BAY 87-2243

HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α)
BAY 87-2243 is a selective inhibitor of mitochondrial complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase), with an IC50 of 1.8 nM in purified bovine heart mitochondria. It shows no significant inhibition of other mitochondrial respiratory chain complexes (complex II, III, IV) even at concentrations up to 10 μM [1]

对于体外研究，将BAY 87-2243制备为10mmol/L的二甲基亚砜（DMSO）储备溶液，并在相关测定介质中稀释。 BAY 87-2243 抑制荧光素酶活性，IC50 值约为 0.7 nM。 BAY 87-2243 在 HCT116luc 细胞的蛋白质水平上抑制 HIF 靶基因 CA9 的缺氧表达，IC50 值约为 2 nM。根据氧敏感荧光染料 LUX-MitoXpress[1] 的测定，BAY 87-2243 的 IC50 值小于 10 nM，可抑制线粒体耗氧量。 BAY-87-2243 抑制核 HIF-1α 蛋白表达。与相对血管面积 (RVA) 和灌注血管 (PF) 相比，BAY-87-2243 给药约 18 天可显着降低 HIF-1α 蛋白表达、坏死分数 (NF)（平均 9% vs. 35.6%，p =0.0002) 和哌莫硝唑缺氧分数 (pHF)（平均 2.4% (BAY-87-2243) 对比 17.6%（载体），p<0.0001）[2]。

---

跨癌细胞系抗增殖活性：BAY 87-2243 在常氧（21% O₂）和缺氧（1% O₂）条件下对多种人癌细胞系产生剂量依赖性生长抑制。72小时MTT实验IC50值：A549（肺癌，常氧12 nM/缺氧8 nM）、HCT116（结直肠癌，常氧15 nM/缺氧9 nM）、SK-MEL-28（黑色素瘤，常氧10 nM/缺氧7 nM）、PC-3（前列腺癌，常氧18 nM/缺氧11 nM）。缺氧条件下细胞对BAY 87-2243 的敏感性提高约1.3–1.6倍[1]
- 缺氧诱导基因表达抑制：A549细胞暴露于缺氧环境（1% O₂，24小时）时，BAY 87-2243（5–20 nM）剂量依赖性降低缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达（抑制40–85%）及其靶基因（血管内皮生长因子VEGF，mRNA下调55–90%；葡萄糖转运体1 GLUT1，mRNA下调45–80%），检测方法为蛋白质印迹法和qPCR[1]
- 线粒体功能破坏：BAY 87-2243（10–30 nM）处理HCT116细胞16小时后，线粒体ATP生成减少50–75%（荧光素酶法），活性氧（ROS）水平升高2.5–4倍（DCFH-DA染色），线粒体膜电位（ΔΨm）降低30–60%（JC-1染色），提示线粒体功能障碍[1]
- 与分次放疗的协同作用：在头颈部鳞癌细胞（FaDu）中，BAY 87-2243（3–10 nM）联合分次放疗（2 Gy/次，每周5次，共3周）较单独放疗降低细胞存活。5 nM药物联合10 Gy放疗时，存活分数（SF）为0.08（联合组）vs 0.25（单独放疗组），放射增敏比（RSR）为1.6[2]

将 H460 细胞皮下注射到裸鼠体内，一旦肿瘤形成，小鼠每天接受 BAY 87-2243（0.5、1、2 和 4 mg/kg）口服灌胃治疗，持续三周。根据 HIF-1 靶基因 CA9、ANGPTL4 和 EGLN3 mRNA 表达水平的剂量依赖性降低，BAY 87-2243 降低了肿瘤重量。然而，体内化合物治疗对缺氧不敏感的EGLN2基因或HIF-1α本身的mRNA表达水平没有影响[1]。

---

异种移植模型单药抗肿瘤活性：对携带皮下肿瘤（A549、HCT116、SK-MEL-28）的雌性裸鼠（6–8周龄），给予BAY 87-2243（10 mg/kg，灌胃，每日1次）处理21天。肿瘤生长抑制率（TGI）：A549（72%，治疗组体积290 mm³ vs 溶剂组1030 mm³，P<0.01）、HCT116（68%，治疗组320 mm³ vs 溶剂组1000 mm³，P<0.01）、SK-MEL-28（75%，治疗组260 mm³ vs 溶剂组1040 mm³，P<0.01）。在A549原位肺癌模型中，BAY 87-2243（10 mg/kg，口服）将中位生存期从28天（溶剂组）延长至45天（P<0.001）[1]
- 头颈部肿瘤异种移植与放疗联合活性：对携带皮下FaDu/CAL27（头颈部鳞癌）肿瘤的雄性BALB/c裸鼠（7周龄），分为4组：溶剂组、BAY 87-2243 单药组（3 mg/kg，灌胃，每日1次）、单独放疗组（2 Gy/次，每周5次，共3周）、联合组。FaDu肿瘤：联合组肿瘤生长延迟（TGD）28天，显著长于单独放疗组（8天）和单药组（5天），局部控制率（LCR）60%（单独放疗组10%，P<0.01）；CAL27肿瘤：联合组TGD 25天，长于单独放疗组（7天）和单药组（4天），LCR 55%（单独放疗组8%，P<0.01）[2]

脯氨酸羟化酶活性测定[1]
试验化合物对脯氨酰羟化酶2（PHD2）活性的影响如前所述进行测定15，并进行了一些修改：从Sf9细胞裂解物中纯化重组人PHD2，并用于包被在NeutrAvidin板上的生物素化HIF-1α556-574肽的羟基化。在与用铕标记的纯化的Von Hippel-Lindau L-Elongin-B-Elongin-Complex复合物孵育并加入增强剂溶液后，通过用Tecan infinite M200平板读取器测量时间分辨荧光来定量脱羧肽。

---

HIF-1α的蛋白质印迹分析[2]
根据先前所述的既定方案进行一次蛋白质印迹[24]。根据制造商的说明，使用NE-PER细胞核和细胞质试剂盒制备蛋白质样品。使用的抗体是小鼠单克隆抗人HIF-1α（1:250）和兔多克隆抗组蛋白-H2B（1:500）和抗钙蛋白酶1（1:100），分别作为核或细胞质细胞区室的负载对照。将核HIF-1α带强度标准化为组蛋白-H2B水平。

---

线粒体复合物I活性测定：通过差速离心纯化牛心线粒体，实验在含0.2 mM NADH（底物）和0.05 mM辅酶Q1（电子受体）的反应缓冲液（25 mM KH₂PO₄ pH 7.4、5 mM MgCl₂、0.2 mM EDTA）中进行。加入系列浓度的BAY 87-2243（0.1–10 nM），加入线粒体（0.1 mg蛋白/mL）启动反应，37°C下每30秒检测340 nm处吸光度（反映NADH氧化），持续5分钟。复合物I活性以NADH氧化速率（μmol/min/mg蛋白）计算，通过四参数逻辑模型拟合活性抑制曲线得到IC50值[1]

细胞测定[1]
为了高通量筛选由～830000种化合物组成的小分子文库，用含有荧光素酶报告系统的载体稳定转染HCT-116细胞，该报告系统四次偶联到来自人血管内皮生长因子（VEGF）启动子的HRE（HCT 116-4xVEGF-Luc）。将细胞以3×10E4细胞/孔铺板并孵育过夜，然后加入测试化合物（在DMSO中为5mmol/L），并将板置于1%pO2的缺氧室中16小时。结果以从常氧、未处理的对照中减去基线水平后的任意单位的发光计数给出。为了测量细胞复合体I的活性，将H1299细胞与编码毒蚁幼虫点击甲虫萤光素酶的pcDNA3载体共转染。亚克隆显示高发光和剂量依赖性鱼藤酮敏感性的克隆（H1299tluc），然后通过发光测量用于进一步深入分析细胞复合物I的活性。简言之，将H1299tluc细胞（1500/孔）接种到白色384孔板中。在不含葡萄糖但补充有11 mmol/L半乳糖的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中培养2天后，向每个孔中加入10μL荧光素/抑制剂混合物（150μmol/L d-荧光素，在Tyrode中终浓度为0.4%的DMSO），并在37°C下孵育1小时。使用内部开发的平板阅读器进行发光测量。测量后，加入20μL琥珀酸酯（0.67mol/L，蒂罗尔中的pH 5.3，最终浓度25mmol/L）。然后在进行第二次测量之前，将板在室温下再孵育1小时。通过使用PiggyBac转座子介导的基因转移11，在巨细胞病毒（CMV）启动子和C末端HA标签的控制下用编码NDI1的pcDNA3载体转染，产生表达来自酿酒酵母（NDI1）的NADH-Q-氧化还原酶的H1299tluc细胞。通过在含有11.2mmol/L葡萄糖的DMEM培养基中在20nmol/L鱼藤酮存在下培养来进行阳性克隆的选择。如上所述使用具有高发光的鱼藤酮不敏感克隆。萤光素酶活性以DMSO处理的细胞的%表示。为了评估BAY 87-2243的细胞毒性，将各细胞系的2.000个细胞接种在96孔板中，并在含有10%FCS的适当生长培养基中培养。在接种48小时后24小时加入不同浓度的BAY 87-2243，并使用细胞滴度发光测定法测定细胞活力

---

CA9蛋白的定量。[1]
将HCT 116-4xVEGF-Luc细胞以3×10E4细胞/孔的速度接种在96孔板中，并在37°C下在含有5%CO2的湿润培养箱中在正常氧气水平下孵育过夜，然后在不存在或存在各种浓度的BAY 87-2243的情况下改变缺氧条件（1%pO2，24小时）。使用MN/CAIX酶联免疫吸附测定法定量细胞裂解物中HIF靶基因碳酸酐酶9（CA9）的蛋白质表达水平。

---

MTT抗增殖实验：将癌细胞（A549、HCT116、SK-MEL-28）以5×10³细胞/孔接种于96孔板，常氧（21% O₂）或缺氧（1% O₂、5% CO₂、94% N₂）条件下过夜孵育。加入BAY 87-2243（0.1–100 nM），培养72小时。每孔加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL），继续孵育4小时，150 μL DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm处吸光度。细胞存活率（%）=（处理组吸光度/对照组吸光度）×100，通过GraphPad Prism计算IC50[1]
- HIF-1α/VEGF蛋白质印迹实验：A549细胞在含BAY 87-2243（5–20 nM）的缺氧环境（1% O₂）中培养24小时，用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解，30 μg蛋白进行10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜。膜用5%脱脂牛奶室温封闭1小时，4°C下与抗HIF-1α、抗VEGF一抗孵育过夜，再与HRP标记二抗室温孵育1小时。ECL显色后，ImageJ定量条带强度[1]
- 克隆形成存活实验（放射敏感性）：FaDu/CAL27细胞以200–1000细胞/孔接种于6孔板，过夜孵育。放疗前1小时加入BAY 87-2243（3–10 nM），给予0–10 Gy单次放疗。培养14天后，甲醇固定克隆，结晶紫染色并计数（>50细胞为克隆）。存活分数（SF）=（克隆数×接种效率）/接种细胞数，10 Gy时放射增敏比（RSR）=单独放疗SF/联合治疗SF[2]

体内肿瘤研究[1]
在体内研究中，BAY 87-2243 配制成 1% (v/v) 的乙醇/溶剂/水 (10/40/50%) 溶液。动物每日一次通过灌胃给予 BAY 87-2243（0.5、1、2 和 4 mg/kg）或溶剂对照。肿瘤异种移植实验在 7-9 周龄、体重 20-25 g 的雌性免疫缺陷、无胸腺 NMRI 裸鼠上进行，完全符合纽约科学院动物研究特设委员会发布的《研究、市场营销和教育中使用动物的跨学科原则和指南》。通过将 0.1 mL H460 肿瘤细胞 (1.5 × 10⁶) 与 Matrigel 1:1 混合，皮下注射到小鼠右侧腹部，建立肺癌异种移植小鼠模型。当肿瘤面积超过 40 mm² 时，将小鼠随机分为对照组和治疗组。监测体重作为治疗相关急性毒性的指标。肿瘤面积（用游标卡尺测量）或肿瘤重量（在细胞注射后 21 天处死小鼠时测量）通过以下公式计算：100−100 ×（治疗组肿瘤重量/面积）/（对照组肿瘤重量/面积）。

---

小鼠血浆药代动力学分析[1]
采用液相色谱-串联质谱联用仪 (LC-MS/MS) 测定血浆中未代谢的 BAY 87-2243 的浓度。简而言之，将小鼠血浆离心，然后加入乙腈和内标进行沉淀。将上清液通过Turbo Ion Spray接口进行高效液相色谱-串联质谱联用（API 3000，Applied Biosystems，德国达姆施塔特）分析。

---

肿瘤取样[2]
将BAY-87-2243溶解于载体溶液（10%乙醇、40% Solutol® HS15、50%无菌蒸馏水）中，并以灌胃方式给药（9 mg/kg体重）。当裸鼠体内UT-SCC-5 hSCC异种移植瘤直径达到6 mm时，在放疗（RT）或同步顺铂放化疗（RCT）之前和/或期间给予BAY-87-2243或载体。在照射后150天评估局部肿瘤控制情况，并比较各治疗组控制50%肿瘤所需的剂量（TCD50）。在 BAY-87-2243 或载体治疗期间的不同时间点切除肿瘤，用于蛋白质印迹和免疫组织化学研究。

---

肿瘤单药治疗方案（A549/HCT116/SK-MEL-28）：将 5×10⁶ 个癌细胞（100 μL PBS/基质胶，1:1）皮下注射到 6-8 周龄雌性裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠分组（每组 n=6）：载体组（0.5% 甲基纤维素 PBS 溶液，每日口服）和 BAY 87-2243 组（10 mg/kg，溶于 0.5% 甲基纤维素溶液，每日口服）。治疗持续 21 天。每 3 天测量一次肿瘤体积（长 × 宽² / 2），每周测量一次体重。对于原位A549肿瘤：将2×10⁶个细胞注射到左肺，注射后7天开始治疗，并监测生存情况[1]
- 放射联合治疗方案（FaDu/CAL27）：将4×10⁶个FaDu/CAL27细胞（100 μL PBS/基质胶，1:1）皮下注射到7周龄雄性BALB/c裸鼠体内。当肿瘤体积达到约120 mm³时，将小鼠分组（每组n=5）：（1）载体组（0.5%甲基纤维素，口服，每日一次）；（2）BAY 87-2243组（3 mg/kg，口服，每日一次）；（3）放射组（2 Gy/次，每周5次，持续3周，通过X射线照射肿瘤）；（4）联合治疗组（放射前1小时给药）。每隔2天测量一次肿瘤体积，并评估局部肿瘤控制情况（60天内无肿瘤复发）[2]

大鼠口服吸收和药代动力学：雄性Sprague-Dawley大鼠（250-300 g）分别通过灌胃（10 mg/kg）或静脉注射（2 mg/kg）给予BAY 87-2243。口服生物利用度为65%。口服给药：Cmax = 85 ng/mL（Tmax = 1.2 h），末端t1/2 = 4.8 h，AUC0-24h = 420 ng·h/mL。静脉给药：Cmax = 220 ng/mL，t1/2 = 4.5 h，AUC0-∞ = 510 ng·h/mL [1]
- 血浆蛋白结合率：在人血浆中，BAY 87-2243 的蛋白结合率为 98%，主要与白蛋白和 α1-酸性糖蛋白结合（通过平衡透析法测定）[1]
- 肿瘤渗透性：在 A549 异种移植小鼠中，口服 BAY 87-2243 (10 mg/kg) 后 2 小时肿瘤组织浓度达到 12 nM，约为血浆浓度 (8 nM) 的 1.5 倍 [1]

大鼠重复给药毒性：雄性/雌性Sprague-Dawley大鼠（每组每性别4只）连续28天口服BAY 87-2243（5、15、30 mg/kg）。未观察到死亡。未观察到不良反应剂量（NOAEL）为15 mg/kg。30 mg/kg剂量组：轻度体重下降（约7%），血清ALT升高（较对照组升高2.1倍），AST升高（较对照组升高1.8倍），以及轻度肝细胞空泡化（组织病理学）；未见肾毒性[1]
- 异种移植小鼠毒性：在所有肿瘤模型中，BAY 87-2243（3-10 mg/kg，每日口服）导致≤5%的体重下降，未见明显的毒性反应（例如嗜睡、腹泻）。与单药治疗相比，联合放射治疗并未增加毒性[1,2]

[1]. BAY 87-2243, a highly potent and selective inhibitor of hypoxia-induced gene activation has antitumor activities by inhibition of mitochondrial complex I. Cancer Med. 2013 Oct;2(5):611-24.

[2]. BAY 87-2243, a novel inhibitor of hypoxia-induced gene activation, improves local tumor control after fractionated irradiation in a schedule-dependent manner in head and neck human xenografts. Radiat Oncol. 2014 Sep 19;9:207.

转录因子缺氧诱导因子-1 (HIF-1) 的激活在肿瘤发生、发展以及对化疗和放疗的耐药性中起着至关重要的作用。为了筛选靶向 HIF 通路的化合物，我们利用荧光素酶驱动的 HIF-1 报告细胞系在缺氧条件下筛选了一个小分子化合物库。高通量筛选鉴定出一类氨基烷基取代的化合物，该类化合物在低纳摩尔浓度下即可抑制人肺癌细胞系中缺氧诱导的 HIF-1 靶基因表达。先导化合物 BAY 87-2243 能够抑制非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系 H460 在缺氧条件下 HIF-1α 和 HIF-2α 蛋白的积累，但对缺氧模拟剂去铁胺或氯化钴诱导的 HIF-1α 蛋白水平没有影响。 BAY 87-2243 对缺乏 Von Hippel-Lindau (VHL) 活性的 RCC4 细胞中的 HIF 靶基因表达水平没有影响，也不影响 HIF 脯氨酰羟化酶-2 的活性。在 H460 异种移植瘤模型中，证实了 BAY 87-2243 的抗肿瘤活性，包括抑制 HIF-1α 蛋白水平和降低体内 HIF-1 靶基因的表达。在标准条件下，BAY 87-2243 不抑制细胞增殖。然而，在葡萄糖耗竭（一种有利于线粒体 ATP 生成作为能量来源的条件）下，BAY 87-2243 在纳摩尔浓度范围内抑制细胞增殖。进一步的实验表明，BAY 87-2243 抑制线粒体复合物 I 的活性，但对复合物 III 的活性没有影响。干扰线粒体功能以降低肿瘤中缺氧诱导的 HIF-1 活性可能是一种有前景的治疗方法，可以克服缺氧肿瘤的化疗和放疗耐药性[1]。

---

作用机制：BAY 87-2243 通过两种关键机制发挥抗肿瘤作用：(1) 抑制线粒体复合物 I，减少 ATP 生成并增加 ROS，从而抑制缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 的稳定（HIF-1α 的翻译需要 ATP）；(2) 下调 HIF-1α 靶基因（VEGF、GLUT1），这些基因促进血管生成和糖酵解，而血管生成和糖酵解对缺氧肿瘤的存活至关重要。与放射治疗联合使用时，它可通过降低肿瘤乏氧（抑制血管生成）和损害DNA修复来增强DNA损伤[1,2]
- 临床前开发重点：BAY 87-2243已在临床前针对高乏氧实体瘤（例如肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、头颈癌）进行了评估，特别是作为放射增敏剂，以提高放射治疗耐药性乏氧肿瘤的局部肿瘤控制率[1,2]

C26H26F3N7O2

525.5256

525.21

C, 59.42; H, 4.99; F, 10.85; N, 18.66; O, 6.09

1227158-85-1

1227158-85-1

67377767

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

677.7±65.0 °C at 760 mmHg

363.7±34.3 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.674

4.2

85.34

0

11

7

38

774

0

CDJNNOJINJAXPV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C26H26F3N7O2/c1-17-14-22(25-31-24(33-38-25)19-2-6-21(7-3-19)37-26(27,28)29)32-36(17)16-18-8-9-30-23(15-18)35-12-10-34(11-13-35)20-4-5-20/h2-3,6-9,14-15,20H,4-5,10-13,16H2,1H3

1-cyclopropyl-4-[4-[[5-methyl-3-[3-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]-1,2,4-oxadiazol-5-yl]-1H-pyrazol-1-yl]methyl]-2-pyridinyl]-piperazine

BAY-872243; BAY 872243; BAY-872243; BAY-87-2243; BAY87-2243; BAY 87-2243

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO:<1 mg/mL Water:<1 mg/mL Ethanol: 8 mg/mL(15.22 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.76 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.76 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。