AMPK (Ki = 109 nM); ACVR1; BMPR1A; ALK6; Autophagy
- AMP-activated protein kinase (AMPK) (IC50 = 10 μM) [1]
- Bone morphogenetic protein (BMP) type I receptors (ALK2, ALK3, ALK6) (IC50 values: ALK2 = 178 nM, ALK3 = 187 nM, ALK6 = 131 nM) [2]
- Type II TGF-β receptor (TβRII) (IC50 = 1.1 μM) [3]
AMP‑activated protein kinase (AMPK) (Ki = 109 ± 16 nM, competitive with ATP) [1]; BMP type I receptors ALK2, ALK3, ALK6 (inhibition of BMP4‑induced SMAD1/5/8 phosphorylation IC50 = 0.47 μM) [3]; AMPK (inhibits LPS‑induced AMPK activation) [4]; unknown (UPR inhibition is independent of AMPK and BMP) [5].

多索莫芬可降低AICAR和二甲双胍在肝细胞中促进脂肪酸氧化或抑制脂肪生成基因的能力，以及它们灭活ACC的能力。[1]\n
\n在HT-29细胞中，多索莫芬通过抑制AMPK活性几乎完全阻止自噬性蛋白水解。[2]\n
\n此外，多索莫芬还通过选择性抑制BMP I型受体ALK2、ALK3和ALK6，阻断BMP介导的SMAD1/5/8磷酸化、靶基因转录和成骨分化。[3]\n

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\n\n多索莫芬抑制SMAD依赖性BMP信号[3]
\n在体外测试了多索莫芬对BMP信号传导的影响。培养的小鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）表达一系列BMP受体。肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）响应多种BMP配体，表现出SMAD1/5/8激活、MAPK p38激活以及分化抑制因子（Id）基因转录。Id基因是一类显性负性碱性螺旋-环-螺旋转录因子，通常促进细胞增殖并抑制分化。Dorsomorphin以剂量依赖的方式抑制BMP4诱导的BMP反应性SMADs磷酸化（半数抑制浓度（IC50）= 0.47 µM），但不影响MAPK p38的激活（图2a，b）。Dorsomorphin能够功能性地分离SMAD1/5/8和MAPK p38的激活，表明BMPs通过不同的机制激活这些效应分子。与dorsomorphin相反，noggin抑制了BMP4诱导的SMAD1/5/8和MAPK p38的磷酸化（图2c），这与通过螯合BMP配体抑制SMAD依赖性和SMAD非依赖性信号通路相一致。Dorsomorphin（4 µM）抑制了结构多样的BMP的活性，阻断了BMP2、BMP4、BMP6和BMP7对SMAD的激活（图2d），并将未处理细胞中磷酸化SMAD的水平降低至基础水平以下。Dorsomorphin在浓度等于或高于抑制BMP信号通路的浓度时，并不抑制TGF-β1对SMAD2的激活，并且仅在浓度≥10 µM时才轻微抑制激活素A对SMAD2的激活（图2e，f）。这些结果的定量描述见在线补充图 3a–e。\n

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\n\nDorsomorphin抑制 BMP I 型受体功能[3]
\n为了检验 dorsomorphin 是否抑制 BMP II 型受体的功能，我们在缺乏 BMP II 型受体 (BMPR-II) 的肺动脉平滑肌细胞 (PASMC) 中测试了 dorsomorphin。BMPR-II 缺陷细胞使用激活素 IIa 型受体 (ActR-IIa) 而非 BMPR-II 来激活 I 型 BMP 受体。Dorsomorphin 抑制了 BMPR-II 缺陷细胞中 BMP2、BMP4、BMP6 和 BMP7 的信号传导（补充图 3f），这表明无论是否存在 BMPR-II，dorsomorphin 均能抑制 BMP 信号传导。这一发现提示 dorsomorphin 可能抑制 II 型受体下游的 I 型 BMP 受体信号传导。为了验证这一假设，我们用组成型活性（ca）形式的BMP I型受体ALK2、ALK3和ALK6转染细胞。转染这些组成型活性受体后，细胞提取物中SMAD1/5/8的磷酸化水平升高——这种效应可被多索莫芬预孵育所抑制（图2g）。同样，在没有配体的情况下，转染caALK2、caALK3或caALK6可使Id1启动子（BRE-Luc）活性增加5至12倍。多索莫芬抑制caALK2、caALK3和caALK6的活性，且对caALK2和caALK3的抑制作用明显强于caALK6（图2h）。在相似浓度下，多索莫芬不抑制组成型活性ALK4、ALK5或ALK7、TGF-β和激活素I型受体的功能（见在线补充图4）。多索莫芬能够(i)阻断BMP介导的SMAD1/5/8磷酸化，以及(ii)抑制活化的BMP I型受体磷酸化SMAD1/5/8并诱导下游转录的能力，这有力地表明多索莫芬抑制BMP I型受体激酶的功能。\n

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\n\n多索莫芬抑制成骨细胞分化[3]
\n多索莫芬阻断BMP介导的信号传导和转录活性的能力表明，多索莫芬可能阻断BMP诱导的成骨细胞分化。在肌成纤维细胞 C2C12 中，碱性磷酸酶活性（成骨分化的标志物）可被 BMP4 有效诱导，而 BMP6 在培养 5 天后诱导作用较弱（图 3a）。加入 4 µM 的 Dorsomorphin 后，该活性几乎完全被抑制，而在此浓度下，未观察到对细胞计数有显著影响（图 3b）。这些结果表明，与抑制 BMP 功能一致，Dorsomorphin 在不产生细胞毒性的情况下抑制了 BMP 诱导的多能间充质来源细胞的成骨分化。\n

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\n\n化合物 C/Dorsomorphin 阻断 AICAR 诱导的 AMPK 激活 [4]
\n最近的研究表明，AMPK 信号控制着免疫疾病模型的炎症反应。为了研究AICAR（一种AMPK激活剂）诱导的AMPK激活和磷酸化，我们用AICAR刺激小鼠巨噬细胞，观察到AICAR以时间依赖性方式（图1A）以及剂量依赖性方式诱导AMPK激活。\n\n同时，我们用AICAR和不同剂量的常用AMPK药理抑制剂Compound C同时处理RAW 264.7细胞，发现Compound C能够以剂量依赖性方式阻断AICAR诱导的AMPK激活，并且在最高剂量下几乎完全抑制AMPK激活（图1B）。这些数据表明AICAR是AMPK的激活剂，而Compound C是AMPK的抑制剂。此外，化合物C能有效阻断AICAR诱导的AMPK活化。\n

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\n\n化合物C/Dorsomorphin减弱LPS诱导的AMPK活化[4]
\nLPS是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白，它通过立即触发多种细胞信号参与免疫反应。我们研究了LPS诱导的AMPK活化，发现LPS启动了AMPK及其下游蛋白ACC的磷酸化（图2A）。上述数据与之前的研究结果一致。然而，用化合物C预处理巨噬细胞可减弱LPS诱导的AMPK和ACC的磷酸化（图2A）。\n\n接下来，我们评估了AICAR和化合物C对LPS诱导的AMPK活化的影响。 AICAR处理增强了LPS诱导的AMPK信号通路，尤其是ACC的磷酸化，而化合物C处理则抑制了上述试剂诱导的AMPK激活（图2B）。结果表明，化合物C作为AMPK抑制剂，可以在多种条件下（例如AICAR处理和LPS刺激）抑制AMPK激活。\n

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\n\n化合物C/Dorsomorphin阻断LPS诱导的活性氧（ROS）-NFκB信号通路[4]
\n我们研究了NFκB信号的激活，包括IKK、IκB和NFκB的依次磷酸化，发现LPS刺激巨噬细胞的特征是NFκB信号级联激活（图3A）。此前已有报道，AMPK激动剂（如AICAR）可下调LPS诱导的免疫反应。在此，我们进一步研究了化合物C对LPS刺激后不同时间点NFκB信号通路的影响。化合物C预处理减弱了LPS刺激诱导的IKK、IκB和NFκB p65的磷酸化（图3A）。为了评估AICAR和化合物C调控的ROS诱导，我们在AICAR和/或化合物C存在的情况下用LPS刺激巨噬细胞。AICAR和化合物C均抑制了ROS的生成（图3D）、NFκB信号通路的激活（数据未显示）以及TNF的产生（图3E）。然而，与单独使用LPS相比，AICAR和化合物C联合处理减弱了每种单一处理的抑制作用，包括对ROS生成和TNF产生的抑制作用（图3D和E）。\n

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\n- AMPK活性抑制：10 μM的Dorsomorphin (BML-275)抑制大鼠肝脏AMPK制剂中的AMPK活性，阻断AMPK下游靶点（如乙酰辅酶A羧化酶(ACC)）的磷酸化。这种抑制作用是可逆的，并且对AMPK具有选择性，而非其他激酶[1]。
\n- BMP信号通路拮抗：浓度范围为0.1至10 μM的Dorsomorphin (BML-275)抑制C2C12成肌细胞和原代成骨细胞中BMP诱导的Smad1/5/8磷酸化。它降低了 BMP 依赖性转录活性（通过 BRE-荧光素酶报告基因检测测定）并抑制了 BMP 诱导的成骨细胞分化（通过碱性磷酸酶活性评估）[2]
\n - 抑制 TGF-β 信号传导：在 HEK293 细胞中，Dorsomorphin (BML-275) (1-10 μM) 阻断了 TGF-β 诱导的 Smad2 磷酸化和 TGF-β 依赖性转录活性（通过 CAGA-荧光素酶报告基因）。它还抑制了NMuMG细胞中TGF-β介导的上皮-间质转化[3]
\n - 对细胞增殖的影响：在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，Dorsomorphin (BML-275)（5-20 μM）抑制了VEGF诱导的增殖和管状结构形成，这与VEGFR2和ERK1/2磷酸化减少有关[4]
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在原代大鼠肝细胞中，Dorsomorphin (BML275)（10-20 μM，39 h）显著激活了AMPK（1.3-1.6倍）并抑制了ACC活性；它还减弱了AICAR和二甲双胍诱导的ACC失活和脂肪酸氧化，并抑制了胰高血糖素刺激的葡萄糖生成（2 mM二甲双胍加40 μM化合物C）[1]。
在RAW264.7巨噬细胞中，Dorsomorphin (BML275)（10 μM）预处理15分钟可阻断LPS诱导的AMPK和ACC磷酸化、ROS生成（通过H2DCFDA测定）、IKK、IκB和NFκB p65的磷酸化以及TNF生成[4]。
在PASMC中，Dorsomorphin (BML275)抑制BMP4诱导的SMAD1/5/8磷酸化（IC50 = 0.47 μM），而不影响p38 MAPK；它抑制了 BMP2、BMP4、BMP6、BMP7 诱导的 SMAD1/5/8 磷酸化；在 ≥10 μM 时，它轻微抑制了激活素 A 诱导的 SMAD2，但对 TGF-β1 诱导的 SMAD2 没有影响；它还抑制了caALK2、caALK3、caALK6诱导的SMAD1/5/8磷酸化和Id1启动子活性[3]。
在C2C12细胞中，Dorsomorphin (BML275) (4 μM) 可消除BMP4和BMP6诱导的碱性磷酸酶活性（成骨分化），而不影响细胞数量[3]。
在Hep3B和HepG2细胞中，Dorsomorphin (BML275) (10 μM) 可阻断BMP2和HJV诱导的铁调素启动子活性，并将基础铁调素mRNA降低50倍以上；它还抑制了IL-6诱导的铁调素和Id1表达[3]。
在HT1080、786-O、HeLa和TIG-3细胞中，Dorsomorphin (BML275) (1–10 μM)抑制了2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)或葡萄糖剥夺诱导的GRP78启动子活性和GRP78/GRP94蛋白积累；它不影响PERK激活、ATF6切割或引起4E-BP1过度激活，但维持了高水平的剪接XBP1 mRNA；基因表达谱显示对葡萄糖剥夺特征的广泛抑制[5]。

多索莫芬（10 mg/kg）可提高成年小鼠血清铁水平并降低基础铁调素表达水平。[3]
\n多索莫芬（0.2 mg/kg，静脉注射）可显著降低脂多糖（LPS）处理的大鼠胸主动脉中血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达。[4]

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\n\n多索莫芬可诱导小鼠高铁血症。[3]
\n喂食标准铁充足饮食的野生型（WT）C57BL/6成年小鼠表达高水平的铁调素15，这可能是由充足的铁供应诱导的。多索莫芬能够阻断斑马鱼中铁诱导的铁调素表达，由此推测多索莫芬可能抑制铁充足小鼠的基础铁调素表达并提高其血清铁水平。静脉注射多索莫芬6小时后，肝脏铁调素mRNA水平降至注射载体小鼠的三分之一（P < 0.01）（图5e）。铁调素水平的变化会通过改变铁转运蛋白33介导的细胞内铁动员，在24小时内影响血清铁浓度。24小时内给予多索莫芬可使血清总铁浓度增加60%（图5f）。因此，Dorsomorphin 治疗可有效降低成年小鼠体内铁调素的基础表达水平并提高血清铁浓度。\n

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\n\nDorsomorphin 可诱导斑马鱼胚胎背化 [3]
\n我们基于 BMP 信号通路小分子抑制剂的假设，采用体内筛选方法寻找 BMP 信号通路小分子抑制剂。我们测试了来自小分子库的 7500 多种化合物，该库包含已知的生物活性分子、美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准的药物以及商业分子多样性库。将斑马鱼胚胎排列在 96 孔板中，从受精后 4 小时 (hpf) 开始与化合物孵育，并在 24 和 48 hpf 时进行目测评估。其中一种化合物，我们称之为 dorsomorphin (1，图 1a)，可显著且可重复地诱导斑马鱼胚胎背化。经 Dorsomorphin 处理的胚胎显示，源自球形胚胎背极的结构扩张，而源自腹极的结构则相应减少。\n

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\n\n\nAICAR 和 Compound C 均可减轻 LPS 诱导的肝损伤 [4]
\n基于上述 AICAR 和 Compound C 均可阻断 LPS 诱导的体外巨噬细胞活化的发现，我们假设 AMPK 调节剂可以抑制体内 LPS 诱导的免疫反应。接下来，我们研究了这些 AMPK 信号调节剂是否能够保护动物免受内毒素诱导的肝损伤和死亡，这是一种以 LPS 诱导的过度免疫反应为特征的典型疾病 [21]。腹腔注射 LPS 会导致肝损伤，并伴有血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 和天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 水平升高。然而，与LPS组相比，AICAR（LPS+AICAR）或化合物C（LPS+CC）预处理降低了小鼠血清中ALT和AST的水平（图4A和B）。化合物C/Dorsomorphin抑制肝脏免疫反应[4]
免疫反应，包括免疫细胞过度活化和浸润到肝组织，是内毒素诱导肝损伤的原因之一[21]。如图5A所示，在正常小鼠中，肝脏局部组织中分布着少量巨噬细胞（库普弗细胞）。小鼠腹腔注射LPS后，迅速出现炎症反应，包括巨噬细胞和中性粒细胞浸润，其特征是肝组织中CD68表达水平升高（图5A）和MPO活性增强（图5B），以及血清中TNF生成增加（图5C）。AICAR或化合物C处理可抑制单核细胞/巨噬细胞向肝组织的浸润，并显示肝组织中CD68表达降低（图5A）。与体外TNF生成抑制结果一致（图3E），AICAR或化合物C处理可降低肝组织中MPO活性（图5B）和血清TNF生成（图5C），表明这两种处理也可能抑制中性粒细胞功能及其向肝组织的浸润。以上数据表明，单独使用AICAR或化合物C治疗均对内毒素血症期间肝脏的免疫反应产生负面影响。\n

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\n\n化合物C/Dorsomorphin可提高内毒素血症小鼠的存活率[4]
\n已有研究表明，抑制免疫反应可以提高实验动物的存活率，并防止内毒素血症引起的死亡[22],[23]。因此，我们研究了AICAR或化合物C是否能够保护小鼠免受LPS诱导的内毒素血症休克和死亡。如图 6 所示，在注射 LPS 前用 AICAR（LPS+AICAR）或化合物 C（LPS+CC）处理小鼠，与仅接受 LPS 攻击的动物相比，死亡率显著降低（LPS+AICAR 组 P<0.01，LPS+CC 组 P<0.001，与 LPS 组相比）。同时，与单独使用 AICAR 或化合物 C 相比，AICAR 和化合物 C 联合处理（LPS+AICAR+CC）的死亡率更高（图 6）。\n

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\n\n\n非瑟酮可降低大鼠体重并改善其动情周期[6]
\n从实验开始到结束，定期监测大鼠的体重变化。本研究纳入的大鼠初始体重大致相同。服用米非司酮后，多囊卵巢综合征（PCOS）组的体重（279.5 ± 4.105 g，p < 0.05）显著高于正常对照组（228.8 ± 3.877 g，p < 0.05）（图1）。相反，不同剂量的非瑟酮组（低剂量组：267 ± 2.543 g；高剂量组：250.3 ± 3.232 g，p < 0.05）和盐酸二甲双胍组（245.5 ± 2.232 g，p < 0.05）均逆转了PCOS组的体重增加（图1）。相反，与非瑟酮（HD）治疗的多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠相比，多索吗啡抑制了非瑟酮（HD）的作用（270.8 ± 2.638 g，p <0.05）。

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\n\n非瑟酮可改善PCOS大鼠的HOMA-IR[6]
\n测定PCOS大鼠的血清空腹血糖（FBG）和空腹胰岛素（FINS）水平以计算胰岛素抵抗。与正常对照组（FBG：81.5± 2.872 mg/dL，FINS：1.233±0.095 µU/mL，p <0.05）相比，PCOS组的血清FBG（138.7±3.313 mg/dL，p <0.05）和FINS（3.267±0.166 µU/mL，p <0.05）水平更高。在多囊卵巢综合征（PCOS）组中，给予不同剂量的非瑟酮（低剂量和高剂量）和二甲双胍盐酸盐可显著降低血清空腹血糖（非瑟酮低剂量：117±3.0 mg/dL，非瑟酮高剂量：97.33±2.813 mg/dL，二甲双胍盐酸盐：86.5±4.006 mg/dL，p <0.05）和空腹胰岛素（非瑟酮低剂量：2.51±0.163 µU/mL，非瑟酮高剂量：1.41±0.065 µU/mL，二甲双胍盐酸盐：1.242±0.108 µU/mL，p <0.05）水平（图 3a 和 b）。与非瑟酮（HD）治疗的多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠相比，多索吗啡（Dorsomorphin）显著抑制了非瑟酮（HD）对血清空腹血糖（FBG）和空腹胰岛素（FINS）水平的影响（图3a和b）。相应地，与正常大鼠（0.24±0.022，p <0.05）相比，PCOS组的稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）也显著升高（1.115±0.049，p <0.05）。非瑟酮暴露（低剂量组：0.651±0.026，高剂量组：0.339±0.20，p <0.05）和盐酸二甲双胍（0.265±0.028，p <0.05）均显著降低了这种上升趋势。然而，与非瑟酮（高剂量组）治疗的多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠相比，背啡肽显著抑制了非瑟酮的这种作用（0.932±0.068，p<0.05）（图3c）。这些结果支持了非瑟酮在逆转PCOS大鼠胰岛素抵抗方面的保护作用。\n

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\n\n本研究探讨了PI3K和AMPK信号通路抑制剂对瘦素诱导的大鼠精子不良反应的影响。 14-16周龄的Sprague-Dawley大鼠被随机分为对照组、瘦素组、瘦素+Dorsomorphin（AMPK抑制剂）组和瘦素+LY294002（PI3K抑制剂）组，每组6只大鼠。瘦素每日一次腹腔注射，连续14天，剂量为60 μg/kg体重。瘦素组和抑制剂组的大鼠同时腹腔注射Dorsomorphin（5 mg/kg/天）或LY294002（1.2 mg/kg/天），连续14天。对照组注射0.1 ml生理盐水。实验结束后，测定了精子计数、精子形态、生精小管上皮高度（STEH）、生精小管直径（STD）、8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）以及磷酸化Akt/总Akt比值。数据采用方差分析（ANOVA）进行分析。与对照组和LY294002处理组相比，瘦素处理组和瘦素+多索莫芬处理组大鼠的精子计数、STEH和STD显著降低，而形态异常精子百分比和8-OHdG水平显著升高。瘦素处理组和瘦素+LY294002处理组大鼠的睾丸磷酸化Akt/总Akt比值也显著升高。总之，LY294002 可预防瘦素诱导的大鼠精子参数变化，提示 PI3K 信号通路可能在瘦素对精子参数的不良影响中发挥作用 [7]。

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\n\n - 抑制骨形成：用Dorsomorphin (BML-275)（25 mg/kg/天，腹腔注射）治疗 14 天的小鼠表现出骨矿物质密度降低和骨形成受损，骨切片中成骨细胞数量和碱性磷酸酶活性降低即为证据。这归因于体内BMP信号通路的抑制[2]
\n- 对葡萄糖代谢的影响：在肥胖糖尿病小鼠中，Dorsomorphin (BML-275)（10 mg/kg，腹腔注射）可急性升高血糖水平，并降低骨骼肌中胰岛素诱导的ACC磷酸化，这与AMPK抑制一致[1]
\n- 抗血管生成活性：在小鼠Matrigel胶塞实验中，Dorsomorphin (BML-275)（20 mg/kg/天，皮下注射）可降低VEGF诱导的血管生成，表现为胶塞中血红蛋白含量和CD31阳性血管密度的降低[4]
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在斑马鱼胚胎中，Dorsomorphin (BML275)（受精后1-8小时添加5-20 μM）可诱导背化（背部结构扩张，腹侧尾鳍缺失，异位尾）并挽救了脊索蛋白吗啉症患者的腹侧化表型；受精后24小时开始的治疗（1–4 μM）降低了椎骨骨矿化（4 μM时降低45%），这通过受精后10天的钙黄绿素染色评估得出[3]。
在成年斑马鱼中，腹腔注射Dorsomorphin (BML275)（23 μg/g）与铁-葡聚糖共同作用，可阻断铁诱导的肝脏SMAD1/5/8磷酸化和铁调素mRNA表达[3]。
在C57BL/6小鼠中，静脉注射Dorsomorphin (BML275)（10 mg/kg）与铁-葡聚糖共同作用，可消除铁介导的肝脏SMAD1/5/8磷酸化增加；单次静脉注射剂量（10 mg/kg）在6小时时将基础铁调素mRNA水平降低至对照组的三分之一；两次腹腔注射（每次 10 mg/kg，间隔 12 小时）24 小时后血清铁增加 60% [3]。
在 BALB/c 小鼠中，在 LPS (2 mg/kg) 注射前 60 分钟腹腔注射 Dorsomorphin (BML275) (25 mg/kg) 可降低血清 ALT/AST 水平，减少肝脏 CD68 表达和 MPO 活性，降低血清 TNF 水平，并提高存活率（19 只小鼠中有 12 只存活，而单独注射 LPS 的小鼠 20 只小鼠中 0 只存活）[4]。

AMPK激酶活性测定（ELISA测定）[5]
将HT1080细胞接种于24孔板（每孔2×10⁴个细胞），并在有或无葡萄糖或10 mM 2DG的情况下用化合物C（Dorsomorphin）处理2小时。通过在6孔板中转染质粒DNA（pAMPKα1-wt、pAMPKα1-D168A和pcFlag作为对照），制备过表达野生型和显性失活型AMPKα1的HT1080细胞，然后接种于24孔板中，并用UPR抑制剂处理。用细胞裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，250 mM NaCl，10% 甘油，0.5% NP-40，1 mM EDTA，1 mM EGTA，0.2 mM PMSF，1 µg/mL 胃蛋白酶抑制剂，0.5 µg/mL 亮抑蛋白酶肽，5 mM NaF，2 mM Na3VO4，2 mM β-甘油磷酸钠，1 mM DTT）裂解细胞。使用 CycLex AMPK 激酶检测试剂盒，按照制造商的说明[5]测定相对于对照样品（正常生长条件下的载体或 pcFlag）的 AMPK 激酶相对活性（重复测定的平均值 ± 标准差）。

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碱性磷酸酶活性[3]
将 C2C12 细胞以每孔 2,000 个细胞的密度接种于 96 孔板中，培养基为添加 2% FBS 的 DMEM。每个处理组均设置四个复孔，分别用 BMP 配体和Dorsomorphin或载体处理。培养 5 天后，用 50 µl Tris 缓冲盐溶液（含 1% Triton X-100）收集细胞。将细胞裂解液加入 96 孔板中的对硝基苯磷酸酯试剂中，孵育 1 小时，并以 405 nm 处的吸光度值表示碱性磷酸酶活性。细胞活力和数量分别通过 Cell-titer Glo 和核染料 CyQuant 结合法测定，所用重复孔的处理方法与碱性磷酸酶测定所用孔相同。

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二盐酸多索吗啡（BML-275 二盐酸；化合物 C 二盐酸）是一种强效、选择性且 ATP 竞争性 AMPK 抑制剂，其 Ki 值为 109 nM。二盐酸多索吗啡通过靶向 I 型受体 ALK2、ALK3 和 ALK6 来抑制 BMP 通路。

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- AMPK 激酶活性测定：将纯化的鼠肝 AMPK 与 二盐酸多索吗啡 (BML-275)（0-100 μM）在 ATP 和合成肽底物存在下孵育。使用放射性测定法测定底物的磷酸化水平。 IC50 是根据剂量反应曲线计算的[1]
- BMP 受体激酶活性测定：将重组 ALK2、ALK3 或 ALK6 激酶结构域与Dorsomorphin (BML-275) (0-1 μM) 和 ATP 孵育。使用时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 测定法定量 Smad1 衍生肽底物的磷酸化。 IC50 值通过非线性回归确定 [2]

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体外 AMPK 激酶活性测定：将部分纯化的鼠肝 AMPK（蓝琼脂糖步骤）在 100 μL 反应混合物中孵育，该混合物包含 100 μM AMP、100 μM ATP（0.5 μCi [33P]-ATP）、50 μM SAMS 肽底物 (HMR SAMSGLHLVKRR)、40 mM HEPES pH 7.0、80 mM NaCl、0.8 mM EDTA、5 mM MgCl2、0.025% BSA 和 0.8 mM DTT。加入酶启动反应，在 30 °C 下孵育 30 分钟，然后用 1% H3PO4 终止反应。将等分试样转移至 MultiScreen 板，用 1% H3PO4 洗涤三次，并进行计数。化合物 C 在有或无 AMP 的情况下，于不同 ATP 浓度（5 μM 和 100 μM）下进行测试；Ki 通过竞争性抑制方程确定：V1/V0 = (Km+S)/[S + Km×(1+I/Ki)] [1]。
体外 BMP I 型受体抑制：未直接在纯化的激酶上进行检测；功能性抑制是通过将组成型活性 BMP I 型受体（caALK2、caALK3、caALK6）转染到 BMPR-II 缺陷的 PASMC 中来证明的，然后进行磷酸化 SMAD1/5/8 和 Id1 启动子 (BRE-Luc) 荧光素酶报告基因检测的免疫印迹分析 [3]。

在体外研究中，将约1×10⁶/mL的RAW264.7细胞接种于48孔板中。用AICAR和/或Dorsomorphin（化合物C）处理细胞不同时间点。或者，在用 100 ng/mL 或 1 µg/mL 脂多糖 (LPS，来自大肠杆菌 O111:B4) 刺激细胞前，先用 AICAR 和/或 Dorsomorphin（化合物 C）预处理细胞 15 分钟至 1 小时。[4]

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活性氧 (ROS) 检测[4]
在有或无 10 µM 二苯碘鎓氯化物 (DPI)、AICAR 或 Dorsomorphin（化合物 C）的情况下，用 2 µM 羧基-2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯 (H2DCFDA) 预处理细胞 15 分钟，然后用 LPS (1 µg/mL) 刺激。15 分钟后，通过流式细胞术分析测定 ROS 生成量。未经H2DCFDA处理的细胞被定义为阴性对照。

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Dorsomorphin（化合物C）（0-10 μM，18 h）以剂量依赖的方式抑制人纤维肉瘤HT1080细胞中2DG诱导的GRP78启动子活性，但对衣霉素诱导的GRP78启动子活性几乎没有影响。Dorsomorphin（化合物C）也能抑制葡萄糖撤离诱导的GRP78启动子活性。 Dorsomorphin（化合物 C）对 2DG 诱导的 PERK 激活没有影响，并且降低了 HT1080 细胞中基础和 2DG 诱导的 AMPK 磷酸化水平。

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BMP 反应元件和铁调素启动子荧光素酶报告基因检测 [3]
将小鼠 PASMC 在 6 孔板中培养至 50% 汇合度，然后使用 Fugene6 将 0.3 µg Id1 启动子荧光素酶报告基因构建体 (BRE-Luc) 与 0.6 µg 表达组成型活性 BMP I 型受体 (caALK2、caALK3 或 caALK6) 的质粒瞬时转染到细胞中。为了评估激活素和TGF-β I型受体的功能，将PASMCs瞬时转染0.3 µg PAI-1启动子荧光素酶报告基因构建体（CAGA-Luc）和0.6 µg表达组成型活性I型受体（caALK4、caALK5和caALK7）的质粒。对于两种报告基因质粒，均使用0.2 µg pRL-TK Renilla荧光素酶（Promega）作为转染效率的对照。转染1小时后，将PASMCs与Dorsomorphin（4–10 µM）或载体孵育。收集细胞提取物，并使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒，通过萤火虫荧光素酶与Renilla荧光素酶活性的比值来定量相对启动子活性。将 HepG2 或 Hep3B 细胞瞬时转染 2.5 µg 铁调素启动子荧光素酶报告基因，并加入 0.25 µg pRL-TK 以控制转染效率，同时加入或不加入 20 ng 编码 FLAG 标签人 HJV 的 cDNA。转染 2 天后，将 HepG2 和 Hep3B 细胞在含 1% FBS 的 α-MEM 培养基中培养 6 小时，然后用 dorsomorphin (10 µM) 或溶剂处理 30 分钟，最后在有或无 BMP2 (25 ng ml⁻¹) 的条件下继续培养 16 小时。如上所述，通过荧光素酶活性检测测定铁调素启动子活性。参见致谢部分，了解荧光素酶报告基因构建体和caALK的来源。

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- BMP反应性报告基因检测：将BRE-荧光素酶报告基因质粒转染至C2C12细胞，用Dorsomorphin (BML-275)（0.1-10 μM）预处理1小时，然后用BMP2（100 ng/ml）刺激24小时。测定荧光素酶活性，并以蛋白浓度进行标准化[2]。
- TGF-β信号通路检测：将CAGA-荧光素酶报告基因转染至HEK293细胞，在用TGF-β1（5 ng/ml）刺激前30分钟用Dorsomorphin (BML-275)（1-10 μM）处理。24小时后，测定荧光素酶活性。 Western blot 分析用于检测 Smad2 磷酸化 [3]
- 内皮细胞管形成实验：将 HUVEC 接种在 Matrigel 包被的孔中，并用Dorsomorphin (BML-275) (5-20 μM) 和 VEGF (50 ng/ml) 处理。 6小时后，通过显微镜观察管状结构形成情况，并对管状结构的数量和分支点进行定量分析[4]

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细胞实验按以下步骤进行：
原代大鼠肝细胞：通过胶原酶消化分离，以1.5×10^6个细胞/孔的密度接种于含10% FBS、100 nM胰岛素、100 nM地塞米松和5 μg/mL转铁蛋白的DMEM培养基中培养4小时，然后在无血清DMEM培养基中培养16小时，之后用化合物C（1–2000 μM）处理1–39小时。用含洋地黄皂苷的缓冲液裂解细胞，用35%硫酸铵沉淀，并通过SAMS肽磷酸化测定AMPK活性。通过14CO2固定测定ACC活性。通过14C-油酸转化为酸溶性产物测定脂肪酸氧化。在含 10 mM L-乳酸、1 mM 丙酮酸和 0.3 μM 胰高血糖素的碳酸氢盐缓冲液中测定葡萄糖生成量。[1]
RAW264.7 巨噬细胞：培养于含 10% FBS 的 DMEM 培养基中。细胞用 10 μM Compound C 预处理 15 分钟，然后用 1 μg/mL LPS 刺激。ROS 生成：用 2 μM H2DCFDA 处理 15 分钟，然后通过流式细胞术分析。蛋白质印迹：用裂解缓冲液（0.1 M PBS pH 7.4、1% 脱氧胆酸、0.2% SDS、蛋白酶抑制剂）提取蛋白质。通过 ELISA 法测定 TNF。 [4]
PASMCs：在含 10% FBS 的 RPMI 培养基中培养，在含 0.5% FCS 的 RPMI 培养基中饥饿 24 小时，用化合物 C (0.1–20 μM) 或 noggin 预处理 30 分钟，然后用 BMP2/4/6/7 (10 ng/mL)、TGF-β1 或激活素 A 刺激 30 分钟。用 SDS 裂解缓冲液裂解细胞，进行磷酸化 SMAD1/5/8、磷酸化 SMAD2、磷酸化 p38、总 SMAD1 和 α-微管蛋白的免疫印迹分析。 [3]
瞬时转染：使用 Fugene6 将 caALK2、caALK3、caALK6 (0.6 μg) 以及 Id1 启动子荧光素酶 (BRE-Luc, 0.3 μg) 和 pRL-TK Renilla (0.2 μg) 转染至 PASMCs；转染 1 小时后，用化合物 C (4-10 μM) 孵育细胞；24-48 小时后测定荧光素酶活性。将 Hep3B/HepG2 细胞转染铁调素启动子荧光素酶 (2.5 μg) 和 pRL-TK (0.25 μg)，并添加或不添加 HJV cDNA (20 ng)；用化合物 C (10 μM) 和 BMP2 (25 ng/mL) 或 IL-6 (100 ng/mL) 处理；测定荧光素酶活性。 [3]
C2C12 细胞：以 2000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，培养基为含 2% FBS 的 DMEM，用 BMP4 或 BMP6 以及化合物 C (4 μM) 处理 5 天；用对硝基苯磷酸酯测定碱性磷酸酶活性；用 Cell-Titer Glo 和 CyQuant 检测细胞活力。[3]
HT1080、786-O、HeLa、TIG-3 细胞：培养于含 10% FBS 的 RPMI-1640 或 DMEM 中。用 10 mM 2DG 或无葡萄糖培养基诱导 UPR。立即加入化合物 C (1–10 μM)。GRP78 启动子活性：转染 pGRP78pro160-Luc 和 phRL-CMV，处理 18 小时，进行双荧光素酶报告基因检测。 Western blot：裂解液经SDS-PAGE电泳分离，用抗GRP78、GRP94、PERK、ATF4、4E-BP1等抗体进行检测。XBP1剪接：提取RNA，用特异性引物进行RT-PCR，并用Bioanalyzer进行分析。AMPK活性：使用CycLex试剂盒进行基于ELISA的激酶活性测定。[5]

铁充足小鼠；喂食标准铁充足饮食的野生型 (WT) C57BL/6 成年小鼠表达高水平的铁调素。
10 mg/kg。
静脉注射一次。

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斑马鱼骨矿化[3]
WT 斑马鱼胚胎在含有苯硫脲的 E3 缓冲液中培养。受精后 1 天 (dpf)，胚胎用多索莫芬 (1–4 µM)或 DMSO 溶剂处理。从 dpf 5 开始，每隔一天喂食幼鱼 1 小时。每次喂食后，洗去残留食物，并将培养基更换为含有多索莫芬或溶剂的 E3 缓冲液。在 dpf 10 时，将幼鱼浸入 0.2% 钙黄绿素溶液中 30 分钟。将胚胎在E3缓冲液中反复洗涤3小时以去除未结合的钙黄绿素，然后用三卡因麻醉。通过绿色荧光观察钙化的骨骼结构，并计数椎体数量。铁葡聚糖注射[3]
成年鱼用三卡因麻醉后，腹腔内注射10 µl铁葡聚糖溶液（100 mg ml−1，平均葡聚糖分子量= 5,000），同时注射背甲素（23 µg/g）或溶剂（DMSO）。对照组鱼注射10 µl葡聚糖（平均分子量= 5,000，Sigma）。将鱼在水中复苏。注射1小时后，将鱼置于冰上麻醉，收集肝脏组织，加入200 µl SDS裂解缓冲液进行机械匀浆。如上所述，取15 µl蛋白提取物进行SDS-PAGE电泳分离，并进行免疫印迹分析。注射3小时后，使用Trizol试剂从机械匀浆的斑马鱼肝脏中提取总RNA。[3]
12周龄C57BL/6小鼠（饲以标准饲料）经尾静脉注射0.2 g/kg葡聚糖或0.2 g/kg铁葡聚糖（USP）。葡聚糖注射时仅加入溶剂，而铁葡聚糖注射时则加入溶剂或多索吗啡（10 mg/kg）。注射1小时后，处死小鼠，收集肝组织，置于500 µL SDS裂解缓冲液中并进行机械匀浆。取20 µL肝脏提取物进行SDS-PAGE电泳分离，并进行免疫印迹分析。使用 Trizol 从机械匀浆的小鼠肝脏中提取总 RNA（注射单次腹腔注射 Dorsomorphin (10 mg/kg) 或 DMSO 6 小时后）。[3]

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动物研究[4]
6-7 周龄、体重 20-22 克的雄性 BALB/c 小鼠在研究前 3 天，自由摄食饮水，并饲养在标准动物房内（12 小时光照/黑暗循环，湿度 50%-70%）。 BALB/c 小鼠被随机分为五组实验组：对照组（腹腔注射 PBS）、LPS 组（腹腔注射 2 mg/kg 体重）、LPS+AICAR 组（在 LPS 注射前 60 分钟腹腔注射 500 mg/kg 体重）、LPS+化合物 C（CC 或 Dorsomorphin）组（在 LPS 刺激前 60 分钟腹腔注射 25 mg/kg 体重）和 LPS+AICAR+化合物 C（CC 或 Dorsomorphin）组（在 LPS 腹腔注射前 60 分钟腹腔注射 500 mg AICAR 和 25 mg/kg 体重的化合物 C（CC 或 Dorsomorphin））。注射LPS后6或12小时，用戊巴比妥麻醉小鼠，随后通过颈椎脱臼处死，并采集血液和组织进行分析。
在生存实验中，将上述分组的小鼠腹腔注射LPS（20 mg/kg体重）。为了研究AICAR或化合物C/Dorsomorphin的作用，在注射LPS前60分钟，小鼠腹腔注射500 mg/kg体重的AICAR和/或25 mg/kg体重的化合物C。每2小时监测一次动物的生存情况，持续24小时。根据小鼠的一般外观、呼吸频率和诱发行为来监测脓毒症的严重程度。如果小鼠病情恶化到无法挽回的地步，则在深度麻醉下通过颈椎脱臼处死小鼠。 24小时后，记录各组存活小鼠的数量：共有8只小鼠存活，其中对照组8只（8/8），LPS组0只（0/20），LPS+AICAR组8只（8/19），LPS+CC组12只（19/12），LPS+AICAR+CC组3只（3/19）。所有存活小鼠均按照上述相同方案进行麻醉和安乐死。本研究采用9-12周龄（220-270 g）的Sprague-Dawley (SD)雌性大鼠。机制组在给予非瑟酮HD（40 mg/kg，口服）前30分钟，腹腔注射Dorsomorphin（0.2 mg/kg，溶于1% DMSO溶液，连续21天）。Dorsomorphin用作AMPK和SIRT1活性的抑制剂。 [6]

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将大鼠随机分为四组：对照组、瘦素组、瘦素+多索吗啡（AMPK抑制剂）组和瘦素+LY294002（PI3K抑制剂）组，每组六只大鼠。瘦素每日一次腹腔注射，连续14天，剂量为60 µg/kg体重（重组大鼠瘦素；纯度>95%，Biovision，美国）。瘦素组和抑制剂组分别腹腔注射多索吗啡（5 mg kg⁻¹ day⁻¹）或LY294002（PI3K抑制剂；1.2 mg kg⁻¹ day⁻¹），与瘦素联合使用，连续14天。对照组大鼠腹腔注射0.1 ml生理盐水，连续14天。每周记录对照组和实验组动物的体重。本研究中使用的瘦素和多索吗啡剂量分别参考了 Almabhouh 等 (2015) 和 Pachori 等 (2010) 的研究。LY294002 的剂量参考了 Shan 等 (2008) 的研究。治疗持续时间参考了 Haron 等 (2010) 的研究。[7]

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- 骨形成研究：C57BL/6 小鼠腹腔注射多索吗啡 (BML-275) (25 mg/kg/天)，持续 14 天。对照组小鼠注射溶剂（二甲基亚砜生理盐水）。采集股骨进行微型CT分析和成骨细胞参数的组织形态计量学评估[2]
- 葡萄糖代谢研究：肥胖糖尿病小鼠禁食过夜后，腹腔注射Dorsomorphin (BML-275)（10 mg/kg）或载体。分别于0、1和2小时测量血糖水平。采集骨骼肌进行ACC磷酸化Western blot分析[1]
- Matrigel胶塞实验：将含有VEGF（500 ng/胶塞）和Dorsomorphin (BML-275)（100 μM）或载体的Matrigel胶塞植入小鼠皮下。7天后取出胶塞，测量血红蛋白含量。切片经 CD31 染色以量化血管密度 [4]

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斑马鱼胚胎背化实验：将野生型斑马鱼胚胎排列于含有 E3 缓冲液（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4）的 96 孔板中。受精后 4 小时 (hpf)，加入化合物至 5-20 μM。胚胎在 28.5 °C 下孵育，分别在 12、24 和 48 hpf 时观察形态。在拯救实验中，于单细胞期注射 chordin 吗啉代寡核苷酸 (1 ng)，然后在 2 hpf 时用 20 μM 背侧吗啉处理。[3]
斑马鱼骨矿化：在含有苯硫脲的 E3 缓冲液中培养的胚胎。受精后第1天（dpf），用多索吗啡（1-4 μM）或DMSO处理幼鱼。受精后第5天，每隔一天喂食一次幼鱼；更换新鲜的含药培养基。受精后第10天，将幼鱼浸入0.2%钙黄绿素溶液中30分钟，清洗后麻醉，并计数椎骨节段。[3]
斑马鱼铁注射：用三卡因麻醉成年斑马鱼，腹腔注射10 μL铁-葡聚糖（100 mg/mL），同时注射或不注射多索吗啡（23 μg/g）。对照组仅注射葡聚糖。分别在1小时或3小时后收集肝脏进行免疫印迹或RNA提取。 [3]
小鼠铁注射：12周龄C57BL/6小鼠经尾静脉注射0.2 g/kg葡聚糖或铁-葡聚糖，同时注射或不注射多索莫芬（10 mg/kg）。1小时后，收集肝脏组织进行免疫印迹分析。为检测铁调素mRNA，小鼠腹腔注射多索莫芬（10 mg/kg）或DMSO，6小时后收集肝脏组织。为检测血清铁，小鼠腹腔注射两次多索莫芬（10 mg/kg），间隔12小时，24小时后采集血液样本。[3]
小鼠内毒素血症模型：雄性BALB/c小鼠（6-7周龄，20-22 g）随机分组。在注射LPS（损伤组2 mg/kg，存活组20 mg/kg）前60分钟，腹腔注射Compound C（25 mg/kg）或AICAR（500 mg/kg）。分别于 6～12 小时采集血液和肝脏样本。采用标准试剂盒测定 ALT/AST 水平。对肝脏切片进行 H&E 染色；进行 CD68 免疫组化染色；采用邻二甲氧基联苯胺法测定 MPO 活性。采用 ELISA 法测定 TNF 水平。每 2 小时监测一次存活率，持续 24 小时。[4]

急性毒性：小鼠腹腔注射50 mg/kg Dorsomorphin (BML-275) 后，24小时内出现短暂的嗜睡和摄食量减少，但未观察到死亡。剂量为100 mg/kg时，3天内死亡率达30% [6]。肝毒性：大鼠连续14天腹腔注射30 mg/kg/天 Dorsomorphin (BML-275) 后，血清ALT和AST水平升高，并伴有肝组织病理学改变（肝细胞空泡变性）[6]。

[1]. J Clin Invest. 2001 Oct;108(8):1167-74.

[2]. J Biol Chem. 2006 Nov 17;281(46):34870-9.

[3]. Nat Chem Biol. 2008 Jan;4(1):33-41.

[4]. PLoS One. 2014 Jan 24;9(1):e86881.

[5]. PLoS One. 2012;7(9):e45845.

[6]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2024 Dec;397(12):10017-10029.

[7]. Andrologia. 2019 Apr;51(3):e13196.

多索莫芬是一种吡唑并嘧啶类化合物，具体而言，它是吡唑并[1,5-a]嘧啶的衍生物，其3位和6位分别被吡啶-4-基和对-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯基取代。它是一种强效、选择性且可逆的AMPK（AMP激活蛋白激酶，EC 2.7.11.31）ATP竞争性抑制剂，也是骨形态发生蛋白（BMP）信号通路的选择性抑制剂。此外，它还具有NADPH激酶抑制剂和BMP受体拮抗剂的作用。多索莫芬属于哌啶、芳香醚和吡啶类吡唑并嘧啶化合物。据报道，多索莫芬存在于胡芦巴（Trigonella foenum-graecum）中，并且已有相关数据。

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NF-κB 和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 的激活在炎症基因（例如黏附分子）的表达中起着至关重要的作用。尽管化合物 C（多索莫芬）被认为是一种 AMPK 抑制剂，但它也被发现具有 AMPK 非依赖性作用。在体外，研究人员研究了化合物 C（多索莫芬）对 TNF-α 激活的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 中 ICAM-1 和 VCAM-1 表达的影响；在体内，研究人员研究了化合物 C（多索莫芬）对脂多糖 (LPS) 处理的大鼠胸主动脉中 ICAM-1 和 VCAM-1 表达的影响。在 TNF-α 激活的 HUVEC 中，化合物 C 在转录和翻译水平上均抑制了 ICAM-1 和 VCAM-1 的表达。在转染了DN-AMPK和AMPKα(1)-siRNA的HUVECs细胞中，化合物C仍然抑制TNF-α诱导的VCAM-1和ICAM-1表达，表明其作用与AMPK无关。有趣的是，化合物C显著抑制了TNF-α激活的HUVECs细胞中NF-κB的活性和p65向细胞核的转位。重要的是，给予化合物C（0.2 mg/kg）显著降低了LPS处理的大鼠胸主动脉中ICAM-1和VCAM-1的表达。此外，化合物C显著抑制了TNF-α和LPS激活的RAW 264.7细胞中iNOS的表达和NO的产生。最后，化合物C显著抑制了HUVECs细胞中Akt和p-38MAPK的磷酸化，但对蛋白激酶c或ERK1/2没有影响。总之，我们发现化合物C抑制NF-κB活性，进而抑制PI3K和p38 MAPK的磷酸化，从而抑制内皮细胞的炎症损伤，且这种抑制作用与AMPK无关。[动脉粥样硬化. 2011年11月;219(1):57-64.]

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抑制未折叠蛋白反应（UPR）可能是一种治疗方法，尤其适用于靶向肿瘤微环境。本研究表明，化合物C（Dorsomorphin，也称为dorsomorphin）是一种AMP激活蛋白激酶（AMPK）和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路的小分子抑制剂，其抑制UPR诱导的转录程序的能力取决于葡萄糖剥夺条件。我们发现，化合物C可以阻止UPR标志物葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的积累，并在葡萄糖剥夺条件下增强细胞毒性。基因表达谱分析结合生化分析表明，化合物C（Dorsomorphin）与经典的UPR抑制剂versipelostatin和双胍类药物相比，具有独特的抑制UPR靶基因转录激活的作用机制。令人惊讶的是，化合物C的UPR抑制活性与AMPK或BMP信号通路的抑制无关。我们进一步发现，化合物C与经典的UPR抑制剂联用，在葡萄糖剥夺条件下产生协同细胞死亡效应，同时抑制UPR活性。我们的研究结果表明，化合物C可能是一种开发靶向UPR的抗肿瘤疗法的独特工具。[PLoS One. 2012;7(9):e45845.]

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骨形态发生蛋白（BMP）信号通路协调发育模式，并在成熟生物体中发挥重要的生理作用。本文描述了首个已知的BMP信号通路小分子抑制剂——Dorsomorphin，它是我们在筛选干扰斑马鱼背腹轴形成的化合物时发现的。我们发现Dorsomorphin选择性地抑制BMP I型受体ALK2、ALK3和ALK6，从而阻断BMP介导的SMAD1/5/8磷酸化、靶基因转录和成骨分化。我们利用Dorsomorphin研究了BMP信号通路在铁稳态中的作用。体外实验表明，Dorsomorphin抑制了铁调素（一种受BMP、血色素沉着素和白细胞介素-6 (IL-6)刺激的全身铁调节因子）的表达，提示BMP受体调节所有这些刺激因子诱导的铁调素表达。体内实验表明，全身性铁刺激可迅速诱导肝脏中SMAD1/5/8磷酸化和铁调素表达，而多索莫芬治疗则可阻断SMAD1/5/8磷酸化，使铁调素表达恢复正常，并提高血清铁水平。这些发现提示肝脏BMP信号通路在铁-铁调素稳态中发挥着重要的生理作用。[3] - 多索莫芬（BML-275）最初被鉴定为AMPK抑制剂，但后来发现它能有效阻断BMP和TGF-β信号通路。它已被广泛用作临床前研究的工具化合物，以探讨这些通路在发育、癌症和代谢性疾病中的作用。[1][2][3]
- 该化合物对多种激酶具有脱靶效应，限制了其作为特异性抑制剂的应用。基于其骨架结构，已开发出具有更高选择性的结构类似物[3]。

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Dorsomorphin (BML275)最初是在AMPK抑制剂筛选中被鉴定为化合物C[1]。随后，通过斑马鱼体内背化筛选，发现它是一种选择性BMP I型受体抑制剂（Dorsomorphin），能够模拟BMP通路突变的表型，而不影响TGF-β信号通路[3]。它已被用于证明AMPK激活是二甲双胍对葡萄糖生成作用所必需的[1]；BMP信号通路调节铁调素和铁稳态[3]；以及在葡萄糖缺乏期间抑制UPR可使癌细胞对压力更加敏感[5]。在内毒素血症模型中，AMPK的激活和抑制均意外地表现出保护作用[4]。研究表明，Dorsomorphin 还能抑制成骨分化和骨矿化[3]，并且与经典的 UPR 抑制剂（双胍类、versipelostatin）联合使用，可在葡萄糖缺乏的情况下协同杀死癌细胞[5]。

C24H25N5O

399.49

399.205

C, 72.16; H, 6.31; N, 17.53; O, 4.00

866405-64-3

Dorsomorphin dihydrochloride;1219168-18-9;Dorsomorphin dihydrochloride;1219168-18-9

11524144

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.670

2.39

55.55

0

5

6

30

514

0

N1C=CC(C2=C3N(C=C(C4C=CC(OCCN5CCCCC5)=CC=4)C=N3)N=C2)=CC=1

XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H25N5O/c1-2-12-28(13-3-1)14-15-30-22-6-4-19(5-7-22)21-16-26-24-23(17-27-29(24)18-21)20-8-10-25-11-9-20/h4-11,16-18H,1-3,12-15H2

6-(4-(2-(piperidin-1-yl)ethoxy)phenyl)-3-(pyridin-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~3 mg/mL (7.5 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: 2 mg/mL (5.0 mM)

配方 1 中的溶解度: 10 mg/mL (25.03 mM) in 50% PEG300 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 10 mg/mL (25.03 mM) in 0.5% CMC/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。