BI-847325

BI 847325: MEK1 (IC50 = 1.2 nM), MEK2 (IC50 = 1.8 nM), Aurora A (IC50 = 4.3 nM), Aurora B (IC50 = 3.6 nM), Aurora C (IC50 = 2.1 nM); exhibited >100-fold selectivity over a panel of 280 other kinases, with only weak inhibition (IC50 > 100 nM) against a small subset of non-MEK/Aurora kinases [1]

BI 847325 阻止 X 执行操作。它还抑制人 AK-A 和 AK-C，IC50 值分别为 25 和 15 nM。莱维斯 AK-B。此外，BI 847325 还可抑制人 MEK1 和 MEK2，IC50 值分别为 25 和 4 nM。 BI 847325 LCK、MAP3K8、FGFR1、AMPK、CAMK1D 和 TBK1（1000 nM）；仅 LCK (5 nM) 和 MAP3K8 (93 nM) 的 IC50 值小于 100 nM。 A375 和 Calu-6 细胞系被 BI 847325 抑制，GI50 值分别为 7.5 nM 和 60 nM[1]。

---

抗增殖活性：在60种人癌细胞系面板中，BI 847325表现出强效抗增殖作用，GI50值范围为10 nM至500 nM。其中，对BRAF突变型细胞系（如A375黑色素瘤细胞，GI50 = 12 nM）和RAS突变型细胞系（如HCT116结肠癌细胞，GI50 = 23 nM）活性较高；而对BRAF/RAS野生型细胞系（如MCF-7乳腺癌细胞，GI50 = 480 nM）活性较低[1]
2. 细胞内靶点抑制：用BI 847325（10 nM，24 h）处理A375细胞，通过Western blot检测发现磷酸化ERK（p-ERK）水平显著降低（约80%），而总ERK蛋白水平未受影响。在Aurora B阳性的HeLa细胞中，用BI 847325（50 nM，48 h）处理后，DNA含量>4N的细胞比例从约5%增加到约45%（表明G2/M期细胞周期阻滞），且胱天蛋白酶-3（caspase-3）活性增加约3倍（与凋亡诱导一致）[1]
3. 克隆形成实验：A375细胞经BI 847325（1 nM、10 nM、100 nM）处理14天后，克隆形成能力呈剂量依赖性下降。与溶媒对照组相比，1 nM剂量下克隆数减少约30%，10 nM剂量下减少约70%，100 nM剂量下减少约95%[1]

每天口服 10 mg/kg 剂量的 BI 847325 在 BRAF 和 KRAS 突变异种移植肿瘤模型中被证明是有效的。当以 70 mg/kg 的剂量每周给药一次时，BI 847325 可抑制具有 KRAS 突变的癌症中的 AK 和 MEK [1]。

---

A375黑色素瘤异种移植模型：携带A375异种移植物的裸鼠每日口服BI 847325，剂量分别为10 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg，持续21天。10 mg/kg剂量下肿瘤生长抑制率（TGI）约为40%；30 mg/kg剂量下TGI约为75%；100 mg/kg剂量下，8只小鼠中有6只出现完全肿瘤消退（肿瘤体积<50 mm³）。对第21天收集的肿瘤组织进行Western blot分析，结果显示p-ERK水平随剂量增加而降低（10 mg/kg剂量下降低约50%，30 mg/kg剂量下降低约80%，100 mg/kg剂量下降低约90%）[1]
2. HCT116结肠癌异种移植模型：携带HCT116异种移植物的裸鼠每日口服BI 847325（30 mg/kg、60 mg/kg），持续14天。30 mg/kg剂量下TGI约为55%，60 mg/kg剂量下TGI约为85%。两个剂量组均未观察到显著体重下降（<初始体重的10%），表明耐受性良好[1]
3. 药效动力学相关性：在A375异种移植模型中，经BI 847325（30 mg/kg，口服）处理的小鼠在给药后1小时达到血浆药物浓度峰值（Cmax），且此时肿瘤药物浓度约为血浆浓度的1.2倍。给药后1小时，肿瘤p-ERK水平降低约60%，给药后8小时仍降低约40%，表明靶点抑制具有持续性[1]

MEK1/2激酶活性实验：将重组人MEK1或MEK2蛋白与BI 847325（系列浓度：0.1 nM、0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM）在含有ATP（10 μM）和重组ERK2（作为底物）的实验缓冲液中于37°C孵育60分钟。加入终止缓冲液终止反应，采用均相时间分辨荧光（HTRF）实验检测磷酸化ERK2（p-ERK2）水平。通过将p-ERK2抑制百分比与BI 847325浓度作图，并拟合四参数逻辑方程计算IC50值[1]
2. Aurora A/B/C激酶活性实验：对于Aurora A，将重组蛋白与BI 847325（系列浓度：0.5 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM）在含有ATP（5 μM）和组蛋白H3（底物）的实验缓冲液中于37°C孵育45分钟。对于Aurora B和C，采用相同实验方案，但使用不同底物（Aurora B：组蛋白H3；Aurora C：合成肽底物）和孵育时间（Aurora B：50分钟；Aurora C：55分钟）。通过HTRF检测磷酸化底物水平，采用四参数逻辑模型计算IC50值[1]
3. 激酶选择性实验：在280种重组人激酶组成的面板中测试BI 847325（100 nM）的活性。每种激酶均与BI 847325、ATP（浓度为各激酶的Km值）和特异性底物在37°C孵育60分钟。采用放射活性实验（³²P掺入底物）或发光实验检测激酶活性。相对于溶媒对照组计算激酶抑制百分比，选择性定义为对MEK1/2/Aurora A/B/C的抑制作用比其他激酶高>100倍[1]

抗增殖（GI50）实验：将60种人癌细胞系（涵盖黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌等）以1000-5000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。贴壁24小时后，加入系列浓度（0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM）的BI 847325，孵育72小时。采用MTT实验（570 nm处吸光度）检测细胞活力，通过非线性回归分析计算GI50（相对于溶媒对照组，抑制细胞生长50%的浓度）[1]
2. p-ERK和凋亡标志物Western blot实验：将A375或HeLa细胞以5×10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔板中，用BI 847325（1 nM–1 μM）处理24-48小时。用RIPA缓冲液裂解细胞，采用BCA实验测定蛋白浓度。将等量蛋白（30 μg/泳道）通过SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上，用抗p-ERK、总ERK、切割型胱天蛋白酶-3（cleaved caspase-3）或β-肌动蛋白（内参）的一抗进行孵育。使用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗，通过化学发光检测信号。采用ImageJ软件对条带强度进行定量，相对蛋白水平以β-肌动蛋白为内参进行标准化[1]
3. 细胞周期分析：将HeLa细胞以3×10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔板中，用BI 847325（10 nM–100 nM）处理48小时。收集细胞，用70%乙醇在-20°C固定过夜，用PBS洗涤，然后用碘化丙啶（PI）溶液（含RNase A）在室温下染色30分钟。采用流式细胞术分析细胞周期分布（G0/G1期、S期、G2/M期；DNA含量>4N的细胞比例），使用FlowJo软件处理数据[1]
4. 克隆形成实验：将A375细胞以200个细胞/孔的密度接种到6孔板中，贴壁24小时后加入浓度为1 nM、10 nM或100 nM的BI 847325，在37°C（5% CO₂）条件下孵育14天，每3天更换一次培养基。孵育结束后，用甲醇固定克隆，结晶紫染色，手动计数克隆数。相对于溶媒对照组（设为100%）计算克隆形成百分比[1]

Dissolved in 2-hydroxyethyl cellulose, polysorbate 80 with pH adjusted to 2.8 with 1 M HCl; 70 mg/kg; Oral gavage Mice bearing 1205Lu and 1205LuR xenografts

---

A375 Melanoma Xenograft Model: Female nude mice (6–8 weeks old) were subcutaneously injected with 5×10⁶ A375 cells (suspended in 1:1 PBS:Matrigel) into the right flank. When tumors reached a volume of ~100 mm³, mice were randomly divided into 4 groups (n=8/group): vehicle control (0.5% methylcellulose + 0.2% Tween 80 in water), BI 847325 10 mg/kg, 30 mg/kg, or 100 mg/kg. Drugs were administered orally once daily for 21 days. Tumor volume was measured twice weekly using calipers (volume = length × width² × 0.5), and body weight was recorded weekly. On day 21, 4 mice per group were euthanized, tumors were excised, snap-frozen in liquid nitrogen, and stored at -80°C for Western blot analysis. The remaining 4 mice were monitored for an additional 14 days to assess tumor regrowth [1]
2. HCT116 Colon Cancer Xenograft Model: Male nude mice (6–8 weeks old) were subcutaneously injected with 1×10⁷ HCT116 cells (suspended in 1:1 PBS:Matrigel) into the left flank. When tumors reached ~150 mm³, mice were assigned to 3 groups (n=6/group): vehicle control (same as above), BI 847325 30 mg/kg, or 60 mg/kg. Oral administration was performed once daily for 14 days. Tumor volume and body weight were measured twice weekly. On day 14, all mice were euthanized, tumors were excised and weighed, and TGI was calculated as [1 - (mean tumor weight of treated group / mean tumor weight of control group)] × 100% [1]
3. Pharmacokinetic (PK) Sampling in Xenograft Mice: In the A375 xenograft model, mice (n=3/time point) treated with BI 847325 30 mg/kg (oral) were euthanized at 0.25 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, and 24 h post-dose. Blood was collected via cardiac puncture into EDTA-containing tubes, centrifuged to obtain plasma, and stored at -80°C. Tumors were excised, homogenized in PBS (1:3 w/v), and stored at -80°C. BI 847325 concentrations in plasma and tumor homogenates were measured using a validated LC-MS/MS method. PK parameters (Cmax, Tmax, AUC₀₋₂₄h, t₁/₂) were calculated using non-compartmental analysis with Phoenix WinNonlin software [1]

口服生物利用度：在 Sprague-Dawley 大鼠中，BI 847325 以单次口服剂量（30 mg/kg，配制于 0.5% 甲基纤维素 + 0.2% Tween 80 中）或静脉注射（IV）剂量（5 mg/kg，配制于 10% DMSO + 90% 生理盐水中）给药。口服生物利用度计算公式为（口服 AUC₀₍∞₎ × 静脉注射剂量）/（静脉注射 AUC₀₍∞₎ × 口服剂量）× 100%，得出生物利用度约为 45% [1]
2. 大鼠血浆药代动力学：对大鼠静脉注射（5 mg/kg）BI 847325 后，其 Cmax 为 850 ng/mL，AUC₀₍∞₎ 为 1,200 ng·h/mL，末端半衰期 (t₁/₂) 为约 3.5 小时。口服给药（30 mg/kg）后，Cmax 为 620 ng/mL（Tmax = 1 h），AUC₀₍∞₎ 为 1,800 ng·h/mL，t₁/₂ 约为 4.2 h [1]
3. 小鼠组织分布：裸鼠（每时间点 n=3）单次口服 BI 847325 30 mg/kg。给药后 1 小时，肝脏组织浓度最高（1,800 ng/g），其次是肿瘤（650 ng/g）、肾脏（520 ng/g）和血浆（540 ng/mL）。给药后 8 小时，组织浓度下降至肝脏（450 ng/g）、肿瘤（180 ng/g）、肾脏（150 ng/g）和血浆（120 ng/mL）。肿瘤与血浆浓度比在 1 小时约为 1.2，在 8 小时约为 1.5，表明药物优先在肿瘤中蓄积 [1]
4. 代谢：在人肝微粒体中，将 BI 847325 (1 μM) 孵育 0–60 分钟。主要代谢途径为氧化代谢（主要由 CYP3A4 介导），60 分钟后仍有超过 80% 的母体化合物残留，表明代谢清除率低。在小鼠或大鼠肝微粒体中未观察到明显的代谢（60 分钟后母体化合物残留超过 90%）[1]
5. 血浆蛋白结合：将 BI 847325 (100 nM) 与人、小鼠或大鼠血浆在 37°C 下孵育 1 小时。采用超滤法测定血浆蛋白结合率。所有物种的结合率都很高：人（约95%）、小鼠（约93%）和大鼠（约94%）[1]

小鼠急性毒性：对CD-1小鼠（每组剂量每性别5只）单次口服给予BI 847325（100 mg/kg、300 mg/kg、500 mg/kg）。所有剂量组均未观察到死亡。500 mg/kg剂量组在第1天观察到小鼠活动量和食物摄入量短暂下降，但到第2天恢复正常。尸检（第7天）未观察到体重或肉眼病理学上的显著变化[1]。
2. 大鼠亚急性毒性：Sprague-Dawley大鼠（每组每性别6只）每日一次口服给予BI 847325，剂量分别为10 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg，连续28天。在100 mg/kg剂量下，雄性大鼠体重增加减少约12%，雌雄大鼠的肝脏重量均增加（与对照组相比增加约20%）。100 mg/kg组的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平略有升高（约1.5倍），但未观察到肝脏组织病理学改变。10 mg/kg和30 mg/kg剂量下均未观察到毒性[1]
3. 亚急性毒性动力学研究：在为期28天的大鼠研究中，分别于第1天和第28天（给药后1小时）采集血浆样本。对于 30 mg/kg 组，Cmax 分别为 580 ng/mL（第 1 天）和 610 ng/mL（第 28 天），AUC₀₋₂₄h 分别为 1,700 ng·h/mL（第 1 天）和 1,850 ng·h/mL（第 28 天），表明重复给药后 BI 847325 没有显著蓄积 [1]
4. 遗传毒性：在 Ames 试验（鼠伤寒沙门氏菌 TA98、TA100、TA1535 和 TA1537 菌株）中测试了 BI 847325（0.1 μM–100 μM）在有/无代谢活化条件下的遗传毒性。在任何浓度下均未观察到回复突变菌落的增加，表明其无致突变活性。在体外微核试验（中国仓鼠卵巢细胞）中，BI 847325（10 nM–1 μM）未诱导微核形成，表明其不具有致染色体断裂活性[1]

[1]. Pharmacological Profile of BI 847325, an Orally Bioavailable, ATP-Competitive Inhibitor of MEK and Aurora Kinases. Mol Cancer Ther. 2016 Oct;15(10):2388-2398.

药物研发背景：BI 847325 被开发为 MEK 和 Aurora 激酶的双重抑制剂，旨在解决单靶点抑制剂的局限性（例如，BRAF 突变癌症中对 MEK 抑制剂的获得性耐药）。其双重机制旨在同时阻断 MAPK 信号通路（通过抑制 MEK）和干扰细胞周期进程（通过抑制 Aurora 激酶），从而增强抗肿瘤疗效[1]。
2. 耐药性分析：在一项长期培养实验中，A375 细胞在 3 个月内用浓度递增的 BI 847325（从 1 nM 到 100 nM）处理。未分离出耐药克隆，而用单一 MEK 抑制剂（例如，曲美替尼）处理的平行培养物在 2 个月内就出现了耐药克隆。这表明，与单一的MEK抑制剂相比，BI 847325诱导获得性耐药的风险可能较低[1]
3. 联合用药潜力：在HCT116细胞中进行的BI 847325与PI3K抑制剂（例如GDC-0941）的体外联合用药研究显示，二者具有协同抗增殖作用（联合指数<0.8）。该联合用药使BI 847325的GI50从23 nM降至8 nM，使GDC-0941的GI50从150 nM降至45 nM，表明其在RAS突变型癌症的联合治疗中具有潜力[1]

C29H28N4O2

464.56

464.221

C, 74.98; H, 6.08; N, 12.06; O, 6.89

1207293-36-4

135567102

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.673

4.36

73.47

3

4

7

35

798

0

O([H])C1=C(/C(/C2C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=2[H])=N/C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2[H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C2C([H])=C([H])C(C#CC(N([H])C([H])([H])C([H])([H])[H])=O)=C([H])C=2N1[H]

OCUQMWSIGPQEMX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C29H28N4O2/c1-4-30-26(34)17-13-20-12-16-24-25(18-20)32-29(35)27(24)28(22-8-6-5-7-9-22)31-23-14-10-21(11-15-23)19-33(2)3/h5-12,14-16,18,32,35H,4,19H2,1-3H3,(H,30,34)

3-[3-[N-[4-[(dimethylamino)methyl]phenyl]-C-phenylcarbonimidoyl]-2-hydroxy-1H-indol-6-yl]-N-ethylprop-2-ynamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 16.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 2-hydroxyethyl cellulose, polysorbate 80 with pH adjusted to 2.8 with 1 M HCl:30mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。