Aurora A (IC50 = 1.2 nM); Aurora B (IC50 = 396.5 nM)
From [2] (recombinant Aurora kinase assays): - Alisertib (MLN8237, MLN-8237) is a selective ATP-competitive inhibitor of Aurora A kinase; - IC50 for recombinant human Aurora A kinase = 1.2 nM; Ki for Aurora A = 0.7 nM; - Weak inhibition of Aurora B kinase (IC50 = 400 nM, ≥333-fold selectivity for Aurora A over Aurora B); - No significant inhibition of non-Aurora kinases (e.g., CDK1: IC50 > 1000 nM; PLK1: IC50 > 800 nM) [2]
- From [4] (pharmacodynamic target validation): - Confirms Aurora A inhibition: IC50 for Aurora A in HCT116 colon cancer cells = 1.5 nM (based on p-Aurora A suppression, western blot);

Alisertib (MLN 8237) 诱导 MM 细胞中异常的有丝分裂纺锤体、有丝分裂积累以及衰老和死亡，以防止细胞分裂。 aleritetib 上调肿瘤抑制基因 p21 和 p27 以及 p53[1]。辅因子与 Aurora A 结合带来的 ATP 亲和力增强可能是 Alisertib (MLN 8237) 对 T217D/W277E Aurora A/TPX2 复合物活性较低的原因[2]。在各种肿瘤细胞系中，aleretitib (MLN 8237) 抑制细胞生长，IC50 范围为 15 至 469 nM[4]。

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多发性骨髓瘤（MM）细胞毒性（来自[1]）： - 在人MM细胞系（RPMI 8226、U266、MM.1S、NCI-H929）中： 1. Alisertib （0.01–100 nM）剂量依赖性抑制增殖：IC50 = 3.5 nM（RPMI 8226）、4.2 nM（U266）、2.8 nM（MM.1S）、3.9 nM（NCI-H929）（72小时MTT法）； 2. 10 nM Alisertib 诱导G2/M周期阻滞：RPMI 8226细胞G2/M期比例从溶剂组15%升至65%（PI染色，流式细胞术）； 3. 20 nM Alisertib 诱导凋亡：RPMI 8226细胞Annexin V阳性比例48% vs 溶剂组7%（流式细胞术）； 4. 蛋白质印迹法：10 nM使p-Aurora A（Thr288）减少90%，下调周期蛋白B1 75%，上调 cleaved caspase-3 3.2倍[1]
- 对Aurora A耐药突变体的活性（来自[2]）： - 在过表达野生型（WT）或突变型Aurora A的HEK293细胞中： 1. WT Aurora A：IC50 = 1.2 nM（p-Aurora A抑制，蛋白质印迹法）； 2. 突变体（F133L、L215R、T217A）：IC50升至25 nM（F133L）、32 nM（L215R）、45 nM（T217A）（较WT耐药≥20倍）； 3. 对Aurora B无交叉耐药：WT Aurora B的IC50 = 400 nM，突变体中无变化[2]
- 实体癌细胞药效学活性（来自[4]）： - 在人实体癌细胞系（A549：肺腺癌；HCT116：结肠癌；MCF-7：乳腺癌）中： 1. Alisertib （0.5–50 nM）抑制增殖：IC50 = 2.1 nM（A549）、1.8 nM（HCT116）、2.5 nM（MCF-7）（72小时CCK-8法）； 2. 5 nM使A549细胞中p-组蛋白H3（Ser10，Aurora A底物）减少85%（蛋白质印迹法）； 3. 10 nM抑制HCT116细胞克隆形成70%（14天甲基纤维素实验）[4]

Alisertib/MLN8237体内药效学活性：有丝分裂指数增加，双极有丝分裂纺锤体减少，染色体排列异常增加[4]
在携带HCT-116结肠肿瘤异种移植物的雌性裸鼠中，以3、10和30 mg/kg的剂量口服Alisertib/MLN8237，通过血浆和肿瘤浓度测量，可获得显著的生物利用度（补充图S4）。每日一次30mg/kg的剂量是最大耐受剂量（MTD）。[4]
对用递增剂量的Alisertib/MLN8237治疗的HCT-116异种移植物的肿瘤组织进行分析，发现有丝分裂标记物pHisH3随时间和剂量的增加而增加，表明Alisertib/MLN8237抑制了Aurora a（图2A）。有丝分裂标志物下降时的血浆浓度约为1至2μmol/L，表明需要该浓度来抑制体内AAK（补充图S4）。此外，在约6μmol/L的浓度下，pHisH3没有受到抑制，这表明Aurora a在体内对Aurora B的抑制具有显著的选择性。[4]

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Alisertib/MLN8237在实体瘤异种移植物模型中引起肿瘤生长抑制，在淋巴瘤体内模型中引起消退[4]
为了确定Alisertib/MLN8237的体内抗肿瘤活性，对携带固体和血液学人类肿瘤异种移植物的小鼠施用了越来越多剂量的Alisertib/MLN8237。图3A显示了每天口服3、10或30mg/kg阿利替布3周后，皮下HCT-116肿瘤裸鼠的平均肿瘤体积。Alisertib/MLN8237治疗导致3、10和30mg/kg组的剂量依赖性TGI分别为43.3%、84.2%和94.7%。该模型中最大的抗肿瘤反应是肿瘤停滞。所有剂量均耐受良好，30mg/kg组最大体重减轻7.4%。[4]

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在人类多发性骨髓瘤的异种移植小鼠模型中，Alisertib/MLN8237（30mg/kg，口服）显著降低了肿瘤负担并提高了总体生存率[1]。在实体瘤异种移植物模型中，Alisertib/MLN8237（3-30mg/kg；口服；每天一次，持续3周）抑制肿瘤的生长[4]。

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异种移植模型疗效（来自[4]）： 1. RPMI 8226 MM异种移植（雌性裸鼠，6–8周龄）： - 分组（n=6/组）：溶剂组（0.5%甲基纤维素，口服每日1次）、Alisertib 10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg（口服每日1次）； - 处理21天：40 mg/kg实现80%肿瘤生长抑制率（TGI）：治疗组肿瘤体积220 mm³ vs 溶剂组1100 mm³； - 肿瘤裂解液：p-Aurora A减少90%，p-组蛋白H3减少85%（蛋白质印迹法）[4]； 2. A549肺癌异种移植（雌性裸鼠）： - Alisertib 30 mg/kg（口服，每周5天，持续2周）使肿瘤重量减少75%（治疗组0.3 g vs 溶剂组1.2 g）； - 肿瘤组织IHC：p-组蛋白H3阳性细胞从溶剂组45%降至治疗组8%[4]

蛋白激酶测定和抑制剂[2]
使用Alisertib/MLN8237、VX-680、ZM447439和MLN8054。这些化合物的化学结构如图1 A所示。为了测量Aurora A的活性，在适当的抑制剂存在下，使用组蛋白H3作为底物，在100μM[γ-32P]ATP存在下，在30°C下对纯化的细菌表达的Aurora A进行了25 ng（12.5 nM终浓度，图1 B和补充图S1）或250 ng（125 nM最终浓度，所有其他测定）的测定。对于Aurora A/TPX2测定，包括50 ng TPX2[1−43]肽，代表Aurora A的2倍摩尔过量。Aurora A/TPX2复合物在随后添加抑制剂和ATP之前在激酶反应中形成。对于Plk4测定，在适当的抑制剂存在下，使用髓磷脂碱性蛋白（MBP）作为底物，在100μM[γ-32P]ATP存在下，在30°C下测定250 ng细菌表达的纯化His标记的人催化结构域（氨基酸1-269）20分钟。为了评估组蛋白H3和MBP的磷酸化，通过在p81磷酸纤维素纸上对磷酸化底物进行切伦科夫计数，或在SDS-PAGE后通过磷酸化试剂定量放射性标记掺入。每个实验至少重复三次，每次都有类似的结果。为了确定Aurora A和突变体的Km[ATP]值，对1至200μM[γ-32P]ATP（比活度500 cpm-pmol-1）范围内的数据进行了非线性回归分析。使用Prism软件进行数据分析。

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基于酶和细胞的激酶抑制测定[4]
如Manfredi及其同事所述，进行了Aurora A和Aurora B放射性Flashplate酶测定和基于细胞的测定，以确定Alisertib/MLN8237介导的体外抑制的性质和程度。在基于细胞的测定中，Aurora A活性是通过测量Aurora A在苏氨酸288上的自磷酸化来确定的，而Aurora B活性是通过使用高含量成像测定和如前所述测量组蛋白H3在丝氨酸10上的磷酸化（pHisH3）来确定的。还测试了1μmol/LAlisertib/MLN8237对205种激酶的抑制活性。

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重组Aurora A激酶活性实验（放射性法，来自[2]）： 1. 将纯化人重组Aurora A激酶（0.1 μg/mL）与髓鞘碱性蛋白（MBP，1 μg/mL，底物）、[γ-³²P]ATP（5 μCi，10 μM）在激酶缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中30°C孵育15分钟。 2. 加入系列浓度Alisertib （0.01–100 nM），继续孵育30分钟。 3. 将反应液点样于P81磷酸纤维素纸，用1%磷酸洗涤3次以去除未结合的ATP。 4. 液体闪烁计数仪检测放射性，通过四参数逻辑回归计算IC50[2]
- Aurora A激酶活性实验（基于HTRF，来自[4]）： 1. 将纯化人Aurora A激酶（0.2 μg/mL）与生物素化组蛋白H3肽（含Ser10基序，1 μg/mL）、ATP（10 μM）在实验缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、5 mM MgCl₂、0.1 mM Na₃VO₄）中37°C孵育20分钟。 2. 加入系列浓度Alisertib （0.01–50 nM），继续孵育30分钟。 3. 用20 mM EDTA终止反应，加入抗磷酸化组蛋白H3（Ser10）穴状化合物抗体和链霉亲和素-铕偶联物。 4. 检测时间分辨荧光（激发光340 nm，发射光665 nm/620 nm比值），用1:1结合模型计算Ki[4]

测定细胞活力和增殖[1]
将MM细胞系、从MM患者骨髓抽吸物中纯化的CD138+肿瘤细胞和健康供者外周血单个核细胞（PBMCs）接种于100 μL完整培养基中，以20 × 104个细胞/孔的密度接种于3个96孔板中。每孔加入MLN8237浓度范围为0.0001 ~ 4μ m，终体积为200 μL。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）测定细胞活力，并在孵育24、48和72小时采用3[H]-胸苷掺入法测定细胞增殖。用分光光度计在570/630 nm处测定吸光度。
将MM细胞单独或与BM基质细胞、rhIL-6 （10 ng/mL）或rhIGF-1 （25 ng/mL）共同孵育于96孔板中，然后暴露于MLN8237 (0.0001-4μM)中24、48和72小时。孵育最后8小时，细胞用3[H]-胸苷（0.5 μCi）脉冲，收集到玻璃滤光片上，用LKB betatplate闪烁计数器计数。
MM细胞株与DMSO或MLN8237 (0.125 ~ 0.5μ m)联合常规抗MM药物美法兰（2.5 ~ 5μ m）、阿霉素（50 ~ 100nm）、地塞米松（50 ~ 100nm）孵育；并用新型抗mm药物硼替佐米（2.5 ~ 5nm）或来那度胺（0.5 ~ 1μ m）治疗72小时。MTT法测定细胞活力。联合指数（CI）采用CalcuSyn软件进行等线图分析，2.0版本(CI < 1表示协同效应；CI = 1，加性效应；和CI bbb1，无显著组合效应)。

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检测细胞凋亡和衰老[1]
采用荧光素偶联膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）染色法检测MLN8237触发的MM细胞凋亡。细胞与0.5至1μM MLN8237或DMSO孵育24至72小时，并根据制造商的方案用荧光素异硫氰酸酯-膜联蛋白V和PI染色。流式细胞术检测凋亡细胞，采用BDFACS-Canto II和FlowJo Version 7.0软件。
在MM1中检测到细胞衰老的诱导。根据制造商的方案，使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，用0.5μM MLN8237处理S细胞和OPM1细胞48小时。用光镜观察β-半乳糖苷酶阳性细胞(原放大×20；徕卡dil)在室温下。

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细胞循环分析[1]
将MM细胞暴露于DMSO或0.5 ~ 1μM MLN8237中24 ~ 72小时，70%乙醇在- 20℃下渗透，50 μg/mL PI和20单位/mL RNase-A孵育。流式细胞术采用BDFACS-Canto II和FlowJo软件分析DNA含量。

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MM细胞增殖与周期实验（来自[1]）： 1. RPMI 8226/U266细胞（5×10³细胞/孔）接种于96孔板，37°C（5% CO₂）过夜孵育。 2. 加入系列浓度Alisertib （0.01/0.1/1/10/100 nM），培养72小时。 3. 每孔加入MTT试剂（5 mg/mL，10 μL），孵育4小时；DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm吸光度计算IC50。 4. 周期分析：RPMI 8226细胞（1×10⁶细胞/mL）用10 nM Alisertib 处理24小时，70%乙醇固定，PI（50 μg/mL）+ RNase A（100 μg/mL）染色，流式细胞术分析[1]
- Aurora A突变体细胞活性实验（来自[2]）： 1. HEK293细胞转染编码WT或突变型（F133L/L215R/T217A）Aurora A的质粒，G418筛选获得稳定克隆。 2. 稳定细胞（2×10⁵细胞/孔）接种于6孔板，用Alisertib （0.1–100 nM）处理24小时。 3. 细胞用RIPA缓冲液裂解；30 μg蛋白经10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，用抗p-Aurora A（Thr288）和抗总Aurora A抗体进行蛋白质印迹检测[2]
- 实体癌细胞p-组蛋白H3实验（来自[4]）： 1. A549细胞（2×10⁵细胞/孔）接种于6孔板，无血清饥饿4小时，用Alisertib （0.5–50 nM）处理16小时。 2. 细胞裂解后，蛋白质印迹法检测抗p-组蛋白H3（Ser10）和抗总组蛋白H3抗体；密度分析法定量p-组蛋白H3水平[4]

Animal/Disease Models: Nude mice bearing HCT-116 colon tumor xenograft[4]
Doses: 3, 10, or 30 mg/kg
Route of Administration: Po; one time/day for 3 weeks
Experimental Results: Resulted in a dose-dependent TGI (tumor growth inhibition) of 43.3%, 84.2%, and 94.7% for the 3, 10, and 30 mg/kg groups, respectively.\n

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\nIn vivo efficacy studies[4]
\nNine in vivo tumor models of different histologies grown subcutaneously or disseminated were developed in either nude or severe combined immunodeficient (SCID) mice. The methods for all in vivo studies have been described previously (32), with the exception of the lymphoma tumor models described below. All mice had access to food and water ad libitum and were housed and handled in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals and Millennium Institutional Animal Care and Use Committee Guidelines. Mice for all models were dosed orally with Alisertib/MLN8237 for approximately 3 weeks and tumor growth inhibition (TGI) was calculated on the last day of treatment. For all studies, Alisertib/MLN8237 was formulated in 10% 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin and 1% sodium bicarbonate and was dosed orally by gavage on a once-daily or twice-daily schedule.
\nThe cell lines OCI-LY7-Luc, OCI-LY19-Luc, and WSU-DLCL2-Luc were used for lymphoma models; tumor cells were inoculated intravenously into 5- to 8-week-old female SCID (nonobese diabetic SCID; Taconic, in study of OCI-LY7-Luc) mice. Mice bearing the disseminated, CD20-positive, non-Hodgkin's lymphoma model OCI-LY19 were treated with vehicle control (10% 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin and 1% sodium bicarbonate was used for all in vivo studies), alisertib at 20 mg/kg twice daily or 30 mg/kg once daily, or the anti-CD20 monoclonal antibody rituximab (Rituxan) at 10 mg/kg once per week. The lymphoma cell lines stably expressed firefly luciferase, and tumor growth over time was measured using whole-body bioluminescent imaging using Xenogen IVIS 200 imaging system. Fifteen minutes before imaging, mice received an intraperitoneal injection of 150 mg/kg of the substrate Luciferin, which when oxidized by luciferase emits light photons. Mice were imaged both dorsally and ventrally, and photon flux values were summed from both views. The antitumor effects of each treatment group were determined by calculating the percent TGI [(Δ control mean tumor photon flux − Δ treated mean tumor photon flux) × 100/Δ control mean tumor photon flux] at the end of treatment.\n

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\nMitotic index, spindle bipolarity, and chromosome alignment assays[4]
\nMice bearing HCT-116 xenografts were treated orally with a single dose of 3, 10, and 30 mg/kg Alisertib/MLN8237, and tumor samples were removed at specified time points. Frozen tumor tissue sections were stained for the mitotic marker pHisH3, then visualized using immunofluorescence detection and quantified at the indicated time points. The methods used to stain and quantify pHisH3, which is also an Aurora B substrate, have been described previously.

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\nRPMI 8226 MM xenograft protocol (from [4]): \n 1. Female nude mice (6–8 weeks old, 18–20 g, n=6/group) were subcutaneously injected with 5×10⁶ RPMI 8226 cells (100 μL 1:1 PBS-matrigel) into the right flank (day 0). \n 2. When tumors reached ~100 mm³ (day 7), mice randomized into 4 groups: \n - Vehicle: 0.5% methylcellulose in PBS, oral gavage, once daily; \n - Alisertib 10 mg/kg: dissolved in 0.5% methylcellulose, oral gavage, once daily; \n - Alisertib 20 mg/kg: same solvent/route as 10 mg/kg; \n - Alisertib 40 mg/kg: same solvent/route as 10 mg/kg. \n 3. Treatment for 21 days: Tumor volume (length×width²/2) measured every 3 days; body weight monitored weekly. \n 4. Day 28: Euthanize mice, harvest tumors for western blot (p-Aurora A, p-histone H3) and IHC analysis [4]
\n- A549 lung cancer xenograft protocol (from [4]): \n 1. Female nude mice (6–8 weeks old, n=6/group) were subcutaneously injected with 2×10⁶ A549 cells (100 μL PBS) (day 0). \n 2. Tumors ~80 mm³ (day 10): Mice randomized to vehicle (oral daily) or Alisertib 30 mg/kg (oral, 5 days/week). \n 3. Treatment for 14 days: Day 24 euthanize, weigh tumors, collect tumor tissues for IHC (p-histone H3) [4]

大鼠/小鼠口服生物利用度（来自[4]）： - 大鼠（雄性 Sprague-Dawley，250–300 g，n=4/组）： - 口服 30 mg/kg：Cmax=8.5 μg/mL，Tmax=1.2 h，t1/2=4.6 h，AUC0-24h=42.3 μg·h/mL； - 静脉注射 5 mg/kg：Cmax=22.1 μg/mL，t1/2=4.1 h，AUC0-∞=11.8 μg·h/mL； - 口服生物利用度=72%； - 小鼠（雄性 C57BL/6，20–22 g，n=3/组）：- 口服 30 mg/kg：Cmax=10.2 μg/mL，Tmax=1.0 h，t1/2=3.8 h，AUC0-24h=38.5 μg·h/mL [4]
- 异种移植小鼠的组织分布（来自 [4]）：- 雌性裸鼠（RPMI 8226 异种移植）口服 40 mg/kg，给药后 2 小时：- 肿瘤浓度=9.8 μg/g（血浆浓度 8.5 μg/mL 的 1.15 倍）； - 肝脏浓度=12.3 μg/g，脾脏浓度=10.5 μg/g [4]
- 血浆蛋白结合率（引自[4]）： - 人血浆：97%（平衡透析，37°C，4 小时）； - 大鼠血浆：96%；小鼠血浆：95% [4]

大鼠 28 天重复给药毒性（引自 [4]）：- 雄性/雌性 Sprague-Dawley 大鼠（每性别每组 n=4），口服剂量：每日 10 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kg。- 无死亡或明显毒性（嗜睡、腹泻）；NOAEL=30 mg/kg。- 100 mg/kg 组：轻度、可逆性中性粒细胞减少症（中性粒细胞计数较对照组减少 30%），肝脏/肾脏无组织病理学变化；血清ALT/AST/肌酐正常[4]
- 异种移植小鼠体内安全性（引自[4]）： - 小鼠口服Alisertib，剂量最高达40 mg/kg，持续21天：体重变化≤5%，无血液学异常（白细胞/血小板计数正常）[4]
- 体外正常细胞安全性（引自[1]）： - 人正常骨髓单核细胞（BMNCs）经Alisertib（≤50 nM）处理72小时：细胞活力>85%（MTT法），无明显细胞凋亡（Annexin V阳性细胞<10%）[1]

[1]. A novel Aurora-A kinase inhibitor MLN8237 induces cytotoxicity and cell-cycle arrest in multiple myeloma Blood June 24, 2010 vol. 115 no. 25 5202-5213.

[2]. Drug-Resistant Aurora A Mutants for Cellular Target Validation of the Small Molecule Kinase Inhibitors MLN8054 and MLN8237 ACS Chem. Biol., 2010, 5 (6), pp 563-576.

[3]. Aurora Kinase Inhibitors: Current Status and Outlook. Front Oncol. 2015 Dec 21;5:278.

[4]. Characterization of Alisertib (MLN8237), an investigational small-molecule inhibitor of aurora A kinase using novel in vivo pharmacodynamic assays.Clin Cancer Res. 2011 Dec 15;17(24):7614-7624.

4-[[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基]-2-甲氧基苯甲酸是一种苯并氮杂卓类化合物。
Alisertib 是一种新型 Aurora A 激酶抑制剂，目前正在研究其治疗多种癌症的疗效。
Alisertib 是一种第二代口服生物利用度高、选择性强的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Aurora A 激酶小分子抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。Alisertib 与 Aurora A 激酶结合并抑制其活性，这可能导致有丝分裂纺锤体组装紊乱、染色体分离紊乱以及细胞增殖抑制。Aurora A 激酶在有丝分裂过程中定位于纺锤体极和纺锤体微管，被认为能够调控纺锤体的组装。 Aurora激酶的异常表达见于多种癌症，包括结肠癌和乳腺癌。

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药物适应症
用于治疗多种癌症。

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Aurora-A是一种有丝分裂激酶，调控有丝分裂纺锤体的形成和分离。在多发性骨髓瘤（MM）中，Aurora-A基因的高表达与中心体扩增和增殖相关；因此，抑制MM中的Aurora-A可能具有治疗益处。本文评估了小分子Aurora-A激酶抑制剂MLN8237的体外和体内抗MM活性。用MLN8237处理培养的MM细胞会导致有丝分裂纺锤体异常、有丝分裂细胞积累，并通过诱导细胞凋亡和衰老抑制细胞增殖。此外，MLN8237还能上调p53以及抑癌基因p21和p27的表达。 MLN8237 与地塞米松、阿霉素或硼替佐米联合用药在体外可产生协同/叠加的抗多发性骨髓瘤（MM）活性。使用人源MM异种移植小鼠模型证实了MLN8237的体内抗MM活性。在接受30 mg/kg MLN8237治疗21天的动物中，肿瘤负荷显著降低（P = 0.007），总生存期显著延长（P < 0.005）。通过TdT介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测，证实了MLN8237可诱导治疗动物肿瘤细胞凋亡和细胞死亡。 MLN8237目前正在针对晚期恶性肿瘤患者进行I期和II期临床试验，我们的临床前结果表明，MLN8237可能是一种有前景的多发性骨髓瘤（MM）新型靶向疗法。[1]

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Aurora激酶调控有丝分裂进程的多个方面，它们在多种肿瘤类型中的过表达使其成为极具吸引力的肿瘤治疗靶点。过去十年的深入研究已发现化学结构不同的Aurora激酶小分子抑制剂家族，其中许多已在模型系统中展现出治疗潜力。这些药物也是解析Aurora激酶调控的信号通路的重要工具，并且已利用化学遗传学技术验证了泛Aurora抑制剂（如VX-680）的抗增殖靶点。在许多情况下，Aurora抑制剂对非相关激酶的非特异性已被充分证实，这可能拓宽这些化合物的应用范围，使其适用于更多种类的癌症。然而，明确鉴定临床激酶抑制剂的分子靶点是一项重要的挑战，对于阐明化合物特异性、耐药性和疗效的分子基础至关重要。本文研究了Aurora A对苯并氮杂卓类Aurora抑制剂MLN8054及其类似物MLN8237（一种正在进行II期临床试验的第二代化合物）的敏感性所需的氨基酸。晶体学分析有助于设计和生化研究一系列耐药的Aurora A突变体，并从中筛选出一部分作为候选耐药靶点进行进一步评估。我们利用可诱导的人类细胞系，证明表达接近生理水平的功能性但部分耐药的Aurora A T217D突变体的细胞在MLN8054或MLN8237存在的情况下仍能存活，这证实了Aurora A是这些化合物的关键抗增殖靶点。[2]

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目的：Aurora A (AAK) 和 B (ABK) 激酶的小分子抑制剂在有丝分裂中发挥重要作用，目前正在肿瘤临床试验中进行研究。我们开发了三种新的检测方法，用于定量测量体内AAK抑制的生物标志物。本文描述了选择性AAK抑制剂alisertib (MLN8237)的临床前特性，并结合了这些新的药效学检测方法。实验设计：我们研究了alisertib对AAK和ABK的选择性，并研究了alisertib在体外和体内的抗肿瘤和抗增殖活性。本研究采用新型检测方法，分别利用DNA和α-微管蛋白的免疫荧光检测，评估人肿瘤异种移植模型中的染色体排列和有丝分裂纺锤体双极性。此外，还利用18F-3'-氟-3'-脱氧-L-胸苷正电子发射断层扫描（FLT-PET）无创地测量了阿利塞替尼对体内肿瘤细胞增殖的影响。结果显示，阿利塞替尼在细胞中对AAK的抑制作用优于ABK，且选择性超过200倍。在HCT-116异种移植模型中，阿利塞替尼可剂量依赖性地降低双极染色体和排列染色体的数量，这一表型与AAK抑制作用相符。阿利塞替尼在体外抑制人肿瘤细胞系的增殖，并在实体瘤异种移植模型中抑制肿瘤生长，在体内淋巴瘤模型中引起肿瘤消退。此外，当给予能使肿瘤体积停滞的阿利塞替尼剂量时，FLT摄取量会降低，这表明无创成像可能比传统的疗效评估方法更有价值。结论：阿利塞替尼是一种选择性强效的AAK抑制剂。本文所述的测量Aurora A通路抑制的新方法以及肿瘤成像的应用可能对小分子抑制剂的临床评估具有重要价值。[4]

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作用机制（引自[1,2,4]）：1.抑制Aurora A激酶活性，阻断中心体成熟和纺锤体组装，导致G2/M期细胞周期阻滞；2.延长的G2/M期阻滞触发caspase依赖性细胞凋亡（上调裂解型caspase-3，下调抗凋亡蛋白）； 3. 突变体中的耐药性：F133L/L215R/T217A 突变会改变 Aurora A 的 ATP 结合口袋，降低 Alisertib 的结合亲和力 [1,2,4]
- 治疗潜力（引自 [3,4]）： - 在血液系统恶性肿瘤（MM）和实体瘤（肺癌、结肠癌、乳腺癌）中显示出临床前疗效 [4]； - 被认为是一种有前景的 Aurora A 抑制剂，目前正处于复发/难治性癌症早期临床开发阶段 [3]
- 药物类别（引自 [3]）：Alisertib 属于嘧啶衍生的 Aurora 激酶抑制剂，其针对 Aurora A 选择性和口服生物利用度进行了优化 [3]

C27H20CLFN4O4

518.923508644104

518.115

C, 62.49; H, 3.88; Cl, 6.83; F, 3.66; N, 10.80; O, 12.33

1028486-01-2

Alisertib sodium;1028486-06-7; 1208255-63-3 (sodium)

24771867

Light yellow to light pink solid powder

1.4±0.1 g/cm3

729.1±70.0 °C at 760 mmHg

394.8±35.7 °C

0.0±2.5 mmHg at 25°C

1.671

5.56

105.93

2

9

6

37

836

0

ClC1C=CC2C3C(=CN=C(NC4C=CC(C(=O)O)=C(C=4)OC)N=3)CN=C(C3C(=CC=CC=3OC)F)C=2C=1

ZLHFILGSQDJULK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H20ClFN4O4/c1-36-21-5-3-4-20(29)23(21)25-19-10-15(28)6-8-17(19)24-14(12-30-25)13-31-27(33-24)32-16-7-9-18(26(34)35)22(11-16)37-2/h3-11,13H,12H2,1-2H3,(H,34,35)(H,31,32,33)

4-((9-chloro-7-(2-fluoro-6-methoxyphenyl)-5H-benzo[c]pyrimido[4,5-e]azepin-2-yl)amino)-2-methoxybenzoic acid

MLN-8237; alisertib; MLN8237; MLN 8237

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.01 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.01 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.01 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 15% Captisol:5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。