Akt1 (Ki = 0.08 nM); Akt2 (Ki = 2 nM); Akt3 (Ki = 2.6 nM); Akt1 E17K mutant (IC50 = 0.2 nM); PKCη (IC50 = 210 nM); PKC-βI (IC50 = 430 nM); ROCK (IC50 = 100 nM); PKCθ (IC50 = 510 nM)
Afuresertib is a catalytic, ATP‑competitive inhibitor targeting AKT1, AKT2, and AKT3. [1]

Afuresertib (GSK 2110183) 对恶性胸膜间皮瘤 (MPM) 细胞表现出良好的肿瘤抑制作用。Afuresertib 显着提高 caspase-3 和 caspase-7 的活性以及 ACC-MESO-4 和 MSTO- 中凋亡细胞的比例211H 细胞。 afuresertib 在 G1 期强烈终止细胞周期。根据蛋白质印迹分析，Afuresertib 会增加 p21WAF1/CIP1 的表达并降低 Akt 底物（例如 GSK-3 和 FOXO 家族蛋白）的磷酸化。通过刺激 FOXO 活性，afuresertib 诱导的 p21 表达促进 G1 期停滞。 Afuresertib 显着增加顺铂引起的细胞毒性。 Afuresertib 改变基因 MYC 和 E2F1 的表达，这些基因与成纤维细胞核心血清反应相关[1]。

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Afuresertib 以浓度依赖性方式抑制六种恶性胸膜间皮瘤（MPM）细胞系（ACC‑MESO‑4、MSTO‑211H、NCI‑H2052、NCI‑H28、NCI‑H290、Y‑MESO‑8A）的活力，IC₅₀值范围为4.2 µM至12.1 µM。与正常间皮细胞系MeT‑5A相比（IC₅₀ = 17.8 µM），afuresertib对MPM细胞系的IC₅₀值更低，表明其具有肿瘤特异性抗增殖活性。
Afuresertib（10 µM）显著抑制ACC‑MESO‑4、MSTO‑211H和NCI‑H2052细胞的集落形成。
Afuresertib（20 µM）在ACC‑MESO‑4和MSTO‑211H细胞中诱导凋亡，表现为Annexin V‑FITC/PI双阳性细胞比例增加以及caspase‑3/7活性升高。
Afuresertib 增加促凋亡分子BIM和BAX以及cleaved caspase‑3的蛋白水平。
Afuresertib（5–10 µM）将细胞周期阻滞在G₀/G₁期，减少S期和G₂‑M期细胞比例，并降低Akt底物（GSK3β、mTOR、p70 S6K）和YAP（Ser127）的磷酸化水平。
Afuresertib 下调E2F1、CDK4和磷酸化CDK2的表达，上调p21WAF1/CIP1的表达。
Afuresertib 降低FOXO1（Thr24、Ser256）的磷酸化水平。
Afuresertib（5 µM）在划痕实验中抑制ACC‑MESO‑4和MSTO‑211H细胞的迁移。
Afuresertib（20 µM）与顺铂联合使用时，协同增强对ACC‑MESO‑4和MSTO‑211H细胞的细胞毒性和凋亡诱导作用。
Afuresertib 也能增强培美曲塞在MSTO‑211H细胞中诱导的凋亡。
基因表达谱分析显示，afuresertib 下调与Akt信号、血清应答、E2F1、MYC和mTOR通路相关的致癌特征基因。[1]

GSK2110183 每天以 10、30 或 100 mg/kg 的剂量口服给予带有 BT474 乳腺肿瘤异种移植物的小鼠，持续 21 天，分别产生 8%、37% 或 61% 的 TGI。小鼠对 GSK2110183 的耐受性良好；给药 5 天后，体重减轻了 1-3%，并在整个研究过程中恢复。为了进一步证明该化合物的有效性，研究了具有激活的 Akt 通路的其他肿瘤异种移植模型。给予 GSK2110183 剂量为 10、30 和 100 mg/kg 的小鼠形成 SKOV3 异种移植物，TGI 分别为 23%、37% 和 97%[2]。

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在携带BT474乳腺肿瘤异种移植瘤的雌性SCID小鼠中，每日口服给药afuresertib 10、30和100 mg/kg，持续21天，与溶剂对照组相比，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为8%、37%和61%。
在携带SKOV3卵巢肿瘤异种移植瘤的雌性无胸腺裸鼠中，每日口服给药afuresertib 10、30和100 mg/kg，持续21天，TGI分别为23%、37%和97%。
在联合治疗研究中，afuresertib（100 mg/kg，每日一次）与MEK抑制剂曲美替尼（GSK1120212）联用，在HPAC胰腺癌异种移植模型中的抗肿瘤效果优于单药治疗。
对经联合治疗的HPAC肿瘤进行的免疫组织化学分析显示，增殖（Ki67）减少、凋亡（cleaved caspase 3）增加、磷酸化PRAS40和磷酸化S6水平降低，以及AKT的反馈性高磷酸化。[2]

MPM细胞以每孔2.5×103的细胞密度接种在96孔板中，然后在37°C下生长24小时。随后，将细胞在含有指定浓度的 Akt 抑制剂（例如 Afuresertib；50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 和 0.01 M）的培养基中孵育 72 小时。然后将细胞孵育 4 小时，并在每孔中添加 MTT 溶液。然后将细胞在裂解缓冲液（0.01 mol/L 氯化氢中的 10% SDS）中孵育过夜。使用 SpectraMAX M5 分光光度计在 550 nm 处测量吸光度[1]。

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使用滤膜结合法测定afuresertib对AKT酶的抑制效力。将酶与抑制剂的预混物孵育1小时，然后加入GSK3α肽底物和[γ³³P]ATP。反应2小时后终止，放射性标记的磷酸化肽产物被捕获在磷酸纤维素滤板上进行定量。
还使用Sox-AKT-tide底物，通过连续实时荧光检测产物形成进行了进程曲线分析。
Afuresertib 在0.5 µM和10 µM浓度下针对一组多样化的激酶（261种）进行了测试。对在0.5 µM浓度下抑制率>50%的激酶生成了完整的IC₅₀曲线。[2]

细胞凋亡测定[1]
如前所述，通过进行AxV-FITC/PI双染色的FACS分析来评估细胞凋亡。简言之，将ACC‐MESO̴4和MSTO‌211H细胞接种在6孔板（细胞密度，1×105个细胞/孔）中，并在37°C下孵育24小时。接下来，用指定浓度的afuresertib孵育细胞，然后在室温下用AxV-FITC和PI（10μg/mL）孵育15分钟。通过使用FACSCantoII进行FACS来测定荧光强度。

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细胞周期分析[1]
如前所述，通过进行基于PI染色的FACS分析来评估细胞周期。将ACC‐MESO-4和MSTO-211H细胞接种在六孔培养板（细胞密度，1×105个细胞/孔）中，孵育24小时。接下来，将细胞与指定浓度的afuresertib孵育24 h。对于FACS分析，在血清处理24小时后使用胰蛋白酶分离细胞，并在冰冷的70%乙醇中固定过夜。固定后，用RNase A（100μg/mL）处理细胞，并用PI（10μg/mL）染色。使用FlowJo软件测量细胞周期亚G1、G1、S和G2-M期细胞的百分比。

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使用CellTiter Glo进行为期3天的增殖试验，以测量化合物在0-30μM下的生长抑制作用。与未处理的（DMSO）对照组相比，测量细胞生长速率。在Assay Client应用程序中，使用4或6参数拟合算法从抑制曲线计算EC50值。[2]

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细胞活力实验中，将MPM细胞以2.5×10³细胞/孔接种于96孔板，培养24小时后，用不同浓度的afuresertib处理72小时。加入MTT溶液孵育4小时，随后用裂解缓冲液（10% SDS，0.01 mol/L HCl）孵育过夜。在550 nm波长下测量吸光度。[1]
凋亡实验中，将细胞以1×10⁵细胞/孔接种于6孔板，用afuresertib处理48小时，然后用Annexin V‑FITC和碘化丙啶（10 µg/mL）在室温下染色15分钟，通过流式细胞术检测荧光。[1]
细胞周期分析中，细胞用afuresertib处理24小时，用冰预冷的70%乙醇固定过夜，用RNase A（100 µg/mL）处理，碘化丙啶（10 µg/mL）染色，通过流式细胞术分析。[1]
集落形成实验中，将细胞以200细胞/孔接种于6孔板，用10 µM afuresertib处理14天，然后用结晶紫染色并计数。[1]
细胞融合增殖实验中，将细胞以1×10⁴细胞/孔接种于12孔板，用afuresertib处理，使用活细胞成像系统记录相差图像。[1]
划痕实验中，细胞在24孔板中生长至80–90%融合，用移液器尖端划痕，然后加入含afuresertib的新鲜培养基，通过活细胞成像监测迁移。[1]
定量RT‑PCR实验中，afuresertib处理后提取总RNA，反转录，使用TaqMan探针进行PCR分析。[1]
蛋白质印迹实验中，afuresertib处理后用裂解缓冲液裂解细胞，使用特异性抗体检测蛋白表达。[1]

溶于 20% 聚乙二醇 (PEG) 400/1% DMSO；25、50、100 mg/kg；口服。荷 SKOV3 或 BT474 肿瘤的雌性无胸腺裸鼠和 SCID 小鼠。荷 SKOV3 或 BT474 肿瘤的雌性无胸腺裸鼠和 SCID 小鼠[1]
100 mg/kg
口服

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体内异种移植实验[2]
将细胞（SKOV3、CAPAN-2 和 HPAC）或肿瘤碎片（BT474）皮下注射到 6-8 周龄的雌性无胸腺裸鼠（SKOV3）和 SCID 小鼠（其他所有小鼠）体内，诱导肿瘤形成。当肿瘤体积达到 120 至 300 mm³ 时，根据肿瘤体积将小鼠随机分组，每组 n = 7-10 只小鼠。 GSK2110183 和 GSK2141795 每日以不同剂量通过灌胃给药。在联合用药实验中，GSK1120212 也每日通过灌胃给药。每周测量两次肿瘤体积和体重，肿瘤体积使用游标卡尺测量，并使用以下公式计算：肿瘤体积 (mm³) = (长度 × 宽度)²/2。结果以给药结束时的抑制率表示 = 100 × [1 - 药物治疗组平均生长量 / 载体对照组平均生长量]。[2]

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体内剂量反应药效学分析[2]
携带 BT474 肿瘤异种移植瘤的 SCID 小鼠在末次给药后 2 小时收集组织前，每日分别接受载体、GSK2110183 或 GSK2141795 治疗 7 天。根据上述方法，采用磷酸化 PRAS40 ELISA 分析蛋白裂解物。采用乙腈蛋白沉淀法分析组织和血液中测试化合物的浓度，然后使用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC/MS/MS）进行分析，电离方式为正离子大气压化学电离或Turbo离子喷雾电离。化合物的最低检测限为10 ng/mL，检测范围在100倍至1000倍药物浓度范围内呈线性关系。

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在体内异种移植疗效研究中，通过皮下注射癌细胞或肿瘤碎片，在雌性nu/nu CD-1或SCID小鼠体内建立肿瘤模型。当肿瘤体积达到 120–300 mm³ 时，将小鼠随机分组（n=7-10）。
Afuresertib 配制于 20% 聚乙二醇 (PEG) 400 / 1% DMSO 溶液中，每日以指定剂量（例如 10、30、100 mg/kg）灌胃给药，持续 21 天。
每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积，并监测小鼠体重。
在药效学研究中，荷 BT474 肿瘤的小鼠每日接受 afuresertib 治疗，持续 7 天。在末次给药后不同时间点采集肿瘤和血液样本，通过 ELISA 分析磷酸化 PRAS40 水平，并通过 LC/MS-MS 分析化合物浓度。
在与 MEK 抑制剂曲美替尼联合用药的研究中，两种药物均每日灌胃给药。曲美替尼配制于含0.5%羟丙甲纤维素和0.2%吐温-80（pH 8.0）的溶液中。[2]

Afuresertib 具有很高的血浆蛋白结合率（在人和啮齿动物血浆中均 >95%）。
在荷 BT474 肿瘤小鼠中，单次口服 100 mg/kg 剂量后，血药浓度约为 3–4 µM (Cmax) 时，可抑制肿瘤中约 60% 的磷酸化 PRAS40，且抑制作用可持续 24 小时。
肿瘤中 Afuresertib 的暴露量始终高于血药暴露量（≥3 倍）。
时间进程实验表明，给药后 48 小时，磷酸化 PRAS40 的抑制作用恢复至基线水平。[2]

小鼠单次口服100 mg/kg剂量的afuresertib后，血糖（给药后2小时峰值约为211 mg/dL）和血浆胰岛素（给药后4小时峰值约为105.6 ng/mL）均出现短暂升高。给药后8小时，各项指标恢复正常。
在为期21天的疗效研究中，小鼠体重仅出现轻微下降（1-3%），并在研究过程中逐渐恢复。[2]

[1]. Novel ATP-competitive Akt inhibitor Afuresertib suppresses the proliferation of malignant pleural mesothelioma cells. Cancer Med. 2017 Nov;6(11):2646-2659.

[2]. Discovery of novel AKT inhibitors with enhanced anti-tumor effects in combination with the MEK inhibitor. PLoS One. 2014 Jun 30;9(6):e100880.

N-[(2S)-1-氨基-3-(3-氟苯基)丙-2-基]-5-氯-4-(4-氯-2-甲基-3-吡唑基)-2-噻吩甲酰胺属于苯丙胺类药物。
阿弗瑞替尼已用于研究癌症和肿瘤（包括血液系统肿瘤）治疗的临床试验。
阿弗瑞替尼是一种口服生物利用度高的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt（蛋白激酶B）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。阿弗瑞替尼可与Akt结合并抑制其活性，从而抑制PI3K/Akt信号通路和肿瘤细胞增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡。 PI3K/Akt信号通路的激活通常与肿瘤发生相关，而PI3K/Akt信号通路的失调可能导致肿瘤对多种抗肿瘤药物产生耐药性。恶性胸膜间皮瘤（MPM）是一种与石棉相关的职业病，是胸腔内一种侵袭性强且无法治愈的肿瘤。尽管近年来MPM的治疗取得了进展，但患者的总体生存率仍然很低。近期研究表明，PI3K/Akt信号通路参与了MPM细胞的存活和发展。为了研究Akt抑制剂对间皮瘤（MPM）细胞存活的影响，我们检测了九种选择性Akt抑制剂（即afuresertib、Akti-1/2、AZD5363、GSK690693、ipatasertib、MK-2206、perifosine、PHT-427和TIC10）对六种MPM细胞系（即ACC-MESO-4、Y-MESO-8A、MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H290和NCI-H2052）以及一种正常间皮细胞系MeT-5A的影响。Akt抑制剂IC50值的比较表明，ATP竞争性特异性Akt抑制剂afuresertib对MPM细胞具有肿瘤特异性作用。阿弗瑞替尼显著增强了ACC-MESO-4和MSTO-211H细胞中caspase-3和caspase-7的活性，并增加了凋亡细胞的数量。此外，阿弗瑞替尼显著阻滞了细胞周期于G1期。蛋白质印迹分析显示，阿弗瑞替尼增加了p21WAF1/CIP1的表达，并降低了Akt底物（包括GSK-3β和FOXO家族蛋白）的磷酸化水平。这些结果表明，阿弗瑞替尼诱导的p21表达通过诱导FOXO活性促进了G1期阻滞。此外，阿弗瑞替尼显著增强了顺铂诱导的细胞毒性。有趣的是，基因集富集分析结果显示，阿弗瑞替尼调节了E2F1和MYC的表达，而E2F1和MYC与成纤维细胞核心血清反应相关。这些结果共同表明，afuresertib 是一种可用于治疗恶性胸膜间皮瘤 (MPM) 患者的有效抗癌药物。[1]

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肿瘤细胞会激活多种细胞信号通路，其中 AKT 是多种恶性肿瘤中被激活的关键激酶之一。GSK2110183 和 GSK2141795 是口服生物利用度高、效力强的 AKT 激酶抑制剂，目前已进入人体临床研究阶段。这两种化合物均为 AKT 1、2 和 3 的选择性 ATP 竞争性抑制剂。用这两种化合物处理的细胞显示 AKT 下游多个底物的磷酸化水平降低。这两种化合物均具有理想的药理学特性，每日口服给药可持续抑制 AKT 活性，并在多种不同组织学来源的小鼠肿瘤模型中抑制肿瘤生长。与先前报道的 ATP 竞争性 AKT 激酶抑制剂相比，更高的激酶选择性与更低的葡萄糖稳态影响相关。在多种细胞系增殖筛选中，AKT抑制剂在AKT通路激活（通过PI3K/PTEN突变或缺失）的细胞系中显示出更高的效力，而MAPK通路（KRAS/BRAF）激活突变的细胞系对AKT抑制的敏感性较低。在KRAS驱动的胰腺癌小鼠模型中的进一步研究证实，AKT抑制剂GSK2141795与MEK抑制剂（GSK2110212；曲美替尼）联合使用可增强抗肿瘤作用，并伴有磷酸化S6水平的显著降低。综上所述，这些结果支持对AKT抑制剂在癌症治疗中进行临床评估，尤其是在与MEK抑制剂联合使用时。[2]

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Afuresertib是一种ATP竞争性Akt抑制剂，它通过抑制Akt信号通路、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期以及增强化疗疗效，在恶性胸膜间皮瘤（MPM）细胞中显示出良好的抑癌作用。
该研究表明，afuresertib可能是一种治疗恶性胸膜间皮瘤的潜在药物，尤其是在与顺铂联合使用时。[1]

C₁₈H₁₈CL₃FN₄OS

463.78

462.025

C, 46.62; H, 3.91; Cl, 22.93; F, 4.10; N, 12.08; O, 3.45; S, 6.91

1047645-82-8

Afuresertib;1047644-62-1; 1047645-82-8 (HCl); 1047634-63-8 (Afuresertib-F free base); 2070009-64-0 (Afuresertib-F HCl)

46843056

White to off-white solid powder

5.787

101.18

3

5

6

28

520

1

ClC1=C(C2=C(C([H])=NN2C([H])([H])[H])Cl)C([H])=C(C(N([H])[C@]([H])(C([H])([H])N([H])[H])C([H])([H])C2C([H])=C([H])C([H])=C(C=2[H])F)=O)S1.Cl[H]

YFQJOPFTGMHYNV-YDALLXLXSA-N

InChI=1S/C18H17Cl2FN4OS.ClH/c1-25-16(14(19)9-23-25)13-7-15(27-17(13)20)18(26)24-12(8-22)6-10-3-2-4-11(21)5-10;/h2-5,7,9,12H,6,8,22H2,1H3,(H,24,26);1H/t12-;/m0./s

N-[(2S)-1-amino-3-(3-fluorophenyl)propan-2-yl]-5-chloro-4-(4-chloro-2-methylpyrazol-3-yl)thiophene-2-carboxamide;hydrochloride

GSK2110183; GSK 2110183; ASB183; ASB-183; GSK 2110183C; Afuresertib (GSK2110183); GSK-2110183; GSK2110183B; GSK2110183B; GSK 2110183B; 1047645-82-8; GSK2110183B; Afuresertib hydrochloride [USAN]; UNII-0FC27E442O; 0FC27E442O; Afuresertib HCl; Afuresertib hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。