IGF-IR (IC50 = 0.15 ±0.036 μM); InsR (IC50 = 0.14±0.039 μM); Flt-3 (IC50 = 0.42±0.11 μM); PDGFR (IC50 = 2±0.61 μM); c-Src (IC50 = 2.4±0.38 μM); c-Kit (IC50 = 3.3±1.4 μM)
Insulin-like growth factor I receptor (IGF-IR) [2]

NVP-AEW541 对重组 InsR 激酶结构域具有相同的效力，并且能够抑制重组 IGF-IR 激酶结构域的体外激酶活性，IC50 值为 0.15 μM。在细胞水平上，NVP-AEW541 表现出选择性，并被证实对 IGF-IR 激酶具有活性（IC50=86 nM）。与结构相关的天然 InsR（IC50=2.3 μM）相比，NVP-AEW541 对天然 IGF-IR 的效力高出 27 倍。 NVP-AEW541 的 IC50 值分别为 0.162 μM、0.105 μM 和 1.64 μM，可抑制 IGF-I 介导的 MCF-7 细胞存活、软琼脂形成和增殖[1]。

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在一组 10 种 IGF-IR 表达阳性的神经母细胞瘤细胞系中，NVP-AEW541 在亚微摩尔/微摩尔浓度范围内抑制体外增殖（IC50 值：GI-CA-N 6.80 μM，SH-EP 3.00 μM，HTLA-230 0.50 μM，SK-N-BE2c 1.10 μM，SK-N-BE 2 3.00 μM，SY-SY (N) 2.40 μM，LAN-5 0.40 μM，KCNR 0.40 μM， RN-GA 1.30 μM，SK-N-AS 2.80 μM）。[2]
NVP-AEW541抑制IGF-II介导的IGF-IR和Akt的激活。细胞在无血清培养基中培养18小时后，用重组IGF-II（100 ng/mL）处理10分钟，处理前或不进行NVP-AEW541预处理2小时，NVP-AEW541的浓度比各细胞系的IC50高20%。预处理显著降低了IGF-IR的磷酸化水平，并导致所有测试细胞系中Akt磷酸化水平的降低，但对Erk1和Erk2的磷酸化水平没有影响。[2]
NVP-AEW541在体外诱导细胞凋亡。用NVP-AEW541处理的神经母细胞瘤细胞出现核固缩和膜起泡。流式细胞术分析显示，所有受试细胞系中低二倍体细胞比例均增加（例如，KCNR：未处理组1.14%，处理72小时后3.18%；GI-CA-N：未处理组0.71%，处理72小时后4.92%；SK-N-BE2c：未处理组2.62%，处理72小时后26.73%；SY-SY(N)：未处理组4.85%，处理72小时后46.17%），且与S期和G2/M期细胞比例的降低同步发生。部分细胞系（GI-CA-N、HTLA-230和KCNR）还检测到G0/G1期阻滞。 [2]
NVP-AEW541 处理诱导 caspase-3/7 活化（相对发光单位，RLU：KCNR 未处理 563 ± 23，处理 1,347 ± 31；GI-CA-N 未处理 264 ± 13，处理 53,266 ± 1,173；HTLA-230 未处理 363 ± 24，处理 545 ± 16；SK-N-BE2c 未处理 698 ± 3，处理 1,007 ± 29；SY-SY (N) 未处理 504 ± 30，处理 19,152 ± 1,273）。 [2]
NVP-AEW541抑制了神经母细胞瘤细胞在半固体琼脂中形成克隆的能力（例如，KCNR：0.5 μM 抑制率 42.6%，p 值无统计学意义；GI-CA-N：0.5 μM 抑制率 58.8%，p<0.01；HTLA-230：0.5 μM 抑制率 96.2%，p<0.001；SK-N-BE2c：0.5 μM 抑制率 38.8%，p<0.001；SY-5Y(N)：0.5 μM 抑制率 27.7%，p<0.05）。[2]
定量实时 PCR 检测显示，体外实验中，NVP-AEW541 可显著下调血管内皮生长因子 (VEGF) 的 mRNA 表达。在 HTLA-230 细胞中，VEGF mRNA 的相对表达量降低至未处理对照组的约 25% (p<0.001)。在 SK-N-BE2c 细胞中，VEGF mRNA 的相对表达量降低至未处理对照组的约 40-45% (p<0.01 和 p<0.001)。 [2]
NVP-AEW541显著降低了所有测试细胞系在Matrigel包被小室中的侵袭能力（例如，KCNR：未处理组侵袭率约为100%，0.5 μM处理组约为70%，2.0 μM处理组约为40%，8.0 μM处理组约为10%；GI-CA-N：未处理组侵袭率约为100%，0.5 μM处理组约为60%，2.0 μM处理组约为20%，8.0 μM处理组约为10%；HTLA-230：未处理组侵袭率约为100%，0.5 μM处理组约为90%，2.0 μM处理组约为60%，8.0 μM处理组约为20%）。[2]

口服给予NVP-AEW541（20、30或50 mg/kg）可使NWT-21肿瘤异种移植模型失去其基础受体和IGF-I诱导的受体，并抑制PKB和MAPK的磷酸化[1]。采用灌胃法，将NVP-AEW541以50 mg/kg的剂量溶于0.2 mL 25 mM L-(+)-酒石酸溶液中，每日两次，连续14天。对照组给予相同剂量的0.2 mL载体溶液[25 mM L-(+)-酒石酸]，每日两次。每周测量三次肿瘤体积和动物体重，直至疗程结束。在动物处死后，收集肿瘤组织，用福尔马林固定，并进行组织学和免疫组织化学分析。 NVP-AEW541治疗引起的组织收缩在两种情况下均达到统计学意义（HTLA-230 和 SK-N-BE2c 分别为 P=0.0156 和 P=0.0111）[2]。

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口服NVP-AEW541（50 mg/kg，每日两次）可抑制裸鼠神经母细胞瘤异种移植瘤（HTLA-230 和 SK-N-BE2c）的生长。治疗组动物的肿瘤体积显著小于对照组（HTLA-230：P = 0.0156；SK-N-BE2c：P = 0.0111）。 [2]
对经NVP-AEW541治疗的动物肿瘤进行分析发现，与对照组（细胞密度高且微血管网络丰富）相比，肿瘤细胞凋亡模式显著（大量固缩细胞，且微核频繁出现），微血管化程度降低（微血管稀少或缺失）。[2]
使用磷酸化IGF-IR特异性抗体进行的免疫组织化学分析显示，对照组肿瘤中存在强烈的膜相关染色，而经NVP-AEW541治疗的动物肿瘤则大多呈阴性（表明IGF-IR磷酸化受到强烈抑制）。 [2]
对经NVP-AEW541治疗的肿瘤（SK-N-BE2c异种移植瘤）的RNA进行定量实时PCR分析显示，与对照组相比，VEGF mRNA的含量显著降低（VEGF mRNA的相对表达量降低至未治疗对照组的约15%，p<0.001）。[2]
在假转移模型（SCID小鼠尾静脉注射HTLA-230细胞）中，与对照组相比，NVP-AEW541（50 mg/kg，每日两次，持续14天）显著降低了靶器官（肾上腺、肾脏、肝脏和肺）中的肿瘤细胞负荷。在治疗组动物中，肾上腺和肾脏的受累面积明显减少。治疗组动物的转移灶数量和大小也显著减少。[2]

将[γ³³P]ATP (1000 Ci/mmol)中的³³P掺入合适的底物中，用于测定在有或无抑制剂存在下蛋白激酶的活性。蛋白激酶活性测定在96孔板中于室温(RT)下进行，具体参数如下。测定结束时加入20 μL 125 mM EDTA。然后将反应混合物转移至预先用甲醇浸泡5分钟、用水冲洗、再用0.5% H₃PO₄浸泡5分钟的Immobilon-PVDF膜上，最后将膜置于真空歧管上，c-Abl、c-Src和IGF-1R的测定体积为30 μL，其他所有激酶的测定体积为40 μL。所有样品点样完毕后，连接真空泵，并用200 μL 0.5% H₃PO₄溶液冲洗每个孔。取出膜片，再次用乙醇清洗后，在1% H₃PO₄溶液中振荡4次。干燥后计数膜片，将其安装到Packard TopCount 96孔板中，并在每个孔中加入10 μL Microscint显色剂。对每种化合物在四个不同浓度（通常为0.01、0.1、1和10 μM）下重复测定的抑制率进行线性回归分析，即可确定IC₅₀值。一个单位的蛋白激酶活性定义为在37℃下，每分钟每毫克蛋白质从[γ-³³P]ATP转移到底物蛋白上的1纳摩尔³³P[1]。体外激酶活性测定采用纯化的重组激酶结构域或纯化的激酶和合成肽底物进行。化合物溶解于DMSO（10 mM），并用DMSO/水（1:1）新鲜配制稀释液。酶活性测定中DMSO的最终浓度<0.5%。激酶活性测定通过测量96孔板中[γ-³³P]ATP向相应底物中掺入³³P的量来进行。反应通过加入EDTA终止。取一定量的反应混合物转移至预先用甲醇浸泡的PVDF膜上，用水冲洗，然后用0.5% H₃PO₄浸泡。洗涤后，将膜干燥并计数。IC50 值通过对四个浓度（通常为 0.01、0.1、1 和 10 μM）下的抑制百分比进行线性回归分析计算得出。[1]
对于特定激酶：PKC-α 在含有 Tris-HCl、Mg(NO3)2、硫酸鱼精蛋白、ATP 和 [γ-33P]ATP 的缓冲液中进行测定。Cdk1/cycB 以组蛋白 H1 为底物，在含有 β-甘油磷酸钠、硝基苯磷酸钠、MOPS、EGTA、MgCl2、DTT、Na3VO4、ATP 和 [γ-33P]ATP 的缓冲液中进行测定。PKA 以 Kemptide 为肽底物，在含有 MES-NaOH、Mg(OAc)2、NaCl、ATP、BSA 和 [γ-33P]ATP 的缓冲液中进行测定。以His标签的IκB为底物检测c-Raf-1的活性。以poly-AEKY或poly(Glu,Tyr)为底物检测c-Abl和c-Src的活性。IGF-IR和Ins-R激酶活性检测使用以GST融合蛋白形式表达的胞质结构域，并以poly(Glu,Tyr)为底物。KDR、Fit-1、Tek、PDGFR-β、FGFR-1、c-Kit、c-Met、Flt-3和Flt-4激酶活性检测使用其胞质结构域的GST融合蛋白，以poly(Glu,Tyr)为底物，在含有Tris-HCl、MnCl2、MgCl2、DTT、Na3VO4和ATP的缓冲液中进行。[1]

在96孔板中，每孔接种3000-6000个细胞，每孔加入100 μL培养基。24小时后，以递增浓度加入化合物，每个浓度设置四个复孔。72小时后，加入25 μL/孔的20%戊二醛固定细胞，室温静置10分钟。用200 μL/孔的水洗涤两次后，加入100 μL 0.05%的亚甲蓝溶液。室温孵育10分钟后，用200 μL/孔的水洗涤三次。加入200 μL/孔的3%盐酸，室温下在摇床上孵育30分钟后，测量650 nm处的吸光度[1]。

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细胞生长情况通过在完全培养基中以三复孔接种细胞进行评估。 18 小时后，加入新鲜培养基或含有 NVP-AEW541（0.5、2.0 和 8.0 μmol/L）的培养基。72 小时后进行细胞计数。IC50 值通过回归分析计算。[2]
在半固体琼脂中评估非锚定依赖性生长。加入基础琼脂（0.5% 琼脂、1× RPMI 1640 和 10% FCS）并使其凝固。加入等体积的含有 10^3 个细胞/cm^2 的细胞的顶层琼脂（0.35% 琼脂、1× RPMI 1640 和 10% FCS）。根据需要添加 NVP-AEW541（0.5、2.0 和 8.0 μmol/L）。培养 11 天后，用结晶紫染色。对单个细胞（≤20 个细胞）和克隆（>20 个细胞）进行计数。[2]
使用碘化丙啶 (50 μg/mL) 染色，然后进行流式细胞术分析，以进行细胞周期分析和亚二倍体峰的评估。将细胞用浓度为各细胞系计算 IC50 值 20% 的 NVP-AEW541 处理 24、48 和 72 小时。[2]
使用基于检测 caspase 裂解后 caspase-3/7 发光底物的发光法测定 caspase-3 和 caspase-7 的活性。将 1.5 × 10^4 个细胞接种于含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养基中。根据需要添加浓度为各细胞系计算 IC50 值 20% 的 NVP-AEW541。 [2]
蛋白质分析中，提取细胞蛋白，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并进行Western blot分析。所用抗体包括抗IGFIRβ、抗磷酸化IGF-IR（Tyr1131）/胰岛素受体（Tyr1146）、抗Akt、抗磷酸化Akt（Ser473）、抗p44/42 MAPK、抗磷酸化p44/42 MAPK（Thr202/Tyr204）、抗裂解型caspase-9（Asp315；人特异性）、抗Bim、抗Bax和抗β-肌动蛋白。为了检测IGF-II介导的激活，细胞在无血清培养基中培养18小时，然后用重组IGF-II（100 ng/mL）处理10分钟，处理前或不进行NVP-AEW541预处理（NVP-AEW541浓度比IC50高20%）。[2] 对于实时定量PCR，提取总RNA并去除DNA污染物。取500 ng RNA进行逆转录。使用TAQMAN技术和人VEGF的Assays-On-Demand试剂盒进行实时定量PCR。使用TAQMAN预先开发的用于人β-actin的试剂盒进行标准化。所有反应均在两个独立的实验中进行，每个反应重复三次。 [2]
在侵袭实验中，细胞先用不同浓度（0.5、2.0 和 8.0 μmol/L）的 NVP-AEW541 预处理 18 小时，然后重新接种于 Matrigel 包被的侵袭小室中。24 小时后，计数迁移到小室下部的细胞数量。[2]

小鼠：本研究采用Harlan无胸腺雌性裸鼠。NWT-21细胞培养于DMEM培养基（高糖，4.5 g/L）、10%胎牛血清（FCS）、1% L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠中。首先，每只小鼠右侧腹部皮下注射5×10⁶个细胞。切除体积为500至800 mm³的肿瘤，并将非坏死区域分割成3×3×3 mm的小块，用于体内疗效试验。每只小鼠取一块肿瘤组织，经无菌PBS清洗后，皮下移植至右侧腹部。每周三次测量小鼠体重和肿瘤体积（长×宽×高×π/6）。治疗组（NVP-AEW541）和对照组（仅给予赋形剂）根据治疗第一天（第0天）的分层进行选择（每组8只动物，平均肿瘤体积约为95 mm³）。动物每天口服两次，每周七天，分别给予25 mM L(+)-酒石酸（对照组）或NVP-AEW541（20、30或50 mg/kg；10 mL/kg溶于25 mM L(+)-酒石酸中，治疗组）。抗肿瘤活性以T/C%表示，即治疗组动物肿瘤体积平均增加值除以对照组动物肿瘤体积平均增加值再乘以100。当平均肿瘤体积接近 1500 mm³ 时，实验结束。

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在异种移植研究中，将 2000 万个细胞（HTLA-230 或 SK-N-BE2c）皮下注射到 4 周龄雄性无胸腺裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约 100 mm³（7-10 天）时，每天两次、每周 7 天，通过灌胃法给予动物治疗，分别给予溶于 0.2 mL 25 mmol/L L-(+)-酒石酸溶液中的 NVP-AEW541（50 mg/kg）（治疗组）或 0.2 mL 25 mmol/L L-(+)-酒石酸溶液（对照组）。实验在治疗开始后 14 天结束。每周三次测量肿瘤体积（长 × 宽 × 高 × π/6）和体重。 [2]
在假转移研究中，将 3 × 10^6 个 HTLA-230 细胞经尾静脉注射到 4 周龄的 CB-17/IcrHsd 重症联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠体内。当天开始口服 NVP-AEW541 治疗（治疗组每日两次，每次 50 mg/kg，溶于 0.2 mL 25 mmol/L L-(+)-酒石酸溶液中；对照组每日两次，每次 0.2 mL 25 mmol/L L-(+)-酒石酸溶液中）。治疗持续 14 天。所有动物在首次死亡时（第 35 天）处死。进行尸检以进行宏观评估，并收集器官进行组织学分析。[2]

NVP-AEW541具有口服生物利用度。[1]

在用NVP-AEW541（50 mg/kg，每日两次，持续14天）治疗裸鼠期间，每日监测未观察到全身毒性症状（嗜睡、摄食行为紊乱）。治疗组和未治疗组动物的体重无显著差异。[2]

[1]. In vivo antitumor activity of NVP-AEW541-A novel, potent, and selective inhibitor of the IGF-IR kinase. Cancer Cell. 2004 Mar;5(3):231-9.

[2]. Down-regulation of IGF-1 receptor activity by NVP-AEW541 has an antitumor effect on neuroblastoma cells in vitro and in vivo. Clin Cancer Res. 2006, 12(22), 6772-6780.

神经母细胞瘤是一种对胰岛素样生长因子（IGF）敏感的肿瘤。在神经母细胞瘤的临床前模型中，使用反义表达载体或阻断抗体抑制IGF-II/IGF-IR信号通路已被证明是有效的。然而，在不干扰胰岛素受体的情况下选择性抑制IGF-IR存在困难，这限制了该方法的进一步应用。NVP-AEW541能够区分IGF-IR和胰岛素受体。[2] 对43例神经母细胞瘤原发肿瘤进行IGF-IR表达分析显示，86%的病例（43例中的37例）IGF-IR呈阳性（可检测水平定义为经30个PCR扩增循环后，溴化乙锭染色可见的任何信号）。 [2]
NVP-AEW541治疗可抑制体内IGF-IR的激活，免疫组化结果证实，经治疗动物肿瘤中活性（磷酸化）受体形式显著减少。[2]
该药物的抗肿瘤作用不仅包括抑制细胞生长和刺激细胞凋亡，还包括干扰神经母细胞瘤细胞释放的促血管生成信号（VEGF）。[2]
NVP-AEW541是一种吡咯嘧啶衍生物。体外研究中，该药物溶于DMSO（10 mmol/L）。体内研究中，该药物溶于25 mmol/L L-(+)-酒石酸（5 mg/mL）。[2]

C27H29N5O

439.55

439.237

C, 73.78; H, 6.65; N, 15.93; O, 3.64

475489-16-8

475488-34-7; 475489-16-8 (cis-isomer free base);1618643-96-1 (HCl); 2320261-63-8 (cis-isomer HCl)

11476171

white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

669.0±55.0 °C at 760 mmHg

145℃

358.4±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.710

4.66

69.2

1

5

7

33

632

0

NC1=C2C(N([C@@H]3C[C@@H](C3)CN4CCC4)C=C2C5=CC=CC(OCC6=CC=CC=C6)=C5)=NC=N1

AECDBHGVIIRMOI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H29N5O/c28-26-25-24(21-8-4-9-23(14-21)33-17-19-6-2-1-3-7-19)16-32(27(25)30-18-29-26)22-12-20(13-22)15-31-10-5-11-31/h1-4,6-9,14,16,18,20,22H,5,10-13,15,17H2,(H2,28,29,30)

7-[3-(azetidin-1-ylmethyl)cyclobutyl]-5-(3-phenylmethoxyphenyl)pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine

AEW541 cis-isomer; NVP-AEW541; NVP-AEW 541; NVP-AEW-541; AEW-541; AEW 541; AEW541

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 50~88 mg/mL(113.8~200.2 mM)
Ethanol: ~24 mg/mL (~54.6 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.69 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol: 20 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。