表明，20 mg/kg 的 Millepachine (MIL) 在体内比 5 mg/kg 的 DDP 具有更高的安全性。

这些结果提示 Millepachine (MIL) 是一种高效且体内毒性低的候选抗肿瘤药物。

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在异种移植小鼠模型（A2780S 和 A2780CP 卵巢癌）中，米勒帕辛（20 mg/kg；每两天静脉注射一次，持续 14 天）可降低肿瘤体积和重量，抑制率分别为 73.21% 和 65.58%；在切除的 A2780S 异种移植模型中，它不会诱导获得性耐药性。

使用纯化的牛脑微管蛋白评估与微管蛋白秋水仙碱位点的结合；将化合物与微管蛋白在 37°C 下孵育，并通过 350 nm 处的浊度监测聚合；秋水仙碱竞争性结合试验测量 3H-秋水仙碱从微管蛋白上的置换。

细胞增殖实验[1]
细胞类型： A2780CP 细胞
测试浓度： 0、1.25、2.5、5、10、20 μM
孵育时间： 48 小时
实验结果： IC50 为 4 μM，可抑制细胞增殖。

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细胞周期分析[1]
细胞类型： A2780S 和 A2780CP 细胞
测试浓度： 2、4、8 μM
孵育时间： 24 或 48 小时
实验结果： 可显著诱导两种细胞的 G2/M 期阻滞。在A2780S细胞中，G2/M期细胞比例从载体对照组的15.99%分别增加到24.93%、60.67%和77.31%（剂量分别为2、4和8 μM）。

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细胞凋亡分析[1]
细胞类型： A2780S和A2780CP细胞
测试浓度： 2、4、8 μM
孵育时间： 24或48小时
实验结果： 凋亡细胞比例从载体对照组的1.49%分别增加到10.98%和20.60%。在A2780S细胞中，浓度分别为2、4和8 μM时，凋亡细胞比例分别为39.43%。在A2780CP细胞中，凋亡细胞比例分别从0.87%增加到10.97%、25.28%和37.59%。

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Western Blot分析[1]
细胞类型： A2780S和A2780CP细胞浓度

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细胞增殖实验[1]
将细胞接种于96孔板中，培养过夜。然后，用不同浓度的米勒帕因（MIL）或顺铂（DDP）（0、1.25、2.5、5、10和20 μM）处理细胞48小时。使用XTT法测定细胞活力。使用 Spectramax M5 微孔板发光仪测定每个孔在 450 nm 处的吸光度。

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流式细胞术[1]
经不同处理后，用 PI 染色细胞以分析细胞周期分布，或用 Annexin V-FITC 和 PI 双染细胞以检测凋亡细胞（Annexin V+/PI−），并使用流式细胞仪进行分析。

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蛋白质印迹法[1]
用不同浓度（0、2、4 和 8 μM）的 Millepachine (MIL) 或 DDP（2.5 或 10 μM）处理细胞 24 小时后，在冰上用细胞裂解缓冲液裂解细胞。使用 Bio-Rad 蛋白质测定法测定蛋白质浓度。简而言之，将 30 μg 样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离，然后转移至聚偏二氟乙烯膜上。将蛋白条带与针对拓扑异构酶IIα (TOPO II)、Pgp、MRP1 和 MRP2 的抗体（Abcam，英国）于 4°C 孵育过夜。印迹在室温下与二抗孵育 1 小时。使用增强化学发光法显色。

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免疫荧光成像[1]
将细胞培养在聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上。经不同处理后，用 4% 甲醛聚合物固定细胞 10 分钟，随后与 Pgp 或 MRP2 一抗于 4°C 孵育过夜。二抗在室温下孵育 1 小时。用 Hoechst 33258 对细胞核进行染色。使用倒置荧光显微镜检测图像。

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罗丹明123染色[1]
将A2780CP细胞用不同浓度（0、2、4和8 μM）的米勒帕辛（MIL）或10 μM的顺铂（DDP）处理24小时。然后，将细胞用罗丹明123（10 μl/1 × 10⁶个细胞）在37°C避光孵育20分钟。使用流式细胞仪分析细胞荧光，激发光源为蓝光激光（488 nm）。绿色荧光强度在530 ± 20 nm处测定。

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在 RPMI 或 DMEM 培养基中培养的各种癌细胞系（例如 U2OS、MG-63、A2780、LNCaP）中评估抗增殖作用；用不同稀释度的 millepachine 处理细胞 48-72 小时；通过 MTT 或 SRB 试验测量细胞活力；计算 IC50 值；通过流式细胞术分析细胞周期和凋亡。

动物/疾病模型：将A2780S或A2780CP细胞注射到6周龄雌性BALB/c裸鼠体内[1]。
剂量：20 mg/kg。
给药途径：每两天静脉注射一次，持续2-14天。
实验结果：在A2780S（注射7次后）和A2780CP（注射6次后）异种移植瘤模型中，肿瘤体积和重量均显著降低，抑制率分别为73.21%和65.58%。体内毒性较低。

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体内肿瘤异种移植[1]
为了确定Millepachine (MIL)在体内克服人卵巢癌顺铂耐药性的效果，将A2780S或A2780CP细胞（5 × 10⁶个细胞溶于100 μl生理盐水中）分别皮下注射到雌性裸鼠（6周龄BALB/c (nu/nu)小鼠）右侧腹部，建立两种人卵巢肿瘤异种移植模型。2周后，肿瘤生长至约1000 mm³，无菌分离肿瘤组织，并将2-3 mm³大小的肿瘤组织块通过套管针皮下移植到小鼠体内。当肿瘤体积达到100 mm³（约培养一周）时，将小鼠随机分为三组：（a）对照组（n = 6）：每2天注射100 μl生理盐水； (b) MIL 治疗组 (n = 6)：小鼠每 2 天静脉注射 (iv) 20 mg/kg MIL；(c) DDP 治疗组 (n = 6)：小鼠每 5 天腹腔注射 (ip) 5 mg/kg DDP。每 2 天用游标卡尺测量小鼠的肿瘤负荷（计算体积 [mm³] = π/6 × 长 × 宽 × 厚）。
我们还构建了切除的 A2780S 异种移植瘤模型，以研究 Millepachine (MIL) 对获得性耐药肿瘤的抗肿瘤作用。在用 20 mg/kg MIL 治疗 14 天后，当肿瘤生长至 800 mm³ 时，我们从裸鼠体内切除 A2780S 肿瘤，将其切成小块 (2–3 mm³)，然后重新移植到裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到 100 mm3（大约培养一周）时，开始第二轮治疗，每 2 天静脉注射 20 mg/kg MIL。

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小鼠异种移植模型：将癌细胞（例如 A2780S 或 A2780CP）皮下注射到裸鼠体内；当肿瘤达到约 100 mm3 时，每两天静脉注射一次 millepachine（20 mg/kg），持续两周；每周测量两次肿瘤体积和体重；在终点切除肿瘤并称重。

PK 特性尚未完全详细；初步研究表明，米勒帕辛具有良好的 Caco-2 渗透性和亲脂性；需要进一步的 ADME 研究来确定半衰期、血浆清除率、生物利用度和组织分布。

毒性：尚未完全描述其全面的毒理学特征；临床前开发需要对小鼠进行急性毒性研究；作为一种天然产物，它有传统的使用历史，但正式的毒性评估有限。

[1]. Millepachine showed novel antitumor effects in cisplatin-resistant human ovarian cancer through inhibiting drug efflux function of ATP-binding cassette transporters. Phytother Res. 2018 Dec; 32(12):2428-2435.

千叶木（Millepachine pachycarpa Benth，简称MIL）是一种源自传统中药千叶木的天然活性查尔酮，在体外和体内均表现出对多种人类癌细胞的显著抗肿瘤活性。本研究发现，MIL通过诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡，以及下调拓扑异构酶II活性，显著抑制了顺铂耐药A2780CP细胞的增殖。我们进一步发现，MIL发挥其在顺铂耐药人卵巢癌中的抗肿瘤作用的机制与其抑制顺铂耐药A2780CP细胞中ATP结合盒转运蛋白的表达有关。重要的是，MIL显著抑制了顺铂敏感型A2780S异种移植瘤模型的肿瘤生长（抑制率为73.21%），也抑制了顺铂耐药型A2780CP异种移植瘤模型的肿瘤生长（抑制率为65.68%）（与对照组相比p < 0.001；与DDP组相比p < 0.001）。此外，MIL未在荷瘤小鼠（A2780S）中诱导获得性耐药，抑制率为60.03%。这些令人鼓舞的体外和体内实验结果表明，MIL在药物研发中具有潜在的应用价值。[1] 顺铂（DDP）是一种经典的抗癌化疗药物，广泛用于治疗多种实体瘤（Florea & Büsselberg, 2011）。其作用机制是通过靶向DNA诱导DNA损伤（Basu & Krishnamurthy, 2010; Loehrer & Einhorn, 1984）。然而，其在癌症治疗中的疗效常受限于毒副作用和肿瘤耐药性（Loehrer & Einhorn, 1984; Stordal, Pavlakis, & Davey, 2007）。MIL是一种天然查尔酮，也能通过抑制TOPO II活性诱导DNA损伤，从而对抗多种肿瘤细胞（Wu et al., 2016）。本研究表明，MIL不仅对人卵巢癌和顺铂耐药的人卵巢癌表现出比DDP更好的抗肿瘤活性，而且在体内也表现出更好的安全性（图5）。此外，MIL不会在A2780S肿瘤中诱导获得性耐药（图5c）。这些结果表明，MIL具有作为新型抗癌候选药物的巨大开发潜力。我们还探讨了MIL抑制顺铂耐药人卵巢癌细胞增殖的机制。顺铂耐药肿瘤细胞最常见的特征是细胞内顺铂（DDP）积累减少（Gately & Howell, 1993; Loh, Mistry, Kelland, Abel, & Harrap, 1992）。ABC转运蛋白是所有生物体（从原核生物到人类）中最大、最古老的膜蛋白家族之一。它们主要利用ATP水解产生的能量，将有毒化合物和其他各种底物跨膜转运（Gottesman et al., 2002; Kathawala et al., 2015; Li et al., 2016）。 Pgp和MRP家族蛋白作为两种重要的ABC转运蛋白，在某些肿瘤中表达，从而赋予肿瘤细胞化疗耐药性（Dean, Fojo, & Bates, 2005; Szakács et al., 2006）。一些研究报道，多种顺铂耐药癌细胞中存在ABC转运蛋白的过表达，表明ABC转运蛋白与顺铂耐药密切相关（Sun et al., 2016; Tang et al., 2014; Tonigold et al., 2014; Yamasaki et al., 2011）。在本研究中，我们发现Pgp、MRP1和MRP2蛋白在顺铂耐药的A2780CP细胞中表达水平较高（图4a）。然而，MIL处理降低了顺铂耐药A2780CP细胞中Pgp、MRP1和MRP2蛋白的表达水平（图4）。ABC转运蛋白的过度表达是多药耐药（MDR）的主要机制，也是癌症化疗失败的关键决定因素（Gottesman等，2002；Szakács等，2006）。MIL对ABC转运蛋白活性的抑制表明，MIL具有逆转肿瘤细胞MDR的潜力。[1]

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Millepachine 是一种源自传统中药的研究化合物；它尚未获得 FDA 或 EMA 的临床使用批准；也没有注册临床试验；它是一种用于开发新型微管蛋白抑制剂的先导化合物，特别是用于克服癌症中的多药耐药性。

C22H22O4

350.41

350.151

1393922-01-4

66573474

Light yellow to yellow solid powder

1.139±0.06 g/cm3(Predicted)

528.2±50.0 °C(Predicted)

4.6

44.8

0

4

5

26

542

0

CC1(C=CC2=C(C=CC(=C2O1)C(=O)/C=C/C3=CC=C(C=C3)OC)OC)C

GZUOKKIDYHPTAZ-YRNVUSSQSA-N

InChI=1S/C22H22O4/c1-22(2)14-13-18-20(25-4)12-10-17(21(18)26-22)19(23)11-7-15-5-8-16(24-3)9-6-15/h5-14H,1-4H3/b11-7+

(E)-1-(5-methoxy-2,2-dimethylchromen-8-yl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one

Millepachine; 1393922-01-4; (E)-1-(5-methoxy-2,2-dimethylchromen-8-yl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one; (E)-1-(5-Methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one; 1-(5-Methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one; 1579976-20-7; CHEMBL2041121; SCHEMBL16697961;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 100 mg/mL (285.38 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (7.13 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.13 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。