rNPY Y1 receptor (Ki = 1.1 nM); hNPFF2 (Ki = 79 nM); rNPFF (Ki = 108 nM)
rNPY Y1 (Ki = 1.1 nM) and NPFF receptors (hNPFF2 Ki = 79 nM; rNPFF Ki = 108 nM). Selective over rNPY Y2, Y4, Y5 (Ki > 1000 nM).

在本研究中，研究人员发现，在NPY家族的几种配体中，蛙PP、GR231118和BIBP3226能够竞争性结合CHO细胞以及大鼠背脊髓中表达的特异性NPFF受体。有趣的是，选择性NPY Y1/Y4配体GR231118对NPFF2受体的表观亲和力（Ki=50-70 nM）与其已知的对NPY Y2（Ki=63 nM）和Y5（Ki=100 nM）受体的亲和力相当（Parker等人，1998；表1）。此外，选择性NPY Y1受体拮抗剂BIBP3226对NPFF2受体的表观亲和力（Ki约为100 nM）远高于已报道的NPY Y2、Y4和Y5受体的亲和力（Schober等人，1998；Dumont等人，2000c和表1）。此外，我们观察到fPP及其截短类似物fPP28-36对NPFF受体具有相对较高的亲和力（Ki=1.5-7 nM）。这可能是由于这些肽的C端存在Arg-Phe-酰胺残基，而非所有哺乳动物胰多肽以及NPY和PYY中常见的Arg-Tyr-酰胺残基。据我们所知，文献中尚无关于fPP对NPY受体亚型亲和力的数据。有趣的是，研究人员观察到，BIBP3226和fPP对CHO细胞中表达的hNPFF2受体以及大鼠脊髓受体（推测为NPFF2受体亚型；Bonini等人，2000）的亲和力比在HEK 293细胞中表达的人和大鼠NPFF2受体的亲和力高10倍（Bonini等人，2000）。这种明显的差异仍有待解释。[1]接下来，研究人员基于hNPFF2受体转染细胞中的环磷酸腺苷（cAMP）积累测定，研究了fPP、GR231118和BIBP3226的功能特性。有趣的是，fPP和GR231118均表现出激动活性。尽管GR231118的效力比NPY Y4受体的效力低500-1000倍（Parker等人，1998；Schober等人，1998），但与NPY Y2和Y5受体的效力处于同一数量级（Parker等人，1998）。另一方面，Y1受体拮抗剂BIBP3226本身在浓度高达10 μM时无活性，但能够以浓度依赖的方式拮抗NPFF（10 nM）诱导的福斯克林刺激的环磷酸腺苷（cAMP）生成的抑制作用。因此，BIBP3226是首个报道的NPFF2受体拮抗剂，因此可被视为开发更有效的NPFF2受体亚型拮抗剂的先导化合物。[1]

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体外拮抗活性通过置换结合实验得到证实，该化合物对NPY Y1和NPFF受体具有拮抗作用。功能性实验（例如，抑制NPY刺激的[3⁵S]-GTPγS结合或钙动员）表明该化合物能够阻断受体。IC50值未详细说明；rNPY Y1、hNPFF2和rNPFF的Ki值分别为1.1 nM、79 nM和108 nM。

BIBP3226（0.5、5 μg；脑室内注射）在相应剂量下具有类似抗焦虑的作用[1]。本研究探讨了新型非肽类神经肽Y Y1受体拮抗剂BIBP3226，即N2-(二苯乙酰基)-N-[(4-羟基苯基)-甲基]-D-精氨酸酰胺，对大鼠在高架十字迷宫中探索行为的影响。BIBP3226（0.5和5 μg，脑室内注射）在较高剂量下诱导了类似焦虑的作用。地西泮（0.5 mg/kg）可拮抗这种作用。BIBP3226的类似焦虑的作用与一般运动活性的降低无关。这些发现支持了神经肽Y Y1受体亚型参与焦虑调节的假设。 [2]

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本研究旨在探讨BIBP3226对探索行为的影响，并验证体内阻断神经肽Y Y1受体是否会导致焦虑症状的出现。雄性Wistar大鼠（270-350 g）购自拉脱维亚Grindex公司，饲养于标准实验室条件下，并在侧脑室植入慢性注射导管。行为学实验于术后1周开始。BIBP3226于测试前20分钟脑室内注射，地西泮（0.5 mg/kg）于测试前30分钟腹腔注射。十字迷宫和旷场实验的设计如其他文献所述（Harro等，1990），但在十字迷宫的开放臂上增加了1 cm高的台阶。如表1所示，5 μg剂量的BIBP3226可引起焦虑样效应，而较低剂量则无效。在第二个实验中，我们发现单独使用地西泮（0.5 mg/kg）对探索行为参数无影响，但该剂量却完全阻断了神经肽Y Y1受体拮抗剂的焦虑样效应。十字迷宫测试结束后，立即对大鼠进行4分钟的旷场测试。由于所有处理组的总体运动活性相似（数据未显示），因此BIBP3226的焦虑特性及其与地西泮的拮抗作用不能解释为例如神经毒性作用导致的总体运动活性变化。在第二个实验中，腹腔注射先于脑室内注射时，动物的总体活动量更高。在测试之前，如果动物受到处理或接触其他刺激，则可能会出现探索行为的增加（Hogg，1996）。[2]

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脑室内（icv）注射5微克BIBP3226后，大鼠出现类似焦虑的效应。较低剂量无效。标准参考文献中未详细列出具体的体内心血管或内分泌数据；NPY Y1拮抗剂预计会调节血管收缩、摄食行为和焦虑。

转染的HEK 293细胞培养于添加10%胎牛血清和两性霉素B的Dulbecco改良Eagle培养基中。所有NPY结合实验均按先前描述的方法进行（Dumont等，2000a）。[1]表达人NPFF2受体的重组CHO细胞培养于添加7%胎牛血清和400 μg ml⁻¹ G418的Ham's F12培养基中。为制备细胞膜，将细胞收集于磷酸盐缓冲液中，于-70°C冷冻保存，并在Potter-Elvehjem组织研磨器中用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）匀浆。通过在 4°C 下以 1000×g 离心 15 分钟去除核沉淀，并将上清液在 4°C 下以 100,000×g 离心 30 分钟收集膜组分。采用快速过滤法测定 [125I]-EYF ([125I]-EYWSLAAPQRF-NH2)（一种新型 NPFF 受体特异性放射性配体，2000 Ci mmol；Gouardères 等，2001）与表达 hNPFF2 受体的 CHO 细胞膜 (2 μg) 的结合情况，具体方法见 Gouardères 等 (2001) 的描述。在雄性 Sprague-Dawley 大鼠（350 g）脊髓切片中测定 NPFF 受体的结合情况，具体方法与 Gouardères 等 (2001) 的描述完全相同。 [1]
细胞内环磷酸腺苷 (cAMP) 的测定基本按照 (Mollereau et al., 1999) 的方法进行。简而言之，将 20 万个重组细胞在 37°C、5% CO₂ 条件下，于 Ham's F12 培养基中与 0.6 μCi [³H]-腺嘌呤 (26 Ci/mmol Amersham) 孵育 1 小时。在 200 μl HEPES 缓冲的 Krebs-Ringer 盐溶液中，加入 2 μM 福斯克林，于 37°C 下刺激 10 分钟，同时加入 0.1 mM 磷酸二酯酶抑制剂 IBMX 和 Ro-20 1724，以刺激 cAMP 的产生。待测配体同时加入，浓度为所需浓度。加入 20 μl 2.2 N HCl 终止反应，并通过酸性氧化铝柱色谱法分离细胞内 [3H]-环磷酸腺苷。[1]

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放射性配体置换结合试验：将表达重组 rNPY Y1、hNPFF2、rNPFF 或 rNPY Y2/Y4/Y5 受体的细胞膜制备物与 [¹2⁵I] 标记的激动剂（例如 [¹2⁵I]-PYY）和不同浓度的 BIBP3226 TFA 孵育。测量结合的放射性，并使用 Cheng-Prusoff 方程计算 Ki 值。

NPY Y1 功能拮抗剂测定：表达 NPY Y1 受体的细胞加载钙敏感染料。细胞预先用 BIBP3226 TFA 处理，然后用 NPY 刺激；测量细胞内钙离子浓度（FLIPR）。IC50 值根据 NPY 诱导的钙离子内流抑制率计算得出。其他测定方法包括测量 NPY 刺激的 [3⁵S]-GTPγS 结合的抑制率。

动物/疾病模型：雄性Wistar大鼠270-350克[1]
剂量：0.5、5微克
给药途径：脑室内注射
实验结果：5微克剂量可引起焦虑样效应，而较低剂量无效。

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大鼠焦虑模型（脑室内给药）：成年雄性Wistar大鼠（270-350克）经脑室插管后进行脑室内注射。将BIBP3226 TFA（0.5或5微克）注入侧脑室；注射后15-30分钟，通过高架十字迷宫（记录在开放臂停留的时间）或旷场实验评估焦虑样行为。5微克剂量即可产生焦虑样效应。

标准参考文献中未详细列出BIBP3226 TFA的药代动力学数据；作为一种肽类似物，其口服生物利用度可能较低，血浆半衰期较短。脑室内给药是中枢神经系统研究中常用的给药途径，以绕过血脑屏障。TFA盐可能影响其溶解度和稳定性。

毒理学数据：信号词：警告。H302 吞咽有害；H315 造成皮肤刺激；H319 造成严重眼刺激。预防措施：P264 处理后彻底洗手；P270 使用本产品时请勿进食、饮水或吸烟。MSDS 报告了在火灾条件下产生的危险分解产物（有毒烟雾）。

[1]. Agonist and antagonist activities on human NPFF(2) receptors of the NPY ligands GR231118 and BIBP3226. Br J Pharmacol. 2001 May;133(1):1-4.

[2]. Anxiogenic-like effect of the neuropeptide Y Y1 receptor antagonist BIBP3226: antagonism with diazepam. Eur J Pharmacol. 1996 Dec 19;317(2-3):R3-4.

研究结果支持以下假设：内源性神经肽Y可通过激活神经肽Y1受体来缓解新奇恐惧/焦虑。地西泮是一种临床有效的抗焦虑药物，它能拮抗BIBP3226的抗焦虑样作用。这表明神经肽Y的神经传递可能与GABA能系统密切相关。从神经解剖学的角度来看，这种相互作用可能涉及皮层区域，因为许多对神经肽Y具有免疫反应性的皮层神经元也含有GABA（Hendry等，1984）。研究表明，当动物暴露于新环境时，神经元会在高频放电期间释放神经肽Y（Lundberg等，1986）。神经肽Y本身或其他作用于神经肽Y1受体的内源性配体可能对适应新环境和正常探索行为的表达至关重要。因此，使用BIBP3226阻断神经肽Y1受体可能干扰适应过程并导致焦虑的表达。总之，这些结果证实神经肽Y1受体参与调节大鼠的探索行为和/或焦虑。BIBP3226似乎是一种用于研究神经肽Y1受体在情绪过程中作用的有用化合物。[2] 在本研究中，我们发现，在几种NPY家族配体中，蛙PP、GR231118和BIBP3226与CHO细胞和大鼠背脊髓中表达的特定NPFF竞争性结合。有趣的是，选择性NPY Y1/Y4配体GR231118对NPFF2受体的表观遗传亲和力（Ki=50-70 nM）与其已知的对NPY Y2（Ki=63 nM）和Y5（Ki=100 nM）受体的亲和力相当（Parker等人，1998；表1）。此外，选择性NPY Y1受体拮抗剂BIBP3226对NPFF2受体的表观亲和力（Ki约为100 nM）显著高于先前报道的对NPY Y2、Y4和Y5受体的亲和力（Schober等人，1998；Dumont等人，2000c；表1）。此外，我们观察到fPP及其截短类似物fPP28–36对NPFF受体具有相对较高的亲和力（Ki = 1.5–7 nM）。这可能是由于肽链C端存在Arg-Phe-酰胺残基，而非所有哺乳动物胰肽以及NPY和PYY中常见的Arg-Tyr-酰胺残基。据我们所知，目前文献中尚无关于fPP对NPY受体亚型亲和力的数据。有趣的是，我们观察到BIBP3226和fPP对CHO细胞中表达的hNPFF2受体和大鼠脊髓受体（推测为NPFF2受体亚型；Bonini等人，2000）的亲和力比对HEK 293细胞中报道的人和大鼠NPFF2受体的亲和力高10倍（Bonini等人，2000）。这种显著差异仍有待解释。接下来，我们基于hNPFF2受体转染细胞中环磷酸腺苷（cAMP）积累的测定，研究了fPP、GR231118和BIBP3226的功能特性。有趣的是，fPP和GR231118均表现出激动活性。尽管GR231118的效力比NPY Y4受体低500-1000倍（Parker等人，1998；Schober等人，1998），但其效力与NPY Y2和Y5受体处于同一数量级（Parker等人，1998）。另一方面，Y1受体拮抗剂BIBP3226在浓度高达10 μM时无活性，但它可以浓度依赖性地拮抗NPFF（10 nM）诱导的forosclin刺激的环磷酸腺苷（cAMP）生成的抑制作用。因此，BIBP3226是首个报道的NPFF2受体拮抗剂，可被视为开发更有效的NPFF2受体亚型拮抗剂的先导化合物。我们的数据表明，NPFF受体不仅在序列同源性上与NPY（尤其是Y1和Y4）受体相关，而且在结合亲和力和功能特性上也与之相关。这两个受体家族可能保留了一个祖先结合口袋，该口袋已进化为Arg-Phe-酰胺或Arg-Tyr-酰胺相互作用。这一假设需要通过详细的诱变和构效关系研究来验证。已知NPY激动剂能够刺激食欲（Dumont等人，2000c）。相比之下，目前唯一关于NPFF对摄食行为影响的报道描述了其在大鼠中降低食物摄入量的作用（Murase等人，1996）。同样，GR231118作为NPY Y4激动剂，也被发现能够降低大鼠的食物摄入量（Schober等人，1998）。这种作用是否是由于与NPFF受体亚型相互作用所致，还需要在未来的研究中加以探讨。总之，我们的研究结果描述了第一个 NPFF 受体拮抗剂 (BIBP3226)，并表明在研究 NPY 受体时，BIBP3226 和 GR231118 之间可能存在与 NPFF 受体的交叉反应。

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BIBP3226 TFA 是首个选择性非肽类 NPY Y1 受体拮抗剂（Ki 1.1 nM）。它对 NPFF 受体具有混合活性。该药物被广泛用作药理学工具，用于研究 NPY 介导的对心血管功能、食欲调节和压力/焦虑的影响。本品仅供研究用途，不得用于人体。在大鼠脑室内注射 5 μg 时观察到类似焦虑的作用。

C29H32F3N5O5

587.590097427368

587.235

C, 59.28; H, 5.49; F, 9.70; N, 11.92; O, 13.61

1068148-47-9

BIBP3226;159013-54-4

56972180

White to off-white solid powder

180

6

9

11

42

742

1

FC(C(=O)O)(F)F.O=C(C(C1C=CC=CC=1)C1C=CC=CC=1)N[C@@H](C(NCC1C=CC(=CC=1)O)=O)CCC/N=C(\N)/N

MTSZIDSCWZHKOD-GNAFDRTKSA-N

InChI=1S/C27H31N5O3.C2HF3O2/c28-27(29)30-17-7-12-23(25(34)31-18-19-13-15-22(33)16-14-19)32-26(35)24(20-8-3-1-4-9-20)21-10-5-2-6-11-21;3-2(4,5)1(6)7/h1-6,8-11,13-16,23-24,33H,7,12,17-18H2,(H,31,34)(H,32,35)(H4,28,29,30);(H,6,7)/t23-;/m1./s1

(2R)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[(2,2-diphenylacetyl)amino]-N-[(4-hydroxyphenyl)methyl]pentanamide;2,2,2-trifluoroacetic acid

BIBP-3226 TFA; BIBP 3226 TRIFLUOROACETATE; 1068148-47-9; BIBP3226 (TFA); (2R)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[(2,2-diphenylacetyl)amino]-N-[(4-hydroxyphenyl)methyl]pentanamide;2,2,2-trifluoroacetic acid; MFCD00938562; BIBP3226trifluoroacetate; BIBP3226 Trifluoroacetate; 159013-54-4 (non-salt); BIBP 3226 TFA

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 100 mg/mL (~170.19 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。