ATP-citrate lyase (ACL); AMPK

Bempedoic Acid (ETC-1002) 以 Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶 β 独立和肝激酶 β 1 依赖性方式激活 AMP 激活的蛋白激酶，且腺苷酸能量电荷没有可检测到的变化。已证明，bempedoic 酸可快速转化转化为肝脏中的 CoA 硫酯，直接抑制 ATP-柠檬酸裂解酶[1]。 AMP 激活蛋白激酶 (AMPK) 磷酸化增加与经 Bempedoic 酸 (ETC-1002) 处理的细胞中 MAP 激酶活性降低以及促炎细胞因子和趋化因子产生减少相关[2]。

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ETC-1002是一种研究药物，目前处于ii期开发，用于治疗血脂异常和其他心脏代谢危险因素。在血脂异常的受试者中，ETC-1002不仅可以降低血浆LDL胆固醇，还可以显著降低hsCRP水平，hsCRP是炎症的临床生物标志物。在原代人单核细胞源性巨噬细胞和体内炎症模型中进一步研究了ETC-1002的抗炎特性。在用ETC-1002处理的细胞中，amp活化的蛋白激酶（AMPK）磷酸化水平的增加与MAP激酶活性的降低和促炎细胞因子和趋化因子的产生减少相一致。通过sirna介导的巨噬细胞肝激酶B1 （LKB1）的沉默，显著消除了AMPK磷酸化和ETC-1002对可溶性炎症介质的抑制作用，表明ETC-1002激活AMPK并通过LKB1依赖机制发挥其抗炎作用。在体内，ETC-1002抑制巯基乙酸盐诱导的白细胞归巢到小鼠腹腔。同样，在饮食诱导的肥胖小鼠模型中，ETC-1002恢复了脂肪AMPK活性，降低了JNK磷酸化，并降低了巨噬细胞特异性标志物4F/80的表达。这些数据与附睾脂肪垫块减少和炎症脂肪组织释放白细胞介素(IL)-6一致。因此，ETC-1002可以通过减少与胰岛素抵抗和代谢综合征血管并发症相关的全身性炎症，为具有心脏代谢危险因素的患者提供进一步的临床益处。[2]

Bempedoic Acid (ETC-1002) 治疗两周可导致大鼠肝脏中 AMPK 和 ACC 磷酸化显着且持久的增加。在大鼠肝脏中，Bempedoic 酸的含量比 CoA 硫酯高 100 倍，并且与 AMPK 激活有关[1]。 Bempedoic Acid (ETC-1002) 可抑制白细胞归巢至小鼠腹腔的能力。在饮食诱导肥胖的小鼠模型中，Bempedoic Acid 可改善脂肪 AMPK 活性，降低 JNK 磷酸化，并降低巨噬细胞特异性标记物 4F/80 的表达[2]。

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ETC-1002（8-羟基-2,2,14,14-四甲基戊二酸）是一种用于治疗血脂异常和其他心脏代谢危险因素的新型研究药物。ETC-1002在临床前疾病模型中表现出的降血脂、抗动脉粥样硬化、抗肥胖和降血糖的特性被认为是由于双重抑制甾醇和脂肪酸合成以及增强线粒体长链脂肪酸β-氧化。然而，介导这些活性的分子机制仍未明确。本文描述的研究表明，ETC-1002游离酸以Ca(2+)/钙调素依赖性激酶β独立和肝激酶β 1依赖的方式激活amp活化的蛋白激酶，而腺苷酸能量电荷没有可检测到的变化。此外，ETC-1002在肝脏中迅速形成CoA硫酯，直接抑制atp -柠檬酸裂解酶。这些不同的分子机制在体外和体内对脂质和碳水化合物代谢的有益作用方面是互补的。与这些机制一致的是，在高脂血症仓鼠模型中，ETC-1002治疗降低了循环促动脉粥样硬化脂蛋白、肝脂和体重，并在饮食性肥胖小鼠模型中降低了体重并改善了血糖控制。ETC-1002有望作为一种新的治疗方法，改善与代谢综合征相关的多种危险因素，并使心血管疾病患者受益。[1]

葡萄糖生成试验[1]
葡萄糖产量测定原代大鼠肝细胞培养。细胞在不含葡萄糖和酚红的DMEM中培养，其中含有10 mM乳酸，1 mM丙酮酸和非必需氨基酸（葡萄糖生产缓冲液，GPB）。为了评估ETC-1002对胰高血糖素刺激的葡萄糖生成的影响，将细胞与不同浓度的ETC-1002 (0.1 ~ 100 μM)的0.3 μM胰高血糖素孵育。随着时间的推移对媒体进行采样。在指定的处理后，细胞在GPB中洗涤两次。然后将细胞再孵育一个小时，通过添加不含ETC-1002的含有等量胰高血糖素浓度的GPB来评估葡萄糖的产生。细胞孵育1小时，使用葡萄糖氧化酶测定试剂盒测定培养基中葡萄糖的浓度。

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ETC-1002配方/ ETC-1002- coa合成[2]
对于体外检测，ETC-1002在无菌二甲基亚砜（DMSO）中采用30和100 mM的无菌技术配制，并在无菌微离心管中在4°C下保存长达四周（稳定性评估）。ETC-1002在含12 mM HEPES、1万U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的无血清RPMI 1640中配制工作液。用描述的大鼠肝微粒体合成ETC-1002-CoA。

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将7.5×化合物加入96孔PolyPlate中，每个孔含有60μL缓冲液，底物为CoA（200μM）、ATP（400μM）和[14C]柠檬酸盐。用4μL（300纳克/孔）ACL开始反应，并将平板在37°C下孵育3小时。

在原代大鼠肝细胞培养物中测量葡萄糖的产生。它含有非必需氨基酸、10 mM 乳酸、1 mM 丙酮酸，并且不含葡萄糖和酚红。细胞在该混合物中培养。 Bempedoic Acid（0.1 至 100 μM）与各种浓度的细胞一起孵育[1]。

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蛋白质阵列[2]
在分化期结束时，用PBS洗涤巨噬细胞，切换到含有5%自体血清的RPMI 1640，并补充14 mM HEPES， 100 U/ml青霉素，50 U/ml链霉素和2 mM l -谷氨酰胺。ETC-1002在100 ng/ml来自大肠杆菌0111:B4的脂多糖（LPS）刺激前1 h加入不同浓度（50 μM和100 μM）的培养基中。在LPS刺激后12小时收集MDMs培养基，根据制造商的说明，使用Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit， Panel A和Human Matrix Metalloproteinase Array进行检测。细胞因子和基质金属蛋白酶（MMP）阵列的数据被柯达4000MM图像工作站捕获和分析。每个分析物的净信号强度表示为每个单独阵列膜的内参标准的百分比。数据以平均值±SEM表示。组间比较采用单因素方差分析。采用Bonferroni事后多重比较检验评估方差分析显示的显著性差异。P≤0.05接受显著性。[2]

大鼠：雄性Wistar Han大鼠禁食48小时后，给予单剂量贝培多酸，随后进行第二次48小时的高碳水化合物饮食喂养。之后，大鼠饲喂标准饲料，并进行为期两周的贝培多酸灌胃给药评估。剂量为30 mg/kg/天，于早晨给药。在营养分期和/或给药后，于最后一次口服给予发动机对照或贝培多酸前两小时停止喂食[1]。

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\n\n对于体内实验，ETC-1002给药溶液的配制方法为：将NaOH与ETC-1002按2:1的摩尔比溶于水中，配制成二钠盐水溶液。加入羧甲基纤维素 (CMC) 和吐温-20，配制成最终溶液，其中 CMC 浓度为 0.5%，吐温浓度为 0.025%，最终 pH 值为 7–8。给药溶液中的化合物浓度以 10 ml/kg 体重的剂量给药。[1],2]

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\n\nWistar 大鼠。[1]
\n体重 225–250 g 的雄性 Wistar Han [Crl:WI] 大鼠在实验室环境中适应 7 天，每笼饲养 2–3 只，置于温度控制的房间内，并保持 12 小时光照/12 小时黑暗的昼夜节律，自由摄取食物和水。在单次给予 ETC-1002 前，大鼠禁食 48 小时，然后恢复高碳水化合物饮食 48 小时。为期两周的评估中，大鼠饲喂标准饲料（Purina 5001），并于每日早晨通过灌胃给予ETC-1002，剂量为30 mg/kg/天，持续两周。在营养分期和/或给药后，于最后一次灌胃给予溶剂对照或ETC-1002前2小时停止喂食。在最后一次给药后2小时或8小时，从异氟烷麻醉的动物中采集血液和肝脏样本。血液从锁骨下静脉采集，肝脏组织通过冷冻钳取下。冷冻钳取下的肝脏样本在切除后立即置于液氮中冷冻，并储存于-70°C。使用市售试剂盒（Wako Diagnostics，Richmond，VA）测定血浆甘油三酯、β-羟基丁酸（β-HBA）和总胆固醇水平，该试剂盒已适配于96孔板。

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\n\n金叙利亚仓鼠。[1]
\n雄性金叙利亚仓鼠购自查尔斯河实验室（加拿大魁北克省蒙特利尔市），年龄为8-10周，体重为100-120克。动物在7天的隔离期内饲喂Prolab RMH 1000标准啮齿动物饲料。随机分为各处理组（n = 6）后，通过饲喂高脂高胆固醇（HFHC）Prolab RMH 1000饲料诱导高脂血症，该饲料含有：11.5%椰子油、11.5%玉米油、5%果糖和0.5%胆固醇。研究期间，动物单独饲养于环境控制室中，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。仓鼠喂食高脂高胆固醇（HFHC）饮食两周后，每天一次通过灌胃给予赋形剂（0.5%羧甲基纤维素和0.025%吐温-20，pH 7-8）或赋形剂加ETC-1002（30 mg/kg），持续三周。在给药初期，每两天记录一次体重，每四天测量一次食物消耗量。研究期间，通过异氟烷麻醉，从眼眶静脉丛抽取血液样本，置于肝素锂抗凝管中；研究结束时，在麻醉状态下进行心脏穿刺采集血液样本。使用全自动生化分析仪分析血浆样本中的甘油三酯、总胆固醇、非酯化脂肪酸和β-羟基丁酸。收集肝脏和附睾脂肪组织，称重后置于液氮中冷冻，并储存于-80℃直至处理。所有仓鼠实验均按照多伦多儿童医院现行的动物福利指南进行，并符合美国国立卫生研究院1985年第86-23号出版物、1966年《动物福利法》（经1970年、1976年和1985年修订）以及《联邦法规汇编》第9篇第1、2和3部分的规定。

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\n\n小鼠饮食诱导肥胖。[1]
\n雄性C57BL/6N小鼠购自Taconic公司，8周龄，单独饲养于α-dri纸垫料上，光照周期为正常的12小时光照/12小时黑暗（上午6点至下午6点）。小鼠到达后，喂食含60%千卡脂肪的高脂饮食（HFD），持续12周。根据空腹4小时血糖和体重，将20周龄小鼠随机分为两组，分别口服CMC/Tween溶剂或30 mg/kg/天的ETC-1002（每日一次），持续两周。研究期间监测小鼠体重和食物消耗量。两周给药期结束后，于上午8点移除食物，并在口服ETC-1002前2小时更换垫料。给药2小时后采集空腹血样。使用手持式Alphatrak血糖仪（Abbott，芝加哥，伊利诺伊州）在麻醉前立即测量空腹血糖水平，采血方式为尾部采血（小鼠不活动）。胰岛素测定方面，在异氟烷麻醉下，通过眼眶后静脉丛采血至EDTA抗凝管中，并通过离心分离血浆。采用市售的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒测定血浆胰岛素水平。

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大鼠研究：** 本研究采用雄性Wistar Han大鼠（225-250 g）。在为期2周的疗效研究中，大鼠饲喂标准饲料，并每日通过灌胃给予赋形剂（0.5%羧甲基纤维素和0.025% Tween-20，pH 7-8）或30 mg/kg的贝培多酸，持续14天。末次给药前2小时停止喂食。分别于给药后2小时和8小时采集血液和冷冻钳夹的肝脏组织。在营养分级研究中，大鼠禁食48小时后，再给予高碳水化合物饲料48小时，然后单次灌胃给予30 mg/kg的贝培多酸或赋形剂。分别于给药后2小时和8小时采集肝脏组织。 [1]
* **仓鼠研究：** 雄性金丝雀叙利亚仓鼠（8-10周龄）喂食高脂高胆固醇饮食（11.5%椰子油、11.5%玉米油、5%果糖、0.5%胆固醇）两周，以诱导高脂血症。之后，在继续喂食相同饮食的情况下，每日一次口服赋形剂或30 mg/kg的贝培多酸，持续三周。监测体重和食物消耗量。研究结束时，采集血液、肝脏和附睾脂肪组织。[1]
* **小鼠研究：** 雄性C57BL/6N小鼠（8周龄）喂食高脂饮食（60% kcal脂肪）12周，以诱导肥胖。随后，受试者被随机分组，并分别每日口服一次赋形剂或30 mg/kg/天的贝培多酸，持续两周，同时继续喂食高脂饮食。监测体重和食物摄入量。禁食4小时后，测量血糖和血浆胰岛素水平。[1]

吸收、分布和排泄
贝培多酸在小肠内迅速吸收。180mg片剂的达峰时间(Tmax)估计为3.5小时。
贝培多酸的结合物主要通过尿液(70%)和粪便(30%)排出。原药总量的5%通过尿液和粪便排出。
贝培多酸的表观分布容积约为18升。
临床试验中，贝培多酸稳态清除率(CL/F)估计为11.2毫升/分钟。

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代谢/代谢物
贝培多酸代谢的两种主要代谢物是ETC-1002-CoA和ESP15228。贝培多酸主要通过其酰基葡萄糖醛酸苷的代谢排出。根据体外研究的观察结果，该药物可逆地转化为活性代谢物（ESP15228）。贝培多酸代谢产生的两种化合物均经 UGT2B7 酶代谢为无活性的葡萄糖醛酸苷结合物。

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生物半衰期
贝培多酸的半衰期为 15 至 24 小时。处方信息显示其清除率为 21 小时 ± 11 小时。

妊娠期和哺乳期影响
◉ 哺乳期用药概述
目前尚无关于哺乳期使用贝培多酸的相关已发表信息。贝培多酸及其代谢物的血浆蛋白结合率高达99%，因此乳汁中的含量可能非常低。然而，由于担心会扰乱婴儿的脂质代谢，哺乳期最好避免使用贝培多酸。建议使用其他药物，尤其是在哺乳新生儿或早产儿时。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对泌乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

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蛋白结合
贝培多酸及其代谢物的血浆蛋白结合率约为99%。

[1]. AMP-activated protein kinase and ATP-citrate lyase are two distinct molecular targets for ETC-1002, a novel small molecule regulator of lipid and carbohydrate metabolism. J Lipid Res. 2013 Jan;54(1):134-51.

[2]. ETC-1002 regulates immune response, leukocyte homing, and adipose tissue inflammation via LKB1-dependent activation of macrophage AMPK. J Lipid Res. 2013 Aug;54(8):2095-108.

药效学
贝培多酸抑制肝脏胆固醇的合成，从而降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。这可以减少动脉粥样硬化斑块的形成，进而降低心血管事件的风险。早期研究贝培多酸作用的临床试验表明，除LDL颗粒数量减少外，LDL-C水平还呈剂量依赖性降低，载脂蛋白B、非高密度脂蛋白胆固醇和高敏C反应蛋白的水平也降低。由于其独特的作用机制，贝培多酸不会引起肌炎，而肌炎是他汀类药物治疗中常见的副作用。最近的试验表明，该药在治疗12周后可显著降低LDL-C水平，并且与依折麦布和他汀类药物联合使用时，可进一步降低LDL-C水平。目前尚不清楚贝培多酸对死亡率的影响。

C19H36O5

344.4861

344.256

C, 66.25; H, 10.53; O, 23.22

738606-46-7

Bempedoic acid-d4;2408131-70-2;Bempedoic acid-d5;2408131-71-3

10472693

White to light yellow solid powder

87-92

4.469

94.83

3

5

14

24

351

0

OC(CCCCCC(C(=O)O)(C)C)CCCCCC(C(=O)O)(C)C

HYHMLYSLQUKXKP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H36O5/c1-18(2,16(21)22)13-9-5-7-11-15(20)12-8-6-10-14-19(3,4)17(23)24/h15,20H,5-14H2,1-4H3,(H,21,22)(H,23,24)

8-hydroxy-2,2,14,14-tetramethylpentadecanedioic acid

ETC-1002; ETC 1002; ETC1002; ESP-55016; Bempedoate; 8-Hydroxy-2,2,14,14-tetramethylpentadecanedioic acid; Nexletol; Nilemdo; ESP-55016; Bempedoic acid; ETC-1002ESP55016; ETC1002ESP

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~290.3 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.87 mg/mL (8.33 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.87 mg/mL (8.33 mM) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.26 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.26 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 25.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.26 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 6 中的溶解度: 0.57 mg/mL (1.65 mM) in 1% DMSO + 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加),悬浮液；澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。